(Luận văn) nghiên cứu vai trò của e coli, salmonella và clostridium perfringens gây tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh miền núi phía bắc và biện pháp phòng trị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––– TRẦN ĐỨC HẠNH lu NGHIÊN CỨU VAI TRÕ CỦA E COLI, SALMONELLA, CLOSTRIDIUM PERFRINGENS GÂY TIÊU CHẢY Ở LỢN TẠI TỈNH MIỀN NƯI PHÍA BẮC VÀ BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ an n va tn to ie gh Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y p Mã số: 62 64 01 04 d oa nl w ll u nf va an lu LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP oi m Hướng dẫn khoa học : GS.TS Nguyễn Quang Tuyên z at nh PGS.TS Cù Hữu Phú z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN, 2013 n va ac th si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây công trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận án cảm ơn, thơng tin trích dẫn xác rõ nguồn gốc lu an va n Thái Nguyên, tháng 03 năm 2012 to p ie gh tn Tác giả nl w d oa NCS Trần Đức Hạnh ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài hồn thành luận án, tơi ln nhận giúp đỡ nhiểu tổ chức cá nhân Nhân dịp xin cảm ơn Ban Giám đốc Đại học Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Sau Đại học, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện cho theo học chương trình đào tạo nghiên cứu sinh trường Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán thuộc môn Vi sinh vật-Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường ĐHNL Thái Nguyên, Bộ Môn Vi Trùng -Viện Thú lu an Y Quốc Gia nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành n va đề tài nghiên cứu tn to Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn khoa gh học GS.TS Nguyễn Quang Tuyên - Phó Viện Trưởng Viện Khoa học Sự p ie sống thuộc ĐH Thái Nguyên PGS.TS Cù Hữu Phú - Trưởng Bộ Môn Vi Trùng - Viện Thú Y Quốc Gia trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình w d oa nl thực đề tài hoàn thành luận án an lu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo thầy cô giáo - Viện Thú Y Quốc Gia cung cấp tài liệu, ý kiến quý báu hướng dẫn cách thao tác va ll u nf số thí nghiệm quan trọng để tơi hồn thiện đề tài nghiên cứu oi m Tơi ln biết ơn gia đình, bạn bè học viên cao học, em sinh z at nh viên đóng góp cơng sức, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Thái Ngun, tháng 03 năm 2012 z m co l gm @ Tác giả NCS Trần Đức Hạnh an Lu n va ac th si iii BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN lu an n va p ie gh tn to d oa nl w an lu : Adenin : American Type Culture Collection : Brain Heart Infusion : base pair : Bình thường : Cytosin : Christie Atkins Munch Petersen : Colony Forming Unit : Cộng : Clostridium perfringens : Deoxyribonucleic Acid : deoxyribonucleotide triphosphate : Escherichia coli : Enzyme Linked Immunosorbent Assay : Enterotoxine vi khuân E.coli : Egg Yolk Agar : Food and Agriculture Organization : Guanin : Haemorrhagic bowel syndrome : kilo Dalton : Khoẻ mạnh : Lethal dose : Độc tố chịu nhiệt : microlitre : National Committee of Clinical Laboratory Standards : Odds Ratio : Ribonucleic Acid : Ribosomal Ribonucleic Acid : Polymerase Chain Reaction : Salmonella : Độc tố không chịu nhiệt : Sulfide - Indole – Motility :Thymin : Tris - Acetate – EDTA : Tris – EDTA : Tiêu chảy : Thioglycollate : Transmissible gastroenteritis : Tryptose Sulphite Cycloserine ll u nf va oi m z at nh z m co l gm @ an Lu A ATCC BHI bp BT C CAMP CFU cs Cl perfringens DNA dNTP E.coli ELISA ETEC EYA FAO G HBS kDa KM LD LT µl NCCLS OR RNA rRNA PCR S STA SIM T TAE TE TC TGC TGE TSC n va ac th si iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số nguyên nhân hiểu biết chung hội chứng tiêu chảy lợn 1.1.1 Rối loạn tiêu hóa mơi trường ngoại cảnh bất lợi 1.1.2 Rối loạn tiêu hoá thức ăn, nước uống không đảm bảo 1.1.3 Một số vi sinh vật gây tiêu chảy gia súc 1.2 Vai trò số vi khuẩn hội chứng tiêu chảy lợn lu 1.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) an 1.2.2 Vi khuẩn Salmonella spp hội chứng tiêu chảy lợn 20 n va 1.2.3 Vai trò vi khuẩn đường ruột Clostridium Perfringens (Cl Perfringens) tn to trong hội chứng tiêu chảy gia súc 28 gh 1.3 Biện pháp phòng trị hội chứng tiêu chảy lợn vi khuẩn gây 32 p ie 1.3.1 Biện pháp phòng 32 w 1.3.2 Điều trị tiêu chảy lợn 35 oa nl Chƣơng NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP d NGHIÊN CỨU 36 lu an 2.1 Nội dung nghiên cứu 36 u nf va 2.1.1 Nghiên cứu tình hình tiêu chảy lợn tỉnh miền núi phía Bắc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc 36 ll oi m 2.1.2 Phân lập, xác định loại vi khuẩn E coli, Salmonella spp z at nh Cl perfringens lợn bình thường bị tiêu chảy 36 2.1.3 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân z lập 36 @ gm 2.1.4 Nghiên cứu số biện pháp phòng trị hội chứng tiêu chảy lợn 36 l 2.2 Nguyên liệu dùng nghiên cứu 36 m co 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 36 an Lu 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 n va ac th si v 2.3.1 Phương pháp điều tra 37 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu phân lập vi khuẩn 38 2.3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh vật học vi khuẩn 38 2.3.4 Phương pháp xác định type kháng nguyên vi khuẩn phân lập 39 2.3.5 Phương pháp xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn phân lập 43 2.3.6 Phương pháp xác định khả mẫn cảm kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập 47 2.5 Phương pháp chế tạo autovacxin vơ hoạt có bổ trợ keo phèn 48 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 49 lu Chƣơng : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 an nghiên cứu 52 n va 3.1 Kết điều tra lợn hai tháng tuổi mắc tiêu chảy tỉnh gh tn to 3.1.1 Kết điều tra tỷ lệ lợn bị tiêu chảy chết lứa tuổi 53 p ie 3.2 Kết xác định số lượng vi khuẩn đường ruột lợn 56 3.2.1 Kết xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí, Salmonella spp nl w E coli lợn 55 d oa 3.2.2 Kết xác định số lượng vi khuẩn yếm khí Cl perfringens an lu lợn 59 va 3.3 Kết phân lập vi khuẩn E coli, Salmonella spp Cl perfringens u nf lợn 63 ll 3.4 Kết xác định số đặc tính sinh hố chủng vi khuẩn phân m oi lập lợn tiêu chảy 67 z at nh 3.4.1 Kết xác định số đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn z E coli 67 gm @ 3.4.2 Kết xác định số đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn l Salmonella spp 68 m co 3.4.3 Kết xác định số đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn Cl perfringens 70 an Lu 3.5 Kết xác định type chủng vi khuẩn E coli, Salmonella spp n va Cl perfringens phân lập lợn tiêu chảy 71 ac th si vi 3.5.1 Kết xác định type chủng vi khuẩn E coli 71 3.5.2 Kết xác định type chủng vi khuẩn Salmonella spp 72 3.5.3 Kết xác định type chủng vi khuẩn Cl perfringens 75 3.6 Kết xác định khả dung huyết chủng E coli phân lập lợn tiêu chảy 77 3.7 Kết xác định kháng nguyên bám dính E coli Salmonella spp phân lập từ lợn tiêu chảy 78 3.8 Kết xác định độc lực độc tố chủng vi khuẩn phân lập lợn tiêu chảy 80 lu 3.8.1 Kết xác định yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn E coli an n va phân lập 82 lợn tiêu chảy 87 gh tn to 3.8.2 Kết xác định độc lực vi khuẩn Salmonella spp phân lập p ie 3.8.3 Kết xác định độc lực vi khuẩn Cl perfringens phân lập lợn tiêu chảy 91 nl w 3.9 Kết xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi d oa khuẩn phân lập 93 an lu 3.9.1 Kết xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi va khuẩn E coli phân lập 95 u nf 3.9.2 Kết xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi ll khuẩn Salmonella spp phân lập 97 m oi 3.9.3 Kết xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi z at nh khuẩn Cl perfringens phân lập 99 z 3.10 Kết phòng điều trị hội chứng tiêu chảy lợn 98 gm @ 3.10.1 Kết đánh giá bước đầu chế tạo thử nghiệm autovacxin đa giá 100 l 3.10.2 Kết kiểm tra an toàn hiệu lực autovacxin động vật m co thí nghiệm 102 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .116 n va PHỤ LỤC an Lu TÀI LIỆU THAM KHẢO ac th si vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Tỷ lệ lợn tiêu chảy chết số địa điểm thuộc tỉnh nghiên cứu 52 Bảng 3.2: Tỷ lệ lợn mắc tiêu chảy chết qua năm 53 Bảng 3.3: Tỷ lệ lợn bị tiêu chảy lứa tuổi 54 Bảng 3.4: Tỷ lệ lợn chết tiêu chảy lứa tuổi 55 Bảng 3.5: Kết xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí, Salmonella spp E coli/ gam phân lợn 56 lu Bảng 3.6: Kết xác định số lượng vi khuẩn yếm khí Cl perfringens/ an gam phân lợn 60 va n Bảng 3.7: Tỷ lệ phân lập số vi khuẩn phân lợn 62 tn to Bảng 3.8: Tỷ lệ phân lập số vi khuẩn từ phủ tạng lợn chết ie gh tiêu chảy 65 p Bảng 3.9: Đặc tính sinh hố chủng E coli phân lập lợn w tiêu chảy 68 oa nl Bảng 3.10: Đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn Salmonella spp phân d lập lợn tiêu chảy 69 lu an Bảng 3.11: Đặc tính sinh hố chủng vi khuẩn Cl perfringens phân u nf va lập lợn tiêu chảy 70 ll Bảng 3.12: Kết quả xác đị nh serotype kháng nguyên O chủng vi m oi khuẩn E coli phân lập được 71 z at nh Bảng 3.13: Kết xác định serotype vi khuẩn Salmonella spp phân lập lợn tiêu chảy 73 z Bảng 3.14: Kết xác định type chủng vi khuẩn Cl perfringens 77 @ gm Bảng 3.15: Kết xác định khả dung huyết chủng E coli m co l phân lập lợn tiêu chảy 79 Bảng 3.16: Kết phản ứng ngưng kết trực tiếp hồng cầu chủng an Lu E coli phân lập lợn tiêu chảy 80 n va ac th si viii Bảng 3.17: Kết phản ứng ngưng kết hồng cầu chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập lợn tiêu chảy 81 Bảng 3.18: Kết xác định yếu tố gây bệnh chủng vi khuẩn E coli 83 Bảng 3.19: Kết qu ả kiểm tra độc lực số chủng E coli chuột bạch 86 Bảng 3.20: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn Salmonella spp chuột bạch 88 Bảng 3.21: Kết xác định độc tố chủng vi khuẩn Salmonella lu spp phân lập lợn tiêu chảy 90 an chuột bạch .92 n va Bảng 3.22: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủngvi khuẩn Cl perfringens gh tn to Bảng 3.23: Kết xác định độc tố đường ruột chủng vi khuẩn Cl p ie perfringens phân lập lợn tiêu chảy 94 Bảng 3.24: Kết xác định khả mẫn cảm với kháng sinh nl w chủng E coli phân lập 95 d oa Bảng 3.25: Kết xác định khả nămg mẫn cảm với kháng sinh an lu chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập 98 va Bảng 3.26: Kết xác định khả mẫn cảm với kháng sinh u nf chủng vi khuẩn Cl perfringens phân lập 99 ll Bảng 3.27: Kết kiểm tra số tiêu lô autovacxin 102 m oi Bảng 3.28: Kết thử hiệu lực autovacxin chuột nhắt trắng 104 z at nh Bảng 3.29: Kết thử an toàn lợn sau tiêm chế phẩm autovacxin 105 z Bảng 3.30: Kết khảo sát hiệu giá kháng thể lợn thí nghiệm sau @ tiêm autovacxin 107 gm l Bảng 3.31: Kết bảo hộ lợn thí nghiệm autovacxin 109 m co Bảng 3.32: Kết thử nghiệm liều số lần tiêm autovacxin cho lợn 110 Bảng 3.33: Kết thử hiệu lực autovacxin chuột nhắt trắng 113 an Lu Bảng 3.34: Kết điều trị tiêu chảy lợn .114 n va ac th si ix DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH Sơ đồ 1: Phân lập giám định E coli 40 Sơ đồ 2: Phân lập giám định Salmonella 41 Sơ đồ 3: Phân lập giám định vi khuẩn Clostridum 42 Sơ đồ 4: Quy trình sản xuất vacxin vơ hoạt bổ trợ keo phèn 50 Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ phân lập số vi khuẩn phân lợn 63 Hình 3.2 Biểu đồ phân lập số vi khuẩn từ phủ tạng lợn chết lu tiêu chảy 64 an Hình 3.3 Biểu đồ kết xác định serotype kháng nguyên O va n chủng vi khuẩn E.coli phân lập 72 gh tn to Hình 3.4 Biểu đồ kết xác định serotype vi khuẩn Sanmonella p ie phân lập lợn tiêu chảy 74 w Hình 3.5 Biểu đồ kết xác định serotype vi khuẩn Cl.perfringens oa nl phân lập lợn tiêu chảy 75 d Hình 3.6 Kết PCR xác định yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli lu va an phân lập 76 u nf Hình 3.7 Biểu đồ tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen quy định ll yếu tố gây bệnh chuột bạch 78 m oi Hình 3.8 Biểu đồ tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen quy định z at nh yếu tố gây bệnh .83 z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA lu an n va p ie gh tn to w Ảnh 1: Lợn bị tiêu chảy điển hình giai đoan 1-20 ngày d oa nl đƣợc lấy làm mẫu nghiên cứu ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 2: Mẫu máu phủ tạng đƣợc bảo quản bình đá lạnh n va ac th si lu an Ảnh 3: Mổ khám bệnh tích lợn bị bệnh Phó thƣơng hàn nhiễm Salmonella Lách sƣng to xuất huyết thâm tím điển hình n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 4, 5: Bệnh tích điển hình bệnh viêm ruột hoại tử nhiễm Cl perfringens n va ac th si lu an n va gh tn to p ie Ảnh 6: Khuẩn lạc Salmonella môi trƣờng DHL d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 7: Khuẩn lạc Salmonella môi trƣờng CHROM n va ac th si lu an n va gh tn to p ie Ảnh 8: Vi khuẩn Salmonella môi trƣờng TSI d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 9: Phản ứng lên men đƣờng vi khuẩn E coli n va ac th si Ảnh 10: Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Cl perfringens lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ Ảnh 11: Khuẩn lạc vi khuẩn E coli, Salmonella Cl perfringens an Lu môi trƣờng nuôi cấy n va ac th si lu Ảnh 12: Chuột đối chứng khỏe mạnh cịn chuột cơng cƣờng an n va độc canh trùng E coli ủ rũ chết p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ Ảnh 13, 14: Bệnh tích điển hình chuột thí nghiệm công công cƣờng độc an Lu Cl perfringens Salmonella n va ac th si lu an n va gh tn to p ie Ảnh 15: Kháng nguyên O vi khuẩn Salmonella d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 16: Kháng nguyên H vi khuẩn Salmonella n va ac th si lu an n va p ie gh tn to Ảnh 17: Kháng nguyên O chuẩn vi khuẩn E coli d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 18: Kháng nguyên chuẩn vi khuẩn E coli n va ac th si lu an n va ie gh tn to p Ảnh 19: Kháng nguyên O chuẩn vi khuẩn E coli d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 20: Kháng nguyên bám dính F chuẩn vi khuẩn E coli n va ac th si lu an n va p ie gh tn to Ảnh 21: Dụng cụ hóa chất thí nghiệm ni cấy E coli Salmonella d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Ảnh 22: Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn yếm khí Cl perfringens n va ac th si PHỤ LỤC Bảng I Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) Vịng vơ khuẩn (đƣờng kính mm) Kháng sinh lu an n va Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimthoprim-Sulphamethoxazole  10 11 - 15  16 Streptomycin  11 12 - 14  15 Gentamicin  12 13 - 17  18 Kanamycin  12 13 - 17  18 Erythromycin  12 13 - 17  18 Neomycin  12 13 - 14  15 Nofloxacin  12 13 - 14  15 Ampicillin  11 12 - 14  15  11 12 - 14  15  17 18 - 20  21 Lincospectinomycin  10 11 - 13  14 Penicillin ≤ 10 11 - 13 ≥ 14 ≤ 11 12 - 15 ≥ 16 ie gh tn to Kháng p Colistin d ll u nf va an lu Amoxycillin oa nl w Ceftiofur oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si I Phương pháp xác định yếu tố gây bệnh (độc tố yếu tố bám dính) vi khuẩn E coli phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) Các phương pháp PCR dùng để xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn thực với số cải tiến phương pháp quy trình thực phản ứng Có thể tóm tắt sau: - AND đích: Là lượng nhỏ khuẩn lạc chủng vi khuẩn cần xác định nuôi cấy đĩa thạch máu cừu, ủ tủ ấm 37 0C vòng 18 đến 24 lu an - Các chủng vi khuẩn E coli chuẩn quốc tế, dùng làm đối chứng dương n va (đã kiểm định chắn có mang gen quy định yếu tố độc lực) tn to đối chứng âm (không mang gen sinh yếu tố độc lực), bao gồm: K514/ gh pLN301 (Iss), NCCB 1395 (CvaC), BM2 - (Cnf1), 711 vir (Cnf2), FD635 p ie (eae), FD636 (Stx1), FD636 (Stx2) FD527 (đối chứng âm) - Các cặp mồi cho phản ứng PCR: Do hãng Life Technologies (Gibco, w oa nl BRL) sản xuất bảo quản nhiệt độ - 200C Thứ tự chuỗi DNA d cặp mồi trình bày bảng … ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si lu an va n Bảng phụ lục VIII: Ký hiệu chuỗi ADN cặp mồi dùng để xác định số yếu tố độc lực vi khuẩn APEC kích cỡ sản phẩm sau trình điện di tn to F1 Fimbriae (protein chính) 508 F1 Fimbriae (tiêu chuẩn bám dính) 816 Protein Intimin (bám dính xâm nhập) 328 P - Fimbriae operon 300 Điểm tiếp nhận aerobactin 821 Tổng hợp aerobactin 478 Ngưng kết hồng cầu tố mẫn cảm nhiệt độ 760 Tăng khả sống huyết 559 Gen cấu trúc protein 894 Độc tố Shiga 481 Độc tố Shiga 498 Yếu tố gây độc hoại tử tế bào loại 543 Yếu tố gây độc hoại tử tế bào loại z m o l.c gm @ an Lu n va Cnf2 z at nh Cnf1 331 oi Stx2 m CvaC Yếu tố độc lực cần xác định ll Iss fu Tsh an IucA nv IutA a lu PapC 5’- GTT GAT CAAGTT CAG - 3’ 5’- AAT AAC GCG CCT GGA ACG - 3’ 5’- TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG - 3’ 5’- GCA GTC ACC TGC CCT CCG TGG - 3’ 5’- ACG TTG CAG CAT GGG TAA CT - 3’ 5’- GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG - 3’ 5’- GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G - 3’ 5’- ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A - 3’ 5’- GGC TGG ACA TGG GAA CTG G - 3’ 5’- CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG - 3’ 5’- ATT ATG ATC CTG CCC TCT GA - 3’ 5’- ATC GCG GCT GGT AGC ACA GTA GA - 3’ 5’- AAG TCT GTC AGA CGT CTG TGT T - 3’ 5’- GGA TAG CGC TCC TTA TCC AGA T - 3’ 5’- GTG GCG AAA ACT AGT AAA ACA GC - 3’ 5’- CGC CTC GGG GTG GAT AA - 3’ 5’- TAT GAG AAC TCT GAC TCT AAA T- 3’ 5’- ATT TAT AAA CAA ACA TCA CTA A - 3’ 5’- CAG TTA ATG TGG TGG CGA AG - 3’ 5’- CTG CTA ATA GTT CTG CGC ATG - 3’ 5’- CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG - 3’ 5’- GGA TGC ATC TCT GGT CAT TG -3’ 5’- AGG AAG TTA TAT TTC CGT AGG - 3’ 5’- GTA TTT GCC TGA ACC GTA A - 3’ 5’- AAT CTA ATT AAA GAG AAC - 3’ 5’- CAT GCT TTG TAT ATC TA - 3’ d eae Kích cỡ sản phẩm (bP) Thứ tự chuỗi AND oa nl w FimH FimA Stx1 Ký hiệu primers FimA - F FimA - R FimH - F FimH - R eae - F eae - R PapC- F PapC- R IutA- F IutA- R IucA- F IucA- R Tsh- F Tsh- R Iss- F Iss- R CvaC- F CvaC- R Stx1- F Stx1- R Stx2- F Stx2- R Cnf1- F Cnf1- R Cnf2 F Cnf2 R p ie gh Gen đích ac th si - Phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng (25l) gồm 2,5 l 10 x PCR buffer (750 mM Tris-HCl (pH 8,8), 200 mM (NH 4)2SO4, 0,1% (v/v) Tween20); 2mM MgCl2; 200M dNTP loại (dATP, dCTP,dGTP and dCTP) (Life Technologies), 1l primer (3,2 M/l); 0,25 U Taq DNA polymerase (Advanced Biotechnologies), DNA chủng vi khuẩn cần kiểm tra (lấy trực tiếp từ lạc khuẩn vi khuẩn môi trường thạch máu) nước cất (Gibco, BRL) vừa đủ 25l Phản ứng PCR tiến hành máy nhân gen (Mastercycler, lu Eppendorf) theo chu trình sau: 94 0C/ phút (1 chu kỳ); 940C/ phút, an va Tm/1 phút, 720C/ phút (30 chu kỳ); 720C/ phút, Tm nhiệt độ tan n chảy thích hợp loại primer tn to gh - Điện di: Các sản phẩm HNA thu sau trinh PCR tiến hành p ie chạy điện di thạch agarose 2% (Gibco, BRL) với hiệu điện 100V w 30 phút Nhuộm với TAE có bổ sung Ethidium bromide 15 phút Các sản oa nl phẩm quan sát đèn UV (300nm), dùng hệ thống Gel Doc 2000 (Bio - d Rad) Ảnh lưu giữ lại tiến hành xử lý kết cần thiết lu va an II Phƣơng pháp xác định type chủng vi khuẩn C perfringens phân u nf lập phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ll - Các chu kỳ nhiệt phản ứng: oi m Các giai đoạn phản ứng z at nh Bảng 2.2 Các chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ nhiệt 94 Giai đoạn biến tính 94 Giai đoạn bắt cặp 50 l z Giai đoạn tiền biến tính Giai đoạn tổng hợp 72 Giai đoạn kéo dài 72 gm @ 1 40 m co an Lu n va ac th si - Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu sau chu trình phản ứng nhuộm chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1: Sau nhuộm, sản phẩm PCR chạy điện di thạch agarose 2% dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện 100V vòng 40 phút Đây cách đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp dựa nguyên lý phân tử acid nucleic mơi trường pH trung tính tích điện âm nhờ nhóm phốt phát nằm khung phosphodiester sợi nuc leic Khi đặt chúng vào điện trường, phân tử acid nucleic chuyển d ịch cực d ương Khi tiến hành phân tích thạch agarose, phân tử acid lu an nucleic tùy theo kích thước chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có n va kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh to tn - Nhuộm: Gel thạch sau chạy điện di nhuộm màu chất ie gh nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1μl/ml) vòng 15 phút p BEt loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử chui vào liê n kết nl w bazơ Vị trí cố định nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo d oa lượng huỳnh quang lớn nhiều so với phân tử BEt tự an lu - Đọc kết quả: cách quan sát ánh đèn UV (300nm) chụp ảnh va hệ thống GelDoc Trên ảnh chụp đen, đoạn axit nucleic lên ll u nf dạng băng màu trắng chụp ảnh ghi nhận lại Kích thước oi m băng DNA so sánh với ADN chuẩn (ADN marker), cho vào lúc z at nh với sản phẩm PCR giếng riêng biệt, cạnh giếng dùng phát sản phẩm PCR Nhờ thị dây chuyền mà người ta xác định độ dài z đoạn sản phẩm PCR m co l gm @ an Lu n va ac th si