Lời cảm ơn và mục lục

i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo, Các phòng chức Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Hà TS Lê Văn Sơn người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn GS.TS Lê Trần Bình, người thầy đào tạo tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn Tập thể cán Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, tạo điều kiện tốt để tơi thực hồn thành đề tài luận án Trong q trình làm luận án, tơi nhân giúp đỡ nhiệt tình tồn thể cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện tốt yên tâm học tập thực luận án Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực thành công luận án Hà Nội, ngày … tháng …… năm 2013 Nghiên cứu sinh Bùi Văn Thắng ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; - Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; - Phần kết lại luận án chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày … tháng …… năm 2013 Tác giả Bùi Văn Thắng iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nội dung nghiên cứu 4 Đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÁC ĐỘNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI ĐẾN CÂY TRỒNG 1.1.1 Tác hại hạn đến sinh trưởng phát triển trồng 1.1.2 Tác hại đất nhiễm mặn đến sinh trưởng phát triển trồng 1.1.3 Tác hại nhiệt độ cao đến sinh trưởng phát triển trồng 1.1.4 Tác hại nhiệt độ thấp đến sinh trưởng phát triển trồng 10 1.1.5 Phản ứng thực vật điều kiện mơi trường bất lợi 10 1.2 TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI CỦA THỰC VẬT 1.2.1 Cơ chế chống chịu điều kiện môi trường bất lợi 12 12 1.2.2 Cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu điều kiện mơi trường bất lợi 13 1.2.3 Vai trò proline đường sinh tổng hợp proline thực vật 16 1.2.4 Vai trò glycine betaine đường sinh tổng hợp glycine betaine sinh vật 25 1.3 CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI 28 1.3.1 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp proline chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi 28 1.3.2 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp glycine betaine tăng cường khả chống chịu điều kiện môi trường bất lợi 1.4 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ CÂY LÂM NGHIỆP CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI 31 39 iv 1.4.1 Điều kiện cấu trúc gen chuyển vào tế bào thực vật 39 1.4.2 Promoter cảm ứng rd29A 40 1.4.3 Vector chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 41 1.4.4 Các loại gen công cụ sử dụng sàng lọc thể nhận gen 43 1.4.5 Chuyển gen gián tiếp vào trồng thông qua Agrobacterium 45 1.4.6 Một số thành tựu tạo giống lâm nghiệp chuyển gen chống chịu với điều kiện bất lợi 1.5 CÂY XOAN TA VÀ CHỌN CÂY XOAN TA LÀM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN 1.5.1 Nguồn gốc, phân bố đặc điểm sinh học Xoan ta 1.5.2 Chọn Xoan ta làm đối tượng nghiên cứu chuyển gen Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 55 2.1.1 Vật liệu thực vật 55 2.1.2 Chủng vi khuẩn nguyên liệu DNA 55 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 56 2.1.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 56 2.1.5 Địa điểm thí nghiệm 57 2.2 57 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 52 53 55 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 2.2.2 Xây dựng tối ưu quy trình chuyển gen vào Xoan ta Agrobacterium 2.2.3 Phương pháp tạo Xoan ta chuyển gen mục tiêu 57 2.2.4 Phương pháp tạo thuốc chuyển gen 66 2.2.5 Phương pháp phân tích đánh giá chuyển gen 67 2.2.6 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu 74 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 75 3.1 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GEN CHO CÂY XOAN TA 75 3.1.1 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để sàng lọc Xoan ta chuyển gen 75 63 65 v 3.1.2 Xác định loại vật liệu thích hợp làm thể nhận gen 77 3.1.3 Xác định thời gian tiền nuôi cấy thể nhận gen 78 3.1.4 Xác định mật độ tế bào Agrobacterium tumefaciens (OD600nm) 79 3.1.5 Xác định thời gian nhiễm khuẩn Agrobacterium tumfaciens với thể nhận gen 80 3.1.6 Xác định thời gian đồng nuôi cấy Agrobacterium tumfaciens với thể nhận gen 80 3.1.7 Xác định chủng Agrobacterium thích hợp cho chuyển gen vào Xoan ta 81 3.2 TẠO CÂY XOAN TA CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RD29A::GUS VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER RD29A 84 3.2.1 Tạo dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A-gus 84 3.2.2 Đánh giá hoạt động promoter rd29A Xoan ta chuyển gen 85 3.3 TẠO CÁC DÒNG CÂY XOAN TA CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RD29A:: P5CSm VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN 87 3.3.1 Tạo dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSm 87 3.3.2 Đánh giá khả chịu hạn dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm 88 3.4 TẠO CÁC DÒNG THUỐC LÁ VÀ XOAN TA CHUYỂN GEN CODA VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN, HẠN 92 3.4.1 Thiết kế gen codA thích hợp với biểu thực vật 92 3.4.2 Thiết kế vector Ti-plasmid mang gen codA biến nạp vào Agrobacterium 94 3.4.3 Tạo dòng Xoan ta chuyển gen TP-codA đánh giá khả chịu mặn, hạn 112 Chương THẢO LUẬN 123 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 135 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 137 SUMMARY 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO 141 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ABA AS BAP Bt bp cDNA codA TP CNSH CTMT Cry CaMV ĐC đtg Gus GB IBA KDa kb Kin LB MS NAA nptII OD PCR P5CS P5CSm RB Rd29A TB T-DNA Ti-Plasmid Vir WT X-gluc Abscisic acid Acetosyringone 6-Benzyl amino purine Bacillus thuringiensis Base pair Sợi DNA bổ sung tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzyme mã ngược (Complementary cDNA) Choline Oxidase gene Transit peptide Công nghệ sinh học Công thức môi trường Crystal gene = Gen mã hố protein độc tố diệt trùng Cauliflower mosaic virus – Virút khảm súp lơ Đối chứng Đồng tác giả β-Glucuronidase gene = Gen mã hoá β- Glucuronidase Glycine betaine Indolyl acetic acid Kilo Dalton Kilobase Kinetin Left border = Biên trái Môi trương nuôi cấy theo Murashinge Skoog, 1962 Naphtyl acetic acid Neomycin phosphotransferase = Gen kháng kanamycin Opitical density Polymerase chaine reaction = Phản ứng chuỗi trùng hợp pyroline – – carboxylate synthetase Gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược Right border = Biên phải Responsive Dehydration promoter Trung bình Transfer – DNA = Vùng DNA plasmid chuyển thực vật Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khối u thực vật Virulence Region = Vùng gây độc có khả tạo khối u Wild type – Cây không chuyển gen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số loài trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp proline, chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi 31 Bảng 1.2 Một số loài trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp glycine betaine, tăng khả chống chịu với điều kiện mơi trường bất lợi 38 Bảng 1.3 Một số lồi rừng nghiên cứu chuyển gen 51 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi thơng số cặp mồi 58 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen TP-codA codA 59 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt gen vector 60 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen với vector pBI121 60 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 62 Bảng 2.6 Môi trường nuôi và chọn lọc Xoan ta chuyển gen 63 Bảng 2.7 Môi trường nuôi chọn lọc thuốc chuyển gen 66 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A 68 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ống 69 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ống 70 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng PCR nhân gen P5CSm từ cDNA 70 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng PCR nhân gen TP-codA codA từ cDNA 71 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến khả rễ chồi Xoan ta 77 Bảng 3.2 Ảnh hưởng loại vật liệu đến hiệu suất chuyển gen vào Xoan ta 78 viii Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian tiền nuôi cấy thể nhận gen đến hiệu suất chuyển gen 79 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mật độ khuẩn đến hiệu suất chuyển gen 79 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu suất chuyển gen 80 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy vi khuẩn với thể nhận gen 80 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chủng Agrobacterium đến hiệu suất chuyển gen 81 Bảng 3.8 Kết thí nghiệm chuyển cấu trúc rd29A-gus vào Xoan ta 85 Bảng 3.9 Kết tạo dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm 88 Bảng 3.10 Hàm lượng proline tích lũy dòng Xoan ta chuyển gen đối chứng xử lý hạn nhân tạo 90 Bảng 3.11 Kết chuyển gen TP-codA/codA vào thuốc 102 Bảng 3.12 Dòng thuốc chuyển gen TP-codA/codA rễ môi trường 200 mM NaCl 105 Bảng 3.13 Sinh trưởng dịng thuốc chuyển gen WT mơi trường xử lý NaCl nồng độ khác 107 Bảng 3.14 Nồng độ GB dịng thuốc chuyển gen WT mơi trường xử lý NaCl 110 Bảng 3.15 Tổng hợp kết chuyển gen TP-codA vào Xoan ta 112 Bảng 3.16 Khả chịu mặn của dòng Xoan ta chuyển gen TP-codA môi trường dinh dưỡng bổ sung NaCl nồng độ khác 115 Bảng 3.17 Sinh trưởng dòng Xoan ta chuyển gen WT xử lý NaCl nồng độ khác sau tháng 119 Bảng 3.18 Nồng độ GB dòng Xoan ta chuyển gen WT môi trường xử lý NaCl nồng độ khác 120 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ chế biểu gen thực vật bị tác động điều kiện mơi trường bất lợi 15 Hình 1.2 Vai trị proline thực vât 17 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp proline thực vật bậc cao 20 Hình 1.4 Cơ chế điều hịa q trình trao đổi proline thực vật 22 Hình 1.5 Hình 1.6 Sinh tổng hợp glycine betaine thực vật bậc cao Sinh tổng hợp glycine betaine E.coli 26 27 Hình 1.7 Sinh tổng hợp glycine betaine A globiformis 27 Hình 1.8 Sinh tổng hợp glycine betaine Actinopolyspora halophilia 28 Hình 1.9 Mơ hình chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens 48 Hình 1.10 Cây Xoan ta trưởng thành 52 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc đoạn T-DNA vector chuyển gen nhị thể pBI121 56 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng qt 57 Hình 2.3 Vector pBluescript II SK chứa trình tự gen codA tổng hợp nhân tạo 58 Hình 2.4 Mơ hình dòng thuốc trồng chậu đất, đặt khay nhựa để xử lý mặn 73 Hình 2.5 Mơ hình dòng Xoan ta trồng chậu đất, đ ặt khay nhựa để xử lý mặn 73 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến khả tái sinh chồi thân mầm mầm Xoan ta 75 x Hình 3.2 Đoạn thân mảnh mầm ni mơi trường có kanamycin 75 Hình 3.3 Biểu gen gus Xoan ta chuyển giai đoạn khác 82 Hình 3.4 Biểu gen gus Xoan ta chuyển a: thân; b: lá; c: hồn chỉnh 83 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 gen PCR nhân promoter rd29A từ Xoan ta chuyển Biểu hiện GUS Xoan ta chuyển gen rd29A-gus gen Hoạt tính enzyme GUS Xoan ta chuyển Các dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm 85 86 86 88 Hình 3.9 Các dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm dòng WT sau xử lý hạn 10 ngày (không tưới nước) 89 Hình 3.10 Hàm lượng proline tính lũy khoảng thời gian gây hạn nhân tạo 90 Hình 3.11 Sản phẩm RT-PCR từ mRNA dòng Xoan ta chuyển gen đối chứng 90 Hình 3.12 Biểu hình thái dòng Xoan ta chuyển gen dòng WT trước sau xử lý hạn 10 ngày 91 Hình 3.13 Trình tự gen codA tổng hợp nhân tạo (CODA-TT-NT) so sánh với tình tự gen codA gốc (AY304485) 92 Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid choline oxidase mã hóa gen codA tổng hợp nhân tạo (CODA-TT-NT) gen codA gốc (AY304485) 94 Hình 3.15 Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA codA 95 Hình 3.16 Sản phẩm cắt vector pB121 XbaI SacI 96 Hình 3.17 Sản phẩm thơi gel gen TP-codA/codA vector pBI121 mở vịng 97 Hình 3.18 Plasmid tái tổ hợp 98 xi Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA pBI121::TP-codA cắt plasmid Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân gen codA pBI121::codA cắt plasmid Hình 3.21 gen Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA vector chuyển 98 99 99 Hình 3.22 Khuẩn lạc A tumefacies LBA4404 biến nạp vector chuyển gen mọc môi trường LB bổ sung 50 mg/l kanamycin 50 mg/l rifamycin 100 Hình 3.23 Sản phẩm PCR gen TP-codA codA 101 Hình 3.24 Mảnh chuyển gen tái sinh MT có 100 mg/l kanamycin sau tuần 102 Hình 3.25 Cụm chồi tái sinh từ mảnh MT có 100 mg/l knanamycin sau tuần 103 Hình 3.26 Chồi thuốc ni mơi trường rễ có 50 mg/l knanamycin 103 Hình 3.27 Hình 3.28 gen gen Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA từ thuốc chuyển Sản phẩm PCR nhân gen codA từ thuốc chuyển 104 104 Hình 3.29 Các dịng thuốc chuyển gen TP-codA không chuyển gen mơi trường rễ có 200 mM NaCl 105 Hình 3.30 Các dịng thuốc chuyển gen codA mơi trường rễ có 200 mM NaCl 105 Hình 3.31 Mảnh thuốc tái sinh mơi trường có 200 mM NaCl 106 Hình 3.32 Các dịng thuốc chuyển gen đối chứng trồng giá thể NT1 sau 10 ngày nhà lưới (trước xử lý mặn) 107 Hình 3.33 Dịng thuốc chuyển gen (TPC-To12) đối chứng không chuyển gen (WT) sinh trưởng môi trường xử lý NaCl nồng độ khác sau tháng 108 Hình 3.34 Hình thái dịng thuốc chuyển gen (TPC-T3) đối 108 xii chứng không chuyển gen (WT) sinh trưởng môi trường xử lý 300 mM NaCl Hình 3.35 Hàm lượng Chlorophyll dịng thuốc chuyển gen đối chứng không chuyển gen (WT) môi trường xử lý NaCl nồng độ khác 109 Hình 3.36 Sản phẩm RT-PCR từ mRNA dòng thuốc chuyển gen đối chứng 109 Hình 3.37 Nồng độ glycine betaine tính lũy dòng thuốc chuyển gen đối chứng (WT) trồng điều kiện mơi trường bình thường 110 Hình 3.38 Nồng độ glycine betaine tính lũy dòng thuốc chuyển gen đối chứng (WT) trồng điều kiện môi trường xử lý NaCl nồng độ khác 111 Hình 3.39 Sinh trưởng phát triển dòng thuốc chuyển gen (TPCTo12) đối chứng (WT) trồng điều kiện môi trường xử lý NaCl sau tháng 111 Hình 3.40 Các dịng Xoan ta chuyển gen TP-codA 113 Hình 3.41 Sản phẩm PCR nhân gen TP-codA từ DNA tổng số tách chiết từ dòng Xoan ta chuyển gen khơng chuyển gen 114 Hình 3.42 Sinh trưởng dịng Xoan ta chuyển gen WT khơng chuyển gen mơi trường tái sinh có nồng độ NaCl khác 115 Hình 3.43 Các dịng Xoan ta chuyển gen phản ứng khác điều kiện xử lý hạn nhân tạo 10 ngày 116 Hình 3.44 Dịng Xoan ta chuyển gen (TX4) đối chứng (WT) sau xử lý hạn 10 ngày 117 Hình 3.45 Sự biểu hiện gen TP-codA dòng Xoan ta chuyển gen phản ứng RT-PCR 118 Hình 3.46 Nồng độ glycine bataine tính lũy dịng Xoan ta chuyển gen đối chứng sau 10 ngày xử lý hạn 118 Hình 3.47 Sinh trưởng hàm lượng Chlorophyll dòng Xoan ta chuyển gen WT xử lý NaCl nồng độ khác sau tháng 119 xiii Hình 3.48 Nồng độ GB tính lũy dòng Xoan ta chuyển gen đối chứng (WT) trồng điều kiện môi trường xử lý NaCl nồng độ khác 121 Hình 3.49 Dịng Xoan ta chuyển gen đối chứng không chuyển gen sau tháng xử lý mặn nhận tạo nồng độ NaCl khác 121 Hình 3.50 Dịng Xoan ta chuyển gen đối chứng không chuyển gen sau tháng xử lý mặn nhận tạo nồng độ NaCl khác 122