(Luận văn) ứng dụng kỹ thuật pcr phát hiện bệnh greening trên cây cam ở một số tỉnh miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƢƠNG THỊ THU Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM an lu va n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC p ie gh tn to : Chính quy : Cơng nghệ sinh học : CNSH-CNTP : 2013-2017 ad o nl w Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học tz n oi lm ul f an v an lu z om l.c gm @ THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƢƠNG THỊ THU Tên đề tài: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CAM Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM an lu va n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC p ie gh tn to ad o nl w Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K45-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2013-2017 Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng tz n oi lm ul f an v an lu z om l.c gm @ THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái Nguyên Em thực tập phịng thí nghiệm Khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên với đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh greening cam số tỉnh miền Bắc Việt Nam” để hồn thành khóa luận ngồi nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSH-CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa CNSHCNTP, thầy cô giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em hồn thành khóa luận an lu Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng kính trọng, lịng biết ơn sâu sắc tới va TS.Nguyễn Văn Duy TS.Nguyễn Tiến Dũng, người tận tình hướng dẫn em n suốt trình thực đề tài to gh tn Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè quan p ie tâm, ủng hộ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu giúp em w hồn thành tốt khóa luận Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót o nl ad Kính mong thầy giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài v an lu em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! lm ul f an Thái Nguyên, ngày 31 tháng năm 2017 tz n oi Sinh Viên Trƣơng Thị Thu z om l.c gm @ ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các lồi cam, qt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Tình hình sản xuất cam, quýt châu lục giới giai đoạn 2012 -2014 11 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam, quýt nước ta giai đoạn 2010-2015 12 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nước ta năm 2014 13 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh Greening Hung cs (1999), Hung cs (2004) [33], [34] .24 Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm 25 Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu địa phương .26 Bảng 3.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 28 Bảng 4.1: Kết đánh giá mẫu cam sành huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang 31 Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu cam sành cam chanh Bố Hạ ( Bắc Giang) .31 lu an Bảng 4.3: Kết đánh giá mẫu cam Canh cam Vinh xã Quyết Thắng, TP n va Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên 32 tn to Bảng 4.4: Nồng độ DNA tổng số mẫu tách từ mô cam thu thập 34 p ie gh Bảng 4.5: Kết phát bệnh vàng Greening mẫu cam phân tích 38 ad o nl w tz n oi lm ul f an v an lu z om l.c gm @ iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Rầy chổng cánh Diaphorina citri 15 Hình 2.2: Triệu trứng nhiễm bệnh vàng Greening có múi 16 Hình 4.1: Hình ảnh thu thập mẫu số địa phương 30 Hình 4.2: Kết tách chiết DNA tổng số .33 Hình 4.3: Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng PCR phát bệnh Greening 35 Hình 4.4: Kết kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR sử dụng nồng độ DNA khuôn khác 36 Hình 4.5: Kết điện di sản phẩm PCR mẫu giám định Greening 37 an lu n va p ie gh tn to ad o nl w tz n oi lm ul f an v an lu z om l.c gm @ iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BVTV : Bảo vệ Thực vật Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng dNTP : Nước khử ion không chứa DNase RNase EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Tổ chức Nông Lương Thế giới NN&PTNT : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid VAC : Vườn ao chuồng an lu n va p ie gh tn to ad o nl w tz n oi lm ul f an v an lu z om l.c gm @ v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .1 DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa đề tài .3 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài .3 an lu 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài 2.1 Tổng quan cam n va Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU gh tn to 2.1.1 Nguồn gốc phân loại p ie 2.1.2 Giá trị cam .5 w 2.1.3 Đặc điểm thực vật học cam 2.1.4 Yêu cầu sinh thái cam o nl ad 2.1.5 Tình hình sản xuất cam 10 v an lu 2.2 Bệnh vàng Greening có múi 14 2.2.1 Lịch sử bệnh .14 f an 2.2.2 Nguyên nhân triệu chứng bệnh .14 lm ul 2.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng Greening 17 n oi 2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh 18 tz 2.3 Cơ sở khoa học việc ứng dụng kỹ thuật PCR phát bệnh vàng Greening .19 z om l.c gm @ 2.4 Tình hình nghiên cứu phát bệnh Greening có múi .19 vi 2.4.1 Các nghiên cứu phát bệnh giới .20 2.4.2 Các nghiên cứu phát bệnh Việt Nam 22 Phần VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.1 Vật liệu thực vật .24 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm .24 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 25 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 25 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 3.3 Nội dung nghiên cứu .26 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu vật liệu 26 3.4.2 Phương pháp xác định biểu bệnh Greening 27 3.4.3 Phương pháp phát bệnh Greening có múi kỹ thuật lu an PCR 27 n va 3.4.4 Phương pháp sử lý số liệu 29 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu 30 gh tn to Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 p ie 4.2 Tách chiết DNA tổng số mẫu .32 w 4.3 Thử nghiệm phản ứng PCR phát bệnh Greening cam 35 o nl 4.4 Xác định độ nhạy phản ứng PCR phát bệnh Greening 36 ad 4.5 Kết phát bệnh Greening cam phản ứng PCR 37 v an lu Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 f an lm ul 5.2 Kiến nghị .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 tz n oi z om l.c gm @ Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây cam thuộc họ Rutaceae, nhóm ăn quan trọng sản xuất nơng nghiệp nước ta Cây cam loại trồng có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt tươi có chứa 6-12% đường, vitamin C từ 40-90mg acid hữu từ 0,4-1,2%, chất khoáng dầu thơm [4] Tất phận cam sử dụng: Lá, hoa, vỏ cung cấp tinh dầu, làm dược liệu, để ăn, để làm cảnh [44] Cam không hàng hóa đáp ứng cho tiêu thụ nội địa mà cịn mặt hàng xuất có tiềm lớn Ngoài ra, cam loại lâu năm, chóng cho thu hoạch (khoảng 2-3 năm) cho thu hoạch thời gian dài (25-30 năm) Theo ước tính, suất trung bình cam qt đạt 15-20 tấn/ha, sản phẩm có múi bán thị trường với giá dao động lu an khoảng 15.000-20.000 đồng/kg mang lại thu nhập từ 300-400 triệu đồng [4] Vì n va cam trọng đầu tư phát triển mạnh mẽ tn to Cây cam có phân bố rộng khả dễ thích nghi với nhiều mơi trường gh sống khác nhau, dễ lai tạo giống có khả thích nghi cao Trên p ie giới, cam trồng chủ yếu nước thuộc vùng nhiệt đới, nhiệt đới ôn w đới Ở Việt Nam cam trồng ba miền Bắc, Trung Nam Năm 2014, o nl diện tích đất trồng cam Việt Nam 75.600 với sản lượng đạt 736.100 ad (Theo Bộ NN & PTNT [1]) Song đa dạng khí hậu vùng trồng trọt điều v an lu kiện phát sinh nhiều loại sâu bệnh hại cam như: bệnh thối rễ, ghẻ nhám, vàng lá, nấm bồ hóng lá…đặc biệt bệnh vàng Greening Đây coi f an lm ul nhân tố gây trở ngại để phát triển cam Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam, nguyên n oi nhân ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng [8] Bệnh dòng vi tz khuẩn Gram âm gây Dịng châu có tên Candidatus liberibacter asiaticus, z dịng châu phi có tên Candidatus liberibacter africanus Các dòng vi khuẩn @ om l.c gm sống mạch libe lây truyền từ sang khác thông qua mắt ghép môi giới truyền bệnh rầy chổng cánh (Diaphorina citri) châu Á rầy cam (Trioza erytreae) châu Phi [33] Đặc điểm bệnh Greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh giai đoạn đầu thường hay nhầm lần với bệnh khác bị thiếu kẽm (Zn) [8] Đến bệnh biểu rõ ràng bị bệnh nặng biện pháp chữa trị gần vô nghĩa, nhiều biện pháp thực không mang lại hiệu Vì vậy, việc phát nhanh bệnh vàng Greening giai đoạn đầu vô quan trọng việc phòng điều trị bệnh Những nghiên cứu bước đầu bệnh Việt Nam tiến hành, xong vấn đề phòng trừ bệnh chưa tìm hiểu cách đầy đủ Hiện việc ứng dụng kỹ thuật Sinh học phân tử đại cho phép chẩn đoán bệnh có múi mang lại hiệu cao với nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, xác tốn thời gian Có thể kể đến số phương pháp như: PCR, realtime PCR, kỹ thuật lai phân tử [12] Kết thu từ nghiên cứu lu an chẩn đoán sinh học phân tử sở để sớm đưa giải pháp phòng n va tránh bệnh Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: ‘‘Ứng tn to dụng kĩ thuật PCR phát nhanh bệnh Greening cam số gh tỉnh miền Bắc Việt Nam’’ p ie 1.2 Mục tiêu đề tài w 1.2.1 Mục tiêu tổng quát o nl Chẩn đoán bệnh vàng Greening cam kỹ thuật PCR ad 1.2.2 Mục tiêu cụ thể v an lu - Thu thập nguồn vật liệu số giống cam như: Cam Bố Hạ, Cam Vinh, Cam sành số tỉnh miền Bắc Việt Nam f an lm ul - Tách chiết DNA tồng số mẫu mô cam - Thử nghiệm phản ứng PCR phát nhanh bệnh Greening mẫu cam n oi - Ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh bệnh Greening mẫu cam tz Bố Hạ (Bắc Giang), số giống cam khác cam Vinh, cam Sành, cam z Canh om l.c gm @ 30 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong khuôn khổ đề tài, sau thời gian nghiên cứu, thu thập mẫu vật liệu giám định tác nhân gây bệnh vàng Greening có múi Đề tài thu số kết sau: 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu Để tiến hành xác định bệnh Greening giống Cam, công việc tiến hành thu thập mẫu mô thực số địa phương với cam có độ tuổi khác Cam Sành năm tuổi, cam Vinh năm tuổi, cam Bố Hạ cổ, cam Canh năm tuổi Tiến hành thu mẫu có biểu mô tả có vết lốm đốm xanh vàng, gân xanh sưng, vàng, cong còi cọc (Đường Hồng Dật, 2003) [4] Sau số hình ảnh mẫu thu thập được: an lu n va p ie gh tn to ad o nl w tz n oi lm ul f an v an lu z @ om l.c gm Hình 4.1: Hình ảnh thu thập mẫu số địa phương 31 Ghi chú: A Lá cam canh (nguồn Lê Mai Nhất, 2014), B Lá cam Canh (Quyết Thắng-TP Thái Nguyên, C Lá cam sành (Hàm Yên, Tuyên Quang) D Lá cam Vinh (Quyết Thắng-TP Thái Nguyên), E F cam Bố Hạ (Yên Thế-Bắc Giang) Kết xác định biểu qua biểu bên thể bảng sau: Bảng 4.1: Kết đánh giá mẫu cam sành huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang Đối Địa điểm tƣợng Vƣờn Kết Kí hiệu Biểu mẫu đánh giá sơ Lá vàng cục - Lá vàng lốm đốm + Lá vàng , gân xanh + Lá vàng,gân xanh + Hàm Yên, Lá vàng, phiến hẹp + tỉnh Tuyên Lá vàng lốm đốm, gân xanh + Lá vàng lốm đốm + Lá nhỏ, vàng lá,gân xanh + Lá vàng cục - 10 Lá vàng lốm đốm, phiến hẹp + Cam Sành Huyện Cam an lu Quang n va Sành gh tn to p ie Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu cam sành cam chanh Bố Hạ (Bắc Giang) w Địa điểm Đối Vƣờn giá sơ 11 Lá vàng lốm đốm, gân xanh + Cam 12 Lá vàng lốm đốm + sành 13 Lá vàng cục - 14 Lá vàng, gân xanh + lm ul 15 Lá vàng lốm đốm, phiến hẹp + 16 Lá vàng cục - 17 Lá nhỏ, vàng lá,gân xanh + Lạng tz n oi Giang tỉnh Cam Bắc Giang chanh f an v an lu Yên Thế, đánh ad Huyện Biểu mẫu o nl tƣợng Kết Kí hiệu 18 Lá vàng lốm đốm + z om l.c gm @ 32 Bảng 4.3: Kết đánh giá mẫu cam Canh cam Vinh xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên Địa điểm Đối tƣợng Vƣờn Kết Kí hiệu Biểu mẫu đánh giá sơ 19 Lá vàng cục bộ, phiến hẹp + 20 Lá vàng lốm đốm + 21 Lá vàng , gân xanh + 22 Lá nhỏ, vàng lốm đốm + 23 Lá vàng lốm đốm + Thắng, 24 Lá vàng, gân xanh + TP-Thái 25 Lá vàng cục - Nguyên, 26 Lá nhỏ, vàng - tỉnh Thái 27 Lá vàng, gân xanh + Nguyên 28 Lá nhỏ, vàng lá,gân xanh + 29 Lá vàng, nhỏ, gân xanh + 30 Lá vàng cục - 31 Lá nhỏ, vàng lốm đốm + 32 Lá vàng, gân xanh + Cam Xã Quyết Vinh an lu Cam va n Canh p ie gh tn to w Chú thích: (+) Mẫu có biểu nghi nhiễm bệnh, (-) Mẫu khơng có biểu o nl 4.2 Tách chiết DNA tổng số mẫu ad Các mẫu vật liệu thu thập địa phương chuyển tới phòng thí v an lu nghiệm để tiến hành tách chiết DNA tổng số phục vụ cho công việc giám định Phương pháp tách chiết DNA tổng số tiến hành dựa phương pháp CTAB f an Saghai maroof năm [40] Có vài cải tiến để phù hợp với điều kiện nghiên lm ul cứu cụ thể phịng thí nghiệm Kết tách chiết DNA tổng số trình tz n oi bày hình 4.2 z om l.c gm @ 33 an lu Hình 4.2: Kết tách chiết DNA tổng số Ghi chú: A Cam Vinh cam Canh (Quyết Thắng-Thái Nguyên), B Cam Bố Hạ va n (Yên Thế, Lạng Giang-Bắc Giang) C Cam sành (Hàm Yên-Tuyên Quang) p ie gh tn to ad o nl w tz n oi lm ul f an v an lu z om l.c gm @ 34 Bảng 4.4: Nồng độ DNA tổng số mẫu tách từ mô cam thu thập Nồng độ Mẫu STT Nồng Tỷ số Mẫu STT DNA OD260/OD280 (ng/µl) độ Tỷ số DNA OD260/OD280 (ng/µl) 1,80 17 17 29,6 1,95 2 35,1 1,91 18 18 30,1 1,93 3 28,2 1,86 19 19 29,6 1,84 4 30,4 1,95 20 20 23,6 1,82 5 29,4 1,79 21 21 30,6 1,90 6 30,7 1,81 22 22 34,2 1,84 7 40,1 1,77 23 23 29,5 1,86 8 32,3 1,94 24 24 30,1 1,90 9 27,7 1,87 25 25 18,6 1,88 10 10 38,6 1,85 26 26 25,7 1,84 11 11 30,2 1,94 27 27 19,8 1,93 12 12 34,2 1,92 28 28 17,7 1,95 13 13 31,2 1,84 29 29 18,4 1,80 14 14 32,4 1,81 30 30 17,5 1,84 15 29,5 1,94 31 31 19,8 1,90 16 29,9 1,92 32 32 20,1 1,87 gh tn to 20,5 o nl n va p ie an lu ad 16 w 15 v an lu f an Kết điện di hình 4.4 cho thấy, đường chạy xuất lm ul băng DNA sáng, rõ nằm gần giếng gel, chứng tỏ tách chiết thành công DNA tổng số từ mẫu mơ cam thu thập Kết tính tốn 4.4 cho thấy nồng n oi độ DNA tổng tách chiết từ mẫu mơ phân tích có nồng độ dao động tz khoảng từ 17,5 đến 40,1ng/µl, tỷ số OD260/OD280 mẫu nằm khoảng z 1,77-1,95 ng/µl chứng tỏ DNA tách chiết từ mẫu có nồng độ đủ lớn đủ tinh @ om l.c gm để tiến hành thực phân tích sinh học phân tử 35 4.3 Thử nghiệm phản ứng PCR phát bệnh Greening cam Trong nghiên cứu này, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho phát bệnh Greening có múi theo nghiên cứu Hung cs năm 1999 [33] Hung cs năm 2004 [34] Do đó, để kiểm tra khả phát bệnh Greening cam, tiến hành thử nghiệm mẫu xác định nhiễm bệnh không nhiễm bệnh xác định đề tài thực trước lưu giữ Phịng Thí nghiệm khoa CNSH-CNTP Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 4.3 an lu n va p ie gh tn to Hình 4.3: Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng PCR phát w bệnh Greening Ghi chú: Đường chạy số L: thang chuẩn DNA 1kb (Thermo Scientific); đường o nl ad chạy số 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy số 2-7: nhiễm bệnh Greening; v an lu đường chạy 8-14: mẫu không nhiễm bệnh Greening Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 4.2 cho thấy, mẫu f an lm ul xác định nhiễm bệnh Greening (đường chạy số 2-7) xuất băng DNA có kích thước khoảng 226 bp phù hợp với sản phẩm khuếch đại đặc hiệu vi n oi khuẩn chứa mầm bệnh Greening mẫu xác định không nhiễm bệnh tz Greening (đường chạy số 8-14) mẫu kiểm chứng âm tính (đường chạy số 1) z không xuất băng DNA om l.c gm @ 36 Kết thử nghiệm cho thấy, cặp mồi sử dụng nghiên cứu đặc hiệu cho việc phát bệnh Greening cam phản ứng PCR 4.4 Xác định độ nhạy phản ứng PCR phát bệnh Greening Để xác định độ nhạy phản ứng PCR phát bệnh Greening cam, chúng tơi tiến hành pha lỗng DNA khuôn nồng độ DNA khác nhau, cách 10 lần sau sử dụng DNA pha lỗng để làm khuôn cho phản ứng PCR Độ nhạy xác định nồng độ DNA khuôn thấp cho phép hình thành phản PCR nhận biết mắt thường Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng nồng độ khuôn DNA khác thể hình 4.4 đây: an lu n va p ie gh tn to w Hình 4.4: Kết kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR sử dụng nồng độ o nl DNA khuôn khác ad Ghi chú: đường chạy L: thang chuẩn DNA 1Kb (Thermo Scientific); đường v an lu chạy 1: mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2-6: mẫu DNA pha loãng nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 f an Kết kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy, đường chạy số số tương lm ul ứng với nồng độ DNA pha loãng 10-3 10-4 xuất băng sản phẩm PCR có n oi kích thước khoảng 226 bp Trong nồng độ DNA thấp (đường chạy tz số 4, 6) không xuất băng DNA Trong thử nghiệm này, sử dụng mẫu số có nồng độ DNA tổng số ban đầu 30,4 ng/µl, độ pha lỗng 10-4 z nồng độ DNA khn 0,000304 ng/µl Như vậy, phản ứng PCR sử dụng cặp @ om l.c gm mồi GF-GR nghiên cứu cho phép phát mẫu nhiễm bệnh 37 Greening nồng độ DNA khuôn tách chiết từ mô cam đạt nồng độ tối thiểu 0,00340 ng/µl 4.5 Kết phát bệnh Greening cam phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, thu thập 32 mẫu cam nghi nhiễm bệnh Greening theo quan sát biểu bên gồm mẫu cam sành Tuyên Quang, mẫu cam Vinh, cam canh thu thập Thái Nguyên, cam sành cam chanh Bố Hạ thu thập Bắc Giang Các mẫu tách chiết DNA tổng số từ mô sử dụng làm khuôn để phát bệnh Greening phản ứng PCR với cặp mồi GF-GR Mẫu xác định nhiễm bệnh xuất băng DNA có kích thước khoảng 226 bp, ngược lại mẫu khơng nhiễm bệnh Greening mẫu không xuất băng DNA tương ứng Kết kiểm tra sản phẩm PCR số mẫu thể hình 4.5 an lu n va p ie gh tn to ad o nl w f an v an lu lm ul Hình 4.5: Kết điện di sản phẩm PCR mẫu giám định Greening Ghi chú: Hình A Các mẫu cam Sành Hàm Yên (Tuyên Quang), hình B Các mẫu n oi cam sành cam chanh Bố Hạ, hình C Các mẫu cam Vinh, hình D Các mẫu cam canh tz Đường chạy L: thang chuẩn DNA 1kb (Thermo Scientific), đường chạy số Mẫu z kiểm chứng âm tính Các đường chạy cịn lại mẫu kiểm tra om l.c gm @ 38 Bảng 4.5: Kết phát bệnh vàng Greening mẫu cam phân tích Địa điểm Giống Mẫu số Cam Sành Xã Phù Lưu, huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang Cam Sành an lu Cam Bố Hạ, huyện Yên Thế, Lạng Giang, tỉnh Bắc Giang Cam Sành va n Cam Chanh p ie gh tn to w Cam Vinh ad o nl Cam Canh tz n oi lm ul f an v an lu Cam Vinh cam Canh Xã Quyết Thắng -TP Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Đƣờng chạy 10 11 12 10 10 11 12 13 14 15 16 Kết + + + + + + + + + + + + + + - Tỷ lệ nhiễm 4/10 mẫu, (40%) 4/5 mẫu, (80%) 1/3 mẫu, (33.3%) 2/8 mẫu, (25%) 3/6 mẫu (50%) z Ghi chú: ( - ) mẫu âm tính ; (+) mẫu dương tính om l.c gm @ 39 Hình 4.5 A, 4.5 B, 4.5 C 4.5 D Bảng 4.4 cho thấy việc giám định bệnh thực cam Sành, cam Bố Hạ, cam Vinh, cam Canh địa phương lấy mẫu xuất kết kết dương tính với bệnh Greening Cụ thể, hình 4.5 A có 4/10 (40%) mẫu cam sành (Hàm Yên) dương tính với bệnh Greening, mẫu 2, 6, 8, 10 tương ứng với đường chạy 4, 8, 10 12; 6/10 (60%) mẫu âm tính với Greening Tương tự với hình 4.5 B có 4/5 (80%) mẫu cam sành Bố Hạ 1/3 (33,33%) mẫu cam chanh Bố Hạ dương tính với bệnh Greening Hình 4.5 C có 2/8 (25%) mẫu cam Vinh 3/6 (50%) mẫu cam Canh dương tính với bệnh Greening Như tổng số 32 mẫu cho có biểu nghi nhiễm bệnh thơng qua việc xác định biểu bệnh triệu chứng bên ngồi có 14 mẫu dương tính cịn lại 18 mẫu khơng nhiễm bệnh (âm tính) Điều chứng tỏ phương pháp xác định bệnh mắt thường có mức độ sai số cao Kỹ thuật PCR ứng dụng để giám định bệnh vàng Greening đáp ứng yêu cầu sản xuất thời điểm tương lai gần Đây kỹ thuật lu an cho phép chẩn đoán nhanh bệnh với độ xác cao Với kỹ thuật này, từ nhận n va mẫu phịng nghiệm công đoạn cuối 4-5 Đây kỹ tn to thuật ngày sử dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh vàng Greening để gh kiểm định giống trước xuất vườn xác định lây lan bệnh p ie vườn môi giới truyền bệnh w Các kết nghiên cứu đạt có tương đồng với kết công bố o nl nghiên cứu khoa học, tác giả sử dụng mồi đặc hiệu nhân đoạn 16s ad rDNA với khích thước 226 bp để giám định bệnh vàng Greening cam v an lu Châu Á Ở hình 4.5 xuất băng sản phẩm PCR có kích thước 226 bp dự kiến Điều chứng tỏ mẫu thu thập cam sành, cam Bố Hạ, cam f an lm ul Vinh cam Canh, nghi vấn bị nhiễm bệnh vàng Greening Tuy chưa có đánh giá mức độ gây hại bệnh vàng Greening có múi giám n oi định, kết thu tiền đề để giám định bệnh Greening tz trình sản xuất giống bệnh z om l.c gm @ 40 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, đưa kết luận sau: Đã thu thập 32 mẫu nghi nhiễm bệnh vàng Greening từ tỉnh Tuyên Quang, Thái Nguyên, Bắc Giang Đã tách chiết thành công DNA có nồng độ dao động khoảng từ 17,5 ng/µl đến 40,1 ng/µl, tỷ số OD260/OD280 mẫu nằm khoảng 1,77-1,95 ng/µl Đảm bảo mẫu có nồng độ đủ lớn đủ tinh để tiến hành thực phân tích sinh học phân tử Đã kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng PCR chẩn đoán bệnh Greening Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR sử dụng nồng độ DNA khuôn khác nhau, phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GF-GR nghiên cứu cho phép lu an phát mẫu nhiễm bệnh Greening nồng độ DNA khuôn tách chiết từ mô n va cam đạt nồng độ tối thiểu 0,00340 ng/µl tn to Thực phản ứng PCR phát bệnh Greening cho thấy tổng số gh 32 mẫu cho có biểu nghi nhiễm bệnh thơng qua việc xác định biểu p ie bệnh triệu chứng bên ngồi có 14 mẫu dương tính cịn lại 18 w mẫu khơng nhiễm bệnh (âm tính) o nl 5.2 Kiến nghị ad Từ nghiên cứu phát xác mẫu mang bệnh vàng cho sản xuất f an v an lu Greening từ đưa phương pháp chọn, tạo giống bệnh phục vụ thường: chiết, ghép… n oi lm ul - Với có mẫu âm tính, khơng bị bệnh tạo giống phương pháp thơng - Với có mẫu dương tính với bệnh vàng Greening tạo giống bệnh tz phương pháp vi ghép z om l.c gm @ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn (2015), Tổng diện tích ăn phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt Nguyễn Minh Châu cs (2012), “Quản lý tổng hợp bệnh vàng Greening có múi tỉnh phía Nam Việt Nam”, Bệnh virus hại thực vật Việt Nam, Tập II, Nxb Nông nghiệp, 264-277 Phạm Thị Chữ (1996), “Tuyển chọn, nhân giống bưởi Phúc Trạch suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất nội tiêu”, Tạp chí Khoa học công nghệ quản lý kinh tế, 228-229 Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kĩ thuật trồng, Nxb Lao động-Xã hội an lu Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn nhiệt đới, 1, Nxb Nông thơn Đỗ Đình Đức (1991), “Một số kết nghiên cứu tượng vân vàng n va cam quýt miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, số 6, 10-13 Hồ Chí Minh Lê Mai Nhất (2014), “Nghiên cứu bệnh vàng Greening hại ăn có p ie gh tn to Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam, Nxb Nông nghiệp TP w múi số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống”, Niên giám thống kê (2015) ad o nl Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam v an lu 10 Nguyễn Thị Minh Phương (2007), Cây ăn đặc sản kỹ thuật trồng, Nxb nông nghiệp Hà Nội f an Nguyễn Thị Minh Phương (2008), Bảo quản chế biến hoa tươi, Nxb tri thức lm ul 11 12 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hai (2008), Cơng nghệ Sinh học tập 2: Những kĩ thuật n oi PCR ứng dụng phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ tz 13 Hà Văn Thuyết Trần Quang Bình (2000), Bảo quản rau tươi bán z chế phẩm, Nxb Nông nghiệp om l.c gm @ 42 14 Hoàng Ngọc Thuận (2000), Chọn tạo trồng cam, quýt phẩm chất tốt, suất cao, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, 10-27 15 Hà Minh Trung, Ngơ Vĩnh Viễn, Vũ Đình Phú, Mai Thị Liên, Lê Mai Nhất, Nguyễn Bích Ngọc (2003), Bệnh Greening ngun nhân gây suy thối vườn có múi giải pháp khắc phục, Kỷ yếu Hội thảo Khoa học quốc gia Bảo vệ thực vật, Nxb Nông nghiệp, 1-12 16 Hà Minh Trung, Ngô vĩnh viễn, Đỗ Thành Lâm (2006), Hồn thiện cơng nghệ sản xuất có múi đặc sản (cam, quýt, bưởi) bệnh Greening bệnh virus khác tỉnh phía Bắc, Kỷ yếu Hội nghị tổng kết khoa học công nghệ nông nghiệp 2001-2005, ngày 2-3/10/2006, Nxb Nông nghiệp, 190-205 17 Trung tâm làm vườn trồng trọt, Viện Bảo vệ Thực vật (2003), Hướng dẫn sử dụng dầu khoáng phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại ăn có múi Việt Nam, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 18 Trần Thượng Tuấn (1994), Cây ăn trái Đồng Bằng Sông Cửu Long Sở Khoa lu an học Công nghệ môi trường An Giang n va 19 Trần Thế Tục (1967), Điều tra ăn quả, Nxb Nông thôn gh tn to 20 Đào Thanh Vân, Trần Như Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000), Giáo trình ăn quả, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên p ie 21 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi-Cơng nghệ sinh học chọn tạo w giống Nxb Nông nghiệp, Hà Nội o nl 22 Ngơ Vĩnh Viễn (2009), Phịng trừ bệnh huanglongbing Indonesia Việt ad Nam, Mã số dự án: CS2/2000/43, Báo cáo tổng kết dự án năm 2009 Trần Như Ý, Đào Thanh Vân, Nguyễn Thế Huấn (1998), Giáo trình ăn v an lu 23 quả, dành cho Đại học-Nxb Nông nghiệp, Hà Nội lm ul 24 f an II Tiếng Anh Aubert, B (ed) (1987), “Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin n oi disease”, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987 tz 25 Aubert B., Garnier M, Cassin J.C, Bertin Y (1988), “Citrus Greening disease z survey in East and West African countries South of Sahara”, Proceeding of @ om l.c gm 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside, 231-237 43 26 Bové J.M, P Bonnet, M Garnier and B Aubert (1980), “Pennicilin and tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with Greening” In proc th conf IOCV, IOCV, Riverside, 91-102 27 Bové J.M, Garnier M (1984), “Citrus Greening and psylla vectors of the disease in the Arabian peninsula”, In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside, 109-114 28 Bové J.M, Garnier M., Ahlawat Y.S, Chakraborty N.K, Varma A (1993), “Detection of the Asian strains of the Greening BLO by DNA-DNA hybridisation in Indian orchard trees and Malaysian Diaphorina citri psyllids”, Proceedings of 12th Conference IOCV, IOCV, Riverside, 258-263 29 Brlansky R.H and Rogers M.E (2007), “Citrus Huanglongbing: Understanding the Vector-Pothogen Interaction for Disease Mangament”, Citrus Research and Education Center, University of Florida-IFAS.FASTAT/FAO Statistics- lu an năm 2015 n va 30 FASTAT/FAO Statistics-năm 2015, Agricultural data gh tn to 31 diseases”, Ananals of Microbiology, 169-179 Hung T.H., H.L Wu and H.J Su (1999), “Detection of fastidious bacteria p ie 32 Garnier M., Daniel N and Bové J.M (1984), “An etiology of citrus Greening w causing citrus Greening disease by nonradioactive DNA probes”, Ann Hung T.H, Wu.H.L and Su H.J (1999), “Development of a rapid method for ad 33 o nl Phytopathol Soc.Jpn, 65, 14-146 v an lu the diagnosis of citrus Greening disease usingthe polymerase chain reaction”, Journal of Phytopathology, 147, 599-604 f an Hung T.H, Hung S.C, Chen S.N, Hsu M.H and Su H.J (2004), “Detection by lm ul 34 PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of n oi huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen tz relationships”, Plant pathology, 53, 96-102 z om l.c gm @ 44 35 Huang A.L (1987), “Electronmicroscospical Studies on the Morpholohy and Population Dynamic of Fastidious Bacteria Causing Citrus Likubin”, In H.J.Su (Advisor), ph.D Thesis NTU, 148 36 Jagoueix S., Bové J.M, Garnier M (1997), “Comparison of the 16S/23S Ribosomal Intergenic Regions of (Candidatus Liberobacter asiaticum) and (Candidatus Liberobacter africanum), the two species associated with citrus huanglongbing (Greening) disease”, International Journal of Systematic Bacteriology, 47, 224-227 37 Kim J.S, Sagaram U.S, Burns J.K, Li J.L, and Wang N (2008), “Response of Sweet Orange (Citrus sinensis) to (Candidatus Liberibacter asiaticus) Infection: Microscopy and Microarray Analyses”, Phytopathology, 99, 50-57 38 Reuther W (1973), Climate and citrus behaviour in the citrus industry, 3, University of California 39 Reuther Walter (1978), The citrus industry, 1, Puplication of University of lu an California, USD n va 40 Su H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), “Detection of the gh tn to fastidious bacteria causing” The Asia citrus Greening by DNA probes, In Su H.J (2008), “Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for p ie 41 Proc 12th Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466 w citrus Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural o nl Biotechnology”, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural ad Research Institutions, Bangkok, 51 v an lu 42 Tatineni S., Sagaram U.S, Gowda S., Robertson C.J, Dawson W.O, Iwanami.T, Wang N (2008), “In planta Distribution of „Candidatus f an lm ul Liberibacter asiaticus‟ as Revealed by Polymerase Chaine Reaction (PCR) and Real-Time PCR”, Phytophatology, 85, 592-598 n oi 43 Wakana A Kira (1998), The citrus production in the worl, Tokyo, Janpan tz 44 Weiburg W.G, Barns S.M, Pelletier D.A, Lane D.J (1991), “16S ribosomal DNA z amplification for phylogenetic study”, Journal of Bacteriology, 173, 697-703 om l.c gm @