(Luận văn) ứng dụng chế tạo, thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi do vi khuẩn actinobacillus pleuropneumoniae, pasteurella multocida và streptococcus suis

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––– lu an va n t to ng hi ep HOÀNG VĂN MINH nl w d oa ỨNG DỤNG CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM VACCINE ĐA GIÁ NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY Ở LỢN TẠI TỈNH BẮC GIANG oi lm ul nf va an lu at nh z z @ m co l gm LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––– lu an va n t to ng hi ep HOÀNG VĂN MINH d oa nl w ỨNG DỤNG CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM VACCINE ĐA GIÁ NHŨ DẦU PHÒNG BỆNH VIÊM PHỔI DO VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA VÀ STREPTOCOCCUS SUIS GÂY Ở LỢN TẠI TỈNH BẮC GIANG ul nf va an lu lm Chuyên ngành: Thú y oi Mã số: 60.64.01.01 at nh z z m co l gm @ LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn Các thơng tin, tài liệu trình bày luận văn ghi rõ nguồn gốc lu an va Thái Nguyên, ngày tháng 11 năm 2017 n t to Tác giả ng hi ep d oa nl w Hoàng Văn Minh oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ ii LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập nghiên cứu, đến tơi hồn thành chương trình khố học với luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Thú y đề tài “Ứng dụng chế tạo, thử nghiệm vaccine đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi vi khuẩn lu Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida Streptococcus suis an gây lợn tỉnh Bắc Giang” va n Để hồn thành khố học cơng trình nghiên cứu này, nhận dạy t to bảo tận tình định hướng giảng viên hướng dẫn GS.TS Nguyễn Quang ng hi Tuyên; Sự quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi tập thể giảng ep viên khoa Chăn ni Thú y, Phịng quản lý Sau đại học - Trường Đại học Nông nl w lâm Thái Nguyên; Công ty Cổ phần thuốc thú y Đức Hạnh (Marphavet); Ban d oa lãnh đạo tập thể Chi cục Chăn nuôi Thú y tỉnh Bắc Giang va giúp đỡ tận tình, quý báu an lu Nhân dịp cho phép tơi trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ul nf Tơi xin trân trọng bày tỏ lịng biết ơn hội đồng chấm luận văn giúp đỡ lm cho phép bảo vệ luận văn oi Tôi xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, người thân gia đình at nh động viên, tạo điều kiện thời gian, vật chất tinh thần để tơi hồn z thành tốt khố học z gm @ tháng Hồng Văn Minh m co Tác giả năm 2017 l Thái Nguyên, ngày iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii lu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi an DANH MỤC CÁC BẢNG vii va n DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .ix t to MỞ ĐẦU ng hi Tính cấp thiết đề tài ep Mục tiêu đề tài nl w Ý nghĩa khoa học thực tế d oa Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU an lu 1.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae bệnh viêm phổi lợn va 1.1.1 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae ul nf 1.1.2 Bệnh viêm phổi - màng phổi lợn A pleuropneumoniae 10 lm 1.2 Vi khuẩn P multocida bệnh viêm phổi lợn P multocida gây 13 oi 1.2.1 Vi khuẩn P multocida 13 at nh 1.2.2 Bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn P mutocida 17 z 1.3 Vi khuẩn S suis bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn S suis gây 20 z @ gm 1.3.1 Vi khuẩn S suis 20 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP m co l 1.3.2 Bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn S suis gây 24 NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .28 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 28 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 28 2.2 Nội dung nghiên cứu .28 iv 2.3 Nguyên vật liệu .28 2.3.1 Mơi trường, hóa chất dùng nghiên cứu chế tạo vaccine đa giá nhũ dầu phòng viêm phổi lợn 28 2.3.2 Động vật thí nghiệm 29 2.3.3 Máy móc, dụng cụ thí nghiệm 29 lu 2.4 Phương pháp nghiên cứu .29 an 2.4.1 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 29 va n 2.4.2 Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn 29 t to 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch độ dài miễn dịch ng hi đàn lợn sau tiêm phòng vaccin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn ep vi khuẩn A pleuropneumoniae; P multocida S suis 31 nl w 2.5 Phương pháp xử lý số liệu .32 d oa 2.5.1 Các phương pháp đo lường dịch tễ 32 an lu 2.5.2 Phương pháp xử lý số liệu 32 va Chương 3: KẾT QUẢ GHIÊN CỨU 33 ul nf 3.1 Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, lm P multocida S suis phân lập được; chọn chủng vi khuẩn chế tạo oi vaccine thử nghiệm .33 at nh 3.1.1 Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae z phân lập .33 z @ gm 3.1.2 Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn P multocida l phân lập 35 m co 3.1.3 Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn S suis phân lập 37 3.2 Kết chế tạo vaccine thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn .38 3.2.1 Chọn giống vi khuẩn chế tạo vaccine thử nghiệm .38 3.2.2 Kết chế tạo vaccine thử nghiệm phòng viêm phổi cho lợn 39 3.3 Kết xác định độ dài miễn dịch hiệu lực vaccine thử nghiệm lợn nuôi tỉnh Bắc Giang 51 3.3.1 Kết xác định độ dài miễn dịch vaccine thử nghiệm 51 v 3.3.2 Kết xác định hiệu lực vaccine thử nghiệm lợn nuôi tỉnh Bắc Giang .62 KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 75 lu an va n t to ng hi ep d oa nl w oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU lu an va n t to ng hi ep Acid Deoxyribonucleic Agargel Immuno Diffuse Actinobaccillus pleuroneumoniae Apx - Toxins Brain Heart Infusion Base pair Chiristie - Atkinson - Munch - Peterson Colony Forming Unit Capsule polysaccharide Cộng Dermanecrotic toxin Enzyme - linked Immuno sorbant assay Haemophilus pleuropneumoniae Acid hippuric Hiệu lực tiêm phòng Indirect Haemagglutination test Lypopolysaccaride Lethal dose Methyl red Nicotinamide Adenine Dinucleotide Outer membrane proteins Phosphat buffer solution Polymerase Chain Reaction Pleuropneumonia - like organism Pasteurella multocida Relative Risk Staphylococcus aureus Streptococcus suis Tryptone Yeast Extract Broth Tryptic Soya Agar Tryptone soya broth Voges Prokauer Yeast Extract nl w : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : d oa oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ ADN AGID A pleuropneumoniae Apx BHI Bp CAMP CFU CPS Cs DNT ELISA H pleuropneumoniae HIP HLTP IHA LPS LD MR NAD OMPs PBS PCR PPLO P multocida RR Sta aureus S suis TYE TSA TSB VP YE vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập .34 Bảng 3.2: Kết kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn P multocida lu phân lập 36 an Bảng 3.3: Kết kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn S suis phân lập 37 va n Bảng 3.4: Các chủng vi khuẩn chọn để chế tạo vaccine thử nghiệm 39 t to Bảng 3.5: Kết đếm số lượng vi khuẩn có canh trùng chế tạo ng hi vaccine thử nghiệm .40 ep Bảng 3.6: Kết kiểm tra khiết lô canh trùng sử dụng chế tạo nl w vaccine thử nghiệm .42 oa Bảng 3.7: Kết kiểm tra vô trùng lô vaccine chế tạo thử nghiệm 43 d Bảng 3.8: Kết kiểm tra an toàn vaccine thử nghiệm chuột bạch .44 lu va an Bảng 3.9: Kết xác định hiệu lực vaccine thử nghiệm chuột bạch ul nf công cường độc vi khuẩn A pleuropneumoniae 45 lm Bảng 3.10: Kết xác định hiệu lực vaccine thử nghiệm chuột oi bạch công cường độc vi khuẩn P multocida .46 at nh Bảng 3.11: Kết xác định hiệu lực vaccine thử nghiệm chuột z bạch công cường độc vi khuẩn S suis serotype 47 z gm @ Bảng 3.12: Kết xác định hiệu lực vaccine thử nghiệm lợn l phương pháp công cường độc .50 m co Bảng 3.13: Kết xác định hiệu giá kháng thể có máu lợn tiêm Vaccine thử nghiệm sau tháng .53 Bảng 3.14: Kết xác định hiệu giá kháng thể có máu lợn tiêm Vaccine thử nghiệm sau hai tháng 54 Bảng 3.15: Kết xác định hiệu giá kháng thể máu lợn thí nghiệm tiêm vaccine thử nghiệm sau ba tháng .56 viii Bảng 3.16: Kết xác định hiệu giá kháng thể máu lợn thí nghiệm tiêm Vaccine thử nghiệm sau bốn tháng 58 Bảng 3.17: Kết xác định hiệu giá kháng thể máu lợn thí nghiệm tiêm Vaccine thử nghiệm sau năm tháng 60 Bảng 3.18: Kết xác định tỷ lệ lợn mắc viêm phổi vùng tiêm vùng lu không tiêm Vaccine thử nghiệm 62 an Bảng 3.19: Nguy lợn mắc viêm phổi không tiêm Vaccine thử nghiệm va n so sánh nhóm lợn tiêm nhóm lợn khơng tiêm .63 t to ng hi ep d oa nl w oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “Xác định số vi khuẩn kế phát gây chết lợn vùng dịch lợn Tai xanh huyện Văn Lâm tỉnh Hưng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr 56- 64 Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Ngân, Phan Hồng Phúc (2007), “Tình hình an nhiễm Actinobacillus pleuropneumoniae bệnh viêm phổi màng phổi lu va lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14(2), tr 36-39 n Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Hà, Lê Bá Hiệp (2010), t to ng “Khảo sát lưu hành vi khuẩn Pasteurella multocida gia súc số tỉnh hi Lê Văn Dương (2013), “Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn w ep miền núi phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 17(2), tr 53- 57 oa nl Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus d suis gây viêm phổi Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn nf Nguyễn Thị Thu Hằng (2010), Nghiên cứu số đặc tính sinh học tính lm ul va Nguyên, tr 82- 116 an lu Bắc Giang, biện pháp phòng trị” Luận án tiến sỹ thú y, Đại học Thái oi sinh miễn dịch Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập từ lợn làm Quốc gia, Hà Nội, tr 115-116 z Trịnh Quang Hiệp, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn (2004), z at nh sở cho việc chế tạo vaccine Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Thú y @ gm “Xác định đặc tính sinh vật hố học, độc lực vi khuẩn Actinobacillus, học-công nghệ Bộ Nông nghiệp PTNT (4), tr 476-477 m co l Pasteurella Streptocococcus gây bệnh viêm phổi lợn”, Tạp chí khoa Phạm Sỹ Lăng, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Hoàng Văn Năm, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Quốc Doanh, Phạm Ngọc Đính, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Thị Kim Oanh, Nguyễn Hữu Hưng, Phan Văn Long, Phan Quí Minh, Đỗ Hữu Dũng, Nguyễn Tùng, Trần Đức Hạnh (2012), Bệnh truyền lây từ động vật sang người, Nxb Nông nghiệp, tr 168-178 68 Khương Thị Bích Ngọc (1996), Bệnh cầu khuẩn số sở chăn nuôi lợn tập trung biện pháp phịng trị, Luận án PTS khoa học Nơng nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội Trịnh Phú Ngọc, Lê Văn Tạo, Nguyễn Ngọc Nhiên (1999), “Một số tính chất vi khuẩn học chủng Streptococcus phân lập từ lợn tỉnh lu an phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, (2), tr 47-49 va 10 Trịnh Phú Ngọc (2002), Nghiên cứu số đặc tính sinh vật độc lực n vi khuẩn Streptococcus gây bệnh lợn số tỉnh, Luận án tiến sĩ Nông t to ng nghiệp, Viện Thú y Quốc gia, Hà Nội hi 11 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Thu Hằng, Âu Xuân Tuấn, ep Nguyễn Bích Thuỷ, Vũ Ngọc Quý, Phạm Bảo Ngọc (2005), “Xác định nl w nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp lợn nuôi số tỉnh phía d oa Bắc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 12(4), tr 23-32 an lu 12 Cù Hữu Phú (2011), Nghiên cứu mối liên quan Hội chứng rối loạn hô va hấp sinh sản lợn với vi khuẩn gây bệnh kế phát xác định biện pháp ul nf phòng, trị bệnh, Báo cáo khoa học Viện Thú y Quốc gia 2011 lm 13 Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ Đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, Đặng Thế Huynh oi (1979), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, Nxb Nông thôn, Hà Nội at nh 14 Lê Văn Tạo (2007), Một số bệnh truyền nhiễm thường gặp lợn biện pháp z phòng trị, Nxb Lao động - Xã hội, tr 7-15; 68 - 89 z gm @ 15 Đỗ Ngọc Thuý, Lê Thị Minh Hằng, Constance Schutz, Ngơ Thị Hoa, Trần l Đình Trúc, Cù Hữu Phú, Trần Việt Dũng Kiên, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn m co Xuân Huyên, Trần Thị Thanh Xuân (2009), “Một số đặc tính chủng vi khuẩn Streptococcus suis lưu hành lợn miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 16(3), tr 24-28 16 Tiêu chuẩn Việt Nam 8669 (2011), Tiêu chuẩn kiểm nghiệm vaccine, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I 69 17 Đỗ Quốc Tuấn, Nguyễn Quang Tuyên (2007), “Kết kiểm tra độc lực tính mẫn cảm kháng sinh Pasteurella multocida phân lập từ lợn khu vực miền núi phía bắc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14(6), tr 46-51 18 Nguyễn Quang Tuyên, Đỗ Quốc Tuấn (2007), “Kết phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida lợn khu vực miền núi phía bắc”, Tạp chí Nông lu nghiệp phát triển Nông thôn, (15), tr 45- 47 an Tiếng Anh va n 19 Archambault M., Rioux S., Jacques M (1999), Evaluation of the t to hemoglobine binding activity of Actinobacillus pleuropneumoniae using ng hi fluorescein labeled pig hemoglobin and flow cytometry FEMS Microbiol ep Lett; 173:17-25 nl w 20 Bergey (1974), Manual of determinative bacteriology 8th Buchanan R.E and d oa Gibbsons N.E Co - editors, Saltimore, the Williams anh Wiking Company lu 21 Bertram T A (1986), Intravascular macrophages in lungs of pigs infected va an with Haemophilus pleuropneumoniae Vet Pathol 23: 681-691 ul nf 22 Blackall P J., Klaasen H B L M., van den Bosch H., Kuhnert P., Frey J serovar 15, Vet Microbiol (84) 47-52 oi lm (2002), Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: at nh 23 Carter G.R (1984), Pasteuralla Yersinia and Franciella page: 111-121 in z Diagnostic procedures in veterinary bacteriology and Mycology 4th ed z @ (Carter G.R, ed), Charles C, Thomas Publisher, Springfield l gm 24 Chang Y F., Shi J R., Ma D P., Shin S J., Lein D H (1993), Molercular analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX Toxin-III gene m co cluster DNA Cell Biol 12: 351-362 25 Cho W S., Chae C (2001), Expression of the apx IV Gene in Pigs Naturally Infected with Actinobacillus pleupneumoniae, J Comp Path 125, p 34 - 40 26 Chung J Y., Wilkie I., Boyce J D., Townsend K M., Frost A J., Ghoddusi M., Adler B (2001), “Role of capsule in the pathogenesis of fowl cholera caused by Pasteurella multocida serogroup A”, Infect Immin, 69(4), pp 2487 - 2492 70 27 Chung J W., Ng- Thow- Hing C., Budman L I., Gibbs B F., Nash J H., Jacques M., Coulton J W (2007), Outer membrane proteome of Actinobacillus pleuropneumoniae: LC-MS/MS analyses validate in silico predictions Proteomics Jun; 7(11): 1854-1865 139, pp 1-5 28 Devenish J., Rosendal S., Bosse J T., Wilkie B N., Johnson R (1990), Prevalence of seroreactors to the 104-kilodalton hemolysin of lu an Actinobacillus pleuropneumoniae in swine herds, J Clin Microbiol va 28:789-791 n t to 29 Diallo I S., Frost A J., Spradbrow P B (1995), “Molecular studies on avian Diarra M S., Dolence J A., Dolence E K., Darwish I., Miller M J., hi F., Jacques M Malouin ep 30 ng stranins of Pasteurella multocida in Australia”, Vet Microbiol, pp 335 - 342 (1996), Growth of Actinobacillus nl w pleuropneumoniae is promoted by exogenous hydroxamate and catechol d oa siderophores, Appl Environ Microbiol; 62:853-859 an lu 31 Enright M R., Alexander T J L., Clifton-Hadley E A (1987), Role of va houseflies (Musca domestica) in the epidemiology of Streptococcus suis ul nf type 2, Vet Rec, No 121, pp 132-133 lm 32 Fedorka-Cray P J., Hoffman L., Cray W C., Gray J T., Breish S A., oi Anderson G A (1993), Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae at nh Part I History, epidemiology, serotyping, and treatment Compend Contin z Ed Practic Vet 15:1447-1455 z l gm Assoc 204:1334-1340 @ 33 Fenwick B., Henry S (1994), Porcine pleuropneumonia J Am Vet Med 34 Frey J., Nicolet J (1988), Purification and partial characterization of a m co hemolysin produced by Actinobacillus pleuropneumoniae type strain 4074 FEMS Microbiol Lett 55:41-46 35 Frey J., Nicolet J (1990), Hemolysin patterns of Actinobacillus pleuropneumoniae J.Clin Microbiol 28:232-236 36 Frey J., Bosse J T (1993), Actinobacillus pleupneumoniae RTX toxins: Uniform designation of haemolysins, cytolysins pleurotocin and their genes, J Gen Microbiol 139, p 1723 - 1728 71 37 Frey J., Kuhn R., Nicolet J (1994), Association of the CAMP phenomenon in Actinobacillus pleuropneumoniae with the RTX toxins ApxI, ApxII and ApxIII FEMS Microbiol Lett 124 245-251 38 Gerlach G F., Klashinsky S., Anderson C., Potter A A., Willson P J (1992), Characterization of two genes encoding distinct transferring lu binding proteins in different Actinobacillus pleuropneumoniae isolates an Infect Immun;60: 3253-3261 va n 39 Gonzalez G C., Yu R H., Rosteck P R J R., Schryvers A B (1995), t to Sequence, genetic analysis and expression of transferrin receptor genes ng hi Microbiology (Reading) 141: 2405-2416 ep 40 Gottschalk M., Higgins R., Jacques M., Mittal K R., Henrichsen J (1989), nl w Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis, J Clin d oa Microbiol, No 2, pp 2633- 2635 an lu 41 Gottschalk M., Lebrun A., Wisselink H., Dubreuil J D., Smith H., Vecht U va (1998), Production of virulence-related proteins by Canadian strains of ul nf Streptococcus suis capsular type 2, Can J Vet Res, No 62, pp 75-79 lm 42 Higgins R., Gottschalk M (2002), Streptococcal diseases Diseases of oi swine, pp 563-573 at nh 43 Hunt M L., Adler B., Townsend K M (2000), “The molecular biology for z Pasteurella multocida”, Vet Microbiology 72 (1), pp - 25 z @ gm 44 Jacobsen M J., Nielsen J P., Nielsen R (1996), Comparison of virulence l of different A pleuropneumoniae serotypes and biotypes using an aerosol m co infection model Veterinary Microbiology 49: 159-168 45 Jacques M (2004), Surface polysaccharides and iron-uptake systems of Actinobacillus pleuropneumoniae The Canadian Journal of Veterinary Research 68:81-85 46 Jensen A E., Bertram T A (1986), Morphological and biochemical comparison of virulent and avirulent isolates of pleuropneumoniae serotype Infect Immun 51:419-424 Haemophilus 72 47 Jansen R., Briaire J., Kamp E M., Gielkens A., Smits M A (1993), Structure analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin-I (ApxI) operon Infect Immun 61: 3688-3695 48 Jones J E T (1981), Experimental streptococcal endorcaditis in the pigs: the development of lessions to 14 days after inoculation J Com Pathol, No 91, pp lu 51- 62 an 49 Kamp E M., Vermeulen T M., Smits M A., Haagsma J (1994), Production va n of Apx toxins by field strains of A pleuropneumoniae and Actinobacillus suis t to Infect Immun 62: 4063-4065 ng hi 50 Kilian M (1976), A taxonomic study of the genus Haemophilus, with the ep proposal of a new species J Gen Microbiol 9-62 of copper-zinc superoxidase dismutase from d oa characterisation nl w 51 Langford P R., Loynds B M., Kroll J S (1996), Cloning and molecular an lu Actinobacillus pleuropneumoniae Inf and Imm 64: 5035-5041 ul nf Assoc Swine Pract pp 9-12 va 52 Leman A D (1992), The decision to repopulate In Proceedings Am oi lm 53 Liu J., Chen X., Tan C., Guo Y., Chen Y., Fu S., Bei W., Chen H (2009), In vivo induced RTX toxin ApxIVA is essential for the full virulence of Actinobacillus at nh pleuropneumoniae Vet Microbiol 2009 Jun 12;137(3-4):282-289 z 54 Macdonald J., Rycroft A N (1992), Molecular cloning and expression of z @ gm ptxA, the gene encoding the 120-kilodalton cytotoxin of Actinobacillus l pleuropneumoniae serotype Infection and Immunity 60: 2726- 2732 m co 55 Macdonald J., Rycroft A N (1993), Actinobacillus pleuropneumoniae haemolysin II is secreted from Escherichia coli by Actinobacillus pleuropneumoniae pleurotoxin secretion gene products FEMS Microbiol Lett 109, 317-322 56 MacInnes J I., Rosendal S (1988), Prevention and control of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae infection in swine: A review Can Vet J 572-573 73 57 Michael L P., Barbara J M., Vivek K (2002), “Transcriptinal response of Pasteurella multocida to nutrient limitation”, Journal of bacteriology, 184(13), pp 3734-3739 58 Nicolet J., Schifferli D (1982), In vitro susceptibility of HaemophilusPleuropneumoniae to antimirobial substances Porc Int Congr Pig Vet Soc 7:71 lu 59 Nicolet J (1992), Actinobacillus pleuropneumoniae: In Leman AD, Straw an va B, Mengeling WL, D’Allaire S, Taylor DJ (ed.): Diseases of swine Iowa n State University Press, Ames, pp 401-408 t to ng 60 Nielsen R., Adresen L O., Plambeck T., Nielsen J P., Krarup L T., Jorsal S V hi (1997), Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype ep strains isolated from pigs in two Danish herds Vet Microbiol 54, 35 - 46 oa nl w 61 OIE (2004), Manual of diagnostic testes and vaccines for terrestrial d amimals 5th edition Chapter 2.711: Eowl cholera an lu 62 Peter E., Marth J., Carolyn J H (1996), “A miminal medium for growth of nf va Pasteurella multocida”, FEMS microbiology letters, 140 (2-3), pp 165 - 169 lm ul 63 Pijoan C (1996), Bacterial respiratory pathogens: What is their impact? In Proc 4th Annu Swine Dis Conf Swine Pract, pp 45- 47 oi z Ames: Iowa State Univ Press at nh 64 Prescott J F., Baggot J D (1993), Antimicrobial Therapy in Medicine z 65 Rayamajhi N., Shin S J., Kang S G., Lee D Y., Ahn J M., Yoo H S @ l gm (2005), Development and use of a multiplex polymerase chain reaction assay based on Apx toxin genes for genotypeing of Actinobacillus m co pleuropneumoniae isolates J Vet Diagn Invest Jul;17(4): 359-62 66 Reams R Y., Glickman L T., Harrington D D., Thacker H L., Bowersock T L (1994), Streptococcus suis infection in swine: A retrospective study of 256 cases Part II Clinical signs, gross and microcopic lessions, and coexisting microorganisms, J Vet Diagn Invest, No 6, pp 326- 334 74 67 Rimler R B., Rhoades K R (1987), Serogroup F, a new capsule serogroup of Pasteurella multocida, Journal of Clinical microbiology 25, pp 615 - 618 68 Rycroft A N., Williams D., Cullen J M., MacDonald J (1991a), The cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae (pleurotoxin) is distinct from the hemolysin and is associated with a 120 kDa polypeptide J Gen lu Microbiol 137: 561- 568 an va 69 Shivachandra S K (2006), “Identification of avian strains of Pasteurella n multocida in India by conventional anh PCR assays”, Vet Journal, 172 (3), t to ng pp 561 - 565 hi 70 Ward C K., Inzana T J (1997), Identification and characterization of a ep DNA region involved in the export of capsular polysaccharide by A nl w pleuropneumoniae serotype 5a Infect and Immun 65: 2491-2496 d oa 71 Wu J R., Shienh H K., Gong S R., Chang P C (2003), “Molecular an lu charaterization of plastmis with antimicrobial resistant genes in avian oi lm ul nf va isolates of Pasteurella multocida”, Avian diseases, 47 (4), pp 138-142 at nh z z m co l gm @ 75 PHỤ LỤC Giống vi khuẩn Thạch máu, thạch PPLO lu an va Giống nhỏ n t to Kiểm tra khiết ng Giống sản xuất hi ep Kiểm tra khiết nl w Lên men sục khí d oa Đếm số kiểm tra khiết an lu Vô hoạt formol 0,5% nf va Kiểm tra vô trùng at nh Ra chai, dán nhãn oi lm ul Bổ sung nhũ dầu ISA 50% z z Kiểm tra an toàn Kiểm tra hiệu lực m co Kiểm tra vô trùng l gm @ Thành phẩm Hình 2.1: Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt bổ trợ nhũ dầu (Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia) 76 PHỤ LỤC Các phương pháp đo lường dịch tễ Số sống - Tỷ lệ % khỏi bệnh = × 100 Tổng số điều trị lu an Số sống va - Tỷ lệ % bảo hộ = × 100 n Tổng số thí nghiệm t to ng hi - Cơng thức tính hiệu lực tiêm phịng ep a−b × 100 a oa nl Trong đó: w HLTP = d HLTP: Hiệu lực tiêm phòng lu nf va b tỷ lệ % vùng tiêm phòng an a tỷ lệ % vùng khơng tiêm phịng lm ul - Cơng thức tính χ2 để so sánh tần suất bệnh: oi n  n a.d − b.c −  2  χ2 = (a + b ) × (c + d ) × (a + c ) × (b + d ) at nh z z Áp dụng công thức: gm @ (Công thức áp dụng nghiên cứu dịch tễ) m co giá trị χ2 với mức α = 0,05; 0,01 0,001 l Tra bảng ứng với bậc tự df = (k -1)(l -1) = (2 -1)(2 -1) = ta tìm -So sánh χ2 thực nghiệm với χ2 bảng để tìm xác suất xuất giá trị χ2 thực nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên sinh Nếu χ2TN < χ2α tức (P > 0,05) kết luận khơng có sai khác tỷ lệ Nếu χ2TN > χ2α tức (P < 0,05) kết luận có sai khác tỷ lệ mức α 77 - Phương pháp xác định nguy tương đối (RR) So sánh nguy bị tiêu chảy chết tiêu chảy loại lợn theo lứa tuổi theo vùng, dùng nguy tương đối (Relative Risk = RR) Nguy tương đối thương số hai nguy cơ, tính sau: Số mắc bệnh Số không mắc bệnh (Con) (Con) a b a +b Tiêm vaccine c d c +d Tính chung a +c b+d N = a+b+c+d Nội dung lu an Không tiêm va n vaccine Cộng t to ng hi ep Trong đó: nl w a số lợn khơng tiêm phịng vaccine bị mắc bệnh d oa b số lợn khơng tiêm phịng vaccine khơng bị mắc bệnh an lu c số lợn tiêm phòng vaccine bị mắc bệnh va d số lợn tiêm phịng vaccine khơng bị mắc bệnh lm ul nf a + b tổng số lợn khơng tiêm phịng vaccine oi c + d tổng số lợn tiêm phòng vaccine z b + d tổng số lợn không bị mắc bệnh at nh a + c tổng số lợn bị mắc bệnh z m co -Tính nguy tương đối l ) ) gm Ie a / (a + b = I0 c / (c + d @ RR = - Đánh giá kết quả: + RR > 1: Nguy mắc bệnh lớn gấp RR lần, trị số RR lớn nguy mắc bệnh cao + RR = 1: Không có liên quan 78 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI lu an va n t to ng hi ep oa nl w d Ảnh 1, 2: Lấy mẫu máu trước tiêm thử nghiệm vaccine oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ Ảnh 3, 4: Tiêm thử nghiệm vaccine 79 lu an va n t to ng hi ep d oa nl w Ảnh 5, 6: Lấy mẫu máu sau tiêm thử nghiệm vaccine 30 ngày oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ Ảnh 7, 8: Lấy mẫu máu sau tiêm thử nghiệm vaccine 60 ngày 80 lu an va n t to ng hi ep d oa nl w oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ Ảnh 9, 10, 11: Kiểm tra vô trùng vắc xin môi trường thạch nước thịt thường, bồi dưỡng sau nuôi cấy tủ ấm 370C 81 lu an va n t to ng hi ep d oa nl w oi lm ul nf va an lu at nh z z m co l gm @ Ảnh 12: Vaccine đa giá tiêm thử nghiệm Bắc Giang