Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, luận án kết nghiên cứu thời gian qua Những kết số liệu trình bày luận án kết nghiên cứu tôi, không chép nguồn khác, hoàn toàn trung thực chưa tác giả khác công bố Tôi hồn tồn chịu trách nhiệm kết trình bày luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Thay mặt tập thể hướng dẫn Nghiên cứu sinh PGS TS Nguyễn Thanh Hằng Võ Thành Trung i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực cơng trình nghiên cứu tơi nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo chân tình thầy cô, bạn đồng nghiệp quan Trước hết cho gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS Nguyễn Thanh Hằng – Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội TS Lê Như Hậu phòng Vật liệu hữu từ Tài nguyên Biển, Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang tận tình hướng dẫn định hướng cho tơi suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ góp ý cho tơi nhiều q trình học tập nghiên cứu Nhân dịp cho gửi lời cảm ơn tới PGS Bùi Minh Lý, Viện trưởng -Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn GS Hee Chul Woo, Viện Công nghệ Sản xuất Sạch, Đại học Quốc gia Pukyong Hàn Quốc tạo điều kiện thuận lợi cho tơi nghiên cứu phịng thí nghiệm giáo sư Tôi xin cảm ơn giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ chủ tịch hội đồng, phản biện, thư ký ủy viên hội đồng dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với góp ý cụ thể, gợi ý bổ ích, giúp tơi hồn thiện tốt nội dung nghiên cứu luận án Tơi vơ cảm ơn khích lệ, động viên giúp đỡ nhiệt tình gia đình, bè bạn đồng nghiệp dành cho tơi để tơi hồn thành luận án nghiên cứu Hà Nội,ngày tháng năm 2017 Võ Thành Trung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 RONG BIỂN 1.1.1 Phân loại rong biển 1.1.2 Thành phần hóa học loại rong biển 1.1.3 Rong lục 1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN 1.2.1 Tiềm rong biển để sản xuất ethanol 1.2.2 Quá trình xử lý sơ nguyên liệu rong biển 1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển 1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển 17 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 24 1.3.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển giới 24 1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển Việt Nam 27 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Rong lục 30 2.1.2 Chế phẩm Enzyme 30 2.1.3 Chế phẩm nấm men 30 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Các phương pháp phân tích 31 2.2.2 Phương pháp toán học 42 2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 43 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 LỰA CHỌN RONG LỤC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG LUC VIÊT NAM 51 3.1.1 Lựa chọn loài rong lục Vi t Nam 51 iii 3.1.2 Thành phần hóa học loài rong đư c chọn 53 3.1.3 Nghiên cứu biến động thành phần hóa học rong lục Chaetomorpha linum Cladophora socialis theo chu k s ng 56 3.1.4 Thành phần loại đường rong Chaetomorpha linum Cladophora socialis 61 3.2 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG CHAETOMORPHA LINUM64 3.2.1 Nghiên cứu xử lý nguyên liệu rong Chaetomorpha linum trước thủy phân 64 3.2.2 Nghiên cứu trình thủy phân rong lục axit 66 3.2.3 Nghiên cứu trình thủy phân rong lục chế phẩm enzyme thương mại 75 3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG CH LINUM 88 3.3.1Tuyển chọn chủng nấm men dịch thủy phân rong Ch.linum axit 88 3.3.2 Tuyển chọn chủng nấm men dịch thủy phân rong Ch.linum chế phẩm enzyme 89 3.3.3 Các yếu t ảnh hưởng đến trình lên men dịch thủy phân axit enzyme chế phẩm nấm men Red Ethanol 91 3.3.4 T i ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum axit chế phẩm nấm men Red Ethanol 96 3.4 KHẢO SÁT Q TRÌNH ĐƢỜNG HĨA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) CỦA DỊCH RONG LỤC SAU TIỀN XỬ LÝ 102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105 4.1 KẾT LUẬN 105 4.2 KIẾN NGHỊ 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 PHỤ LỤC 116 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Thành phần hóa học rong biển Bảng So sánh suất nuôi trồng nguồn sinh khối Bảng Thành phần hóa học rong biển đường tạo thành thủy phân loài rong biển Bảng Vi sinh vật lên men ethanol/butanol từ sinh khối rong biển 21 Bảng Diện tích sản lượng thời điểm khảo sát (2009) dự kiến đến năm 2015 28 Bảng Lựa chọn loài rong lục Việt Nam 51 Bảng Thành phần hóa học lồi rong lục chọn 54 Bảng 3 Biến động sinh lượng rong lục vụ trồng vào mùa thuận lợi 56 Bảng Năng suất thu hoạch đối tượng rong lục nuôi trồng luân canh ao đầm miền Trung 57 Bảng Thành phần carbonhydrate sinh khối rong Ch.linum 62 Bảng Thành phần loại đường rong Cladophora socialis 63 Bảng 3.7 Ảnh hưởng muối NaCl nguyên liệu đến trình thủy phân rong Ch linum 65 Bảng Ảnh hưởng kích thước rong đến q trình thủy phân rong Ch linum 66 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ rong dung dịch đến trình thủy phân rong Ch linum 66 Bảng 10 Khoảng xác định yếu tố sau 69 Bảng 11 Mức thí nghiệm 70 Bảng 12 Ma trận thực nghiệm 70 Bảng 13 Kết tính bước chuyển động (∆j) yếu tố 71 Bảng 14 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo Box-wilson 71 Bảng 15 Thành phần hàm lượng loại đường dịch thủy phân rong Ch linum axit 73 Bảng 16 Thành phần dịch thủy phân rong lục axit 74 Bảng 17 Ảnh hưởng nồng độ axit đến trình tiền xử lý rong lục 75 Bảng 18 Hoạt độ loại enzyme chế phẩm enzyme Viscozyme L Cellulase 76 Bảng 19 Khả thủy phân rong Ch.limum thành đường chế phẩm enzyme thương mại 77 Bảng 20 Khoảng xác định yếu tố tối ưu thủy phân enzyme 81 Bảng 21 Mức thí nghiệm tối ưu thủy phân enzyme 81 v Bảng 22 Ma trận thực nghiệm tối ưu thủy phân enzyme 82 Bảng 23 Kết tính bước chuyển động (∆j) yếu tố tối ưu thủy phân enzyme 82 Bảng 24 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Ch linum enzyme 83 Bảng 25 Thành phần hàm lượng loại đường dịch thủy phân rong Ch linum chế phẩm enzyme Viscozyme L 85 Bảng 26 Thành phần dịch thủy phân rong Chaetomorha linum chế phẩm enzyme86 Bảng 27 Hiệu suất thủy phân rong Ch linum axit chế phẩm enzyme Viscozyme L 87 Bảng 28 Khả lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum axit chủng nấm men khác 88 Bảng 29 Kết lên men ethanol hiệu suất chủng nấm men môi trường dịch thủy phân rong lục axit xác định HPLC 89 Bảng 30 Khả lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum chế phẩm enzyme chủng nấm men khác 90 Bảng 31 Kết lên men ethanol hiệu suất chủng nấm men môi trường dịch thủy phân rong Ch linum chế phẩm enzyme xác định HPLC 90 Bảng 32 Ảnh hưởng nguồn nito đến trình lên men dịch thủy phân rong lục 91 Bảng 33 Khoảng xác định yếu tố lên men dich thủy phân axit 96 Bảng 34 Mức thí nghiệm lên men dich thủy phân axit 96 Bảng 35 Ma trận thực nghiệm lên men dịch thủy phân axit 97 Bảng 36 Kết tính bước chuyển động (∆j) yếu tố lên men dich thủy phân axit 98 Bảng 37 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong lục axit theo Boxwilson 98 Bảng 38 Hàm lượng loại đường ethanol biến đổi trình lên men từ dịch thủy phân axit 99 Bảng 39 Hàm lượng loại đường ethanol biến đổi trình lên men từ dịch thủy phân rong lục enzyme 100 Bảng 40 Hiệu suất lên men ethanol trình lên men từ dịch thủy phân rong lục axit chế phẩm enzyme 101 Bảng 41 Kết q trình đường hóa lên men đồng thời thời điểm đường hóa ban đầu khác 102 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thành phần carbohydrate rong đỏ, rong nâu, rong lục Hình Biến động hàm lượng protein theo chu kỳ sống hai lồi rong lục 58 Hình Biến động hàm lượng tro theo chu kỳ sống hai lồi rong lục 59 Hình 3 Biến động hàm lượng lipid theo chu kỳ sống hai lồi rong 60 Hình Biến động hàm lượng carbohydrate tốc độ sinh trưởng theo chu kỳ sống hai loại rong lục 60 Hình Sắc ký đồ thành phần loại đường rong Chaetomorpha linum 62 Hình Sắc ký đồ thành phần loại đường rong Cladophora socialis 63 Hình Ảnh hưởng nồng độ axit sunfurit đến trình thủy phân rong Ch.linum axit 67 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân rong Ch.linum axit sunfurit 68 Hình Động thái trình thủy phân rong Ch.linum axit 69 Hình 10 Sắc ký đồ loại đường ethanol chuẩn (B) dịch thủy phân rong Ch linum axit (A) 72 Hình 11 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân rong Ch.linum enzyme 78 Hình 12 Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân rong Ch.linum enzyme 79 Hình 13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân rong Ch.linum enzyme 79 Hình 14 Động thái trình thủy phân rong Ch.linum enzyme 80 Hình 15 Sắc ký đồ loại đường ethanol chuẩn (B) dịch thủy phân rong Ch linum chế phẩm enzyme Viscozyme L (A) 84 Hình 16 Động thái nito tổng số trình lên men 92 Hình 17 Ảnh hưởng pH đến trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum 93 Hình 18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum 94 Hình 19 Động thái trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum 95 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ C Nồng độ Cs Cộng ĐLM Đường lên men ĐTP Đường dịch thủy phân EtOH Ethanol H Hiệu suất HaF Lên men dịch thủy phân axit HeF Lên men dịch thủy phân enzyme HLM Hiệu suất lên men HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HTP Hiệu suất thủy phân SSF Đường hóa lên men đồng thời Tb Tế bào tn Thí nghiệm V Thể tích v/v Thể tích/ thể tích VSV Vi sinh vật W Khối lượng w/v Khối lượng/thể tích τ Thời gian viii MỞ ĐẦU Khi nhu cầu lượng giới tiếp tục tăng nguồn nhiên liệu hóa thạch giảm, nhiên liệu sinh học giải pháp thay thích hợp Ethanol sản phẩm nhiên liệu sử dụng phổ biến nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu Ethanol thường sản xuất từ tinh bột, đường mía phụ phẩm nơng nghiệp Tuy nhiên việc sử dụng sản phẩm nông nghiệp làm nguồn ngun liệu sản xuất ethanol cịn có hạn chế chiếm lượng lớn đất nông nghiệp, nguồn nước, thời gian cơng chăm sóc, canh tác… Hơn vấn đề đối mặt với ý kiến trích cho khơng thể sử dụng sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol ngày giới có hàng triệu người chết đói thiếu lương thực Trước tình hình đó, hàng loạt nghiên cứu nhằm tìm nguồn nguyên liệu việc sản xuất cồn sinh học đẩy mạnh Trong rong biển lựa chọn thích hợp nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ nuôi trồng thu sinh khối lớn Hàm lượng carbohydrate số loài rong cao từ 40 - 79,4 %, rong có lignin thấp dễ thủy phân, thành phần đường chủ yếu đường carbon nên dễ dàng lên men tạo ethanol Việt Nam có bờ biển dài 3200 km có chứa sinh khối rong biển lớn, rong lục phổ biến Ước tính năm có khoảng triệu khô tạo thành Tuy nhiên nguồn sinh khối chưa sử dụng hợp lý, có số lồi nghiên cứu chế biến sản phẩm sinh học, số lại tự phân hủy ngồi tự nhiên gây tượng nhiễm Vì nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong lục giải pháp thích hợp để tạo nhiên liệu sạch, giải ô nhiễm môi trường gia tăng lợi ích kinh tế cho người dân ven biển Để sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục, cần phải tiến hành bước: lựa chọn đối tượng rong lục thích hợp, đảm bảo sinh khối ổn định tiến hành nuôi trồng gia tăng sinh khối, sử dụng kỹ thuật xử lý nguyên liệu, tìm phương pháp thích hợp để đường hóa rong lục lên men tạo ethanol Về nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục Việt Nam đề cập chưa có nghiên cứu cụ thể Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu” để đưa cách hồn chỉnh cơng nghệ lên men ethanol từ nguồn sinh khối rong lục Mục tiêu đề tài Chọn rong lục thích hợp làm nguyên liệu cho lên men ethanol Chọn giải pháp công nghệ xử lý thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol Chọn giải pháp công nghệ lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục Các nội dung nghiên cứu đề tài Nghiên cứu lựa chọn nguồn rong lục Việt Nam làm nguyên liệu cho lên men ethanol Nghiên cứu chọn giải pháp xử lý thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol Nghiên cứu chọn giải pháp lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục Những đóng góp luận án - Nghiên cứu cách có hệ thống rong lục từ khảo sát lựa chọn nguồn rong lục đến thủy phân lên men ethanol - Nghiên cứu nguồn rong biển Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất ethanol phương pháp thân thiện môi trường hướng nghiên cứu phù hợp với xu thế giới nhằm thay nguồn nhiên liệu hóa thạch Hình sắc ký đồ dịch thủy phân axit 127 Hình Sắc ký đồ dịch lên men axit 24 128 Hình 10 sắc ký đồ dịch lên men axit 48 129 Hình 11 Sắc ký đồ dịch lên men axit 72 130 Hình 12 sắc ký đồ chuẩn loại đường ethanol cho dịch thủy phân axit 131 Hình 13 sắc ký đồ dịch thủy phân chế phẩm enzyme 132 Hình 14 Sắc ký đồ dịch lên men chế phẩm enzyme 48 133 Hình 15 sắc ký đồ dịch lên men chế phẩm enzyme 96 134 Hình 16 sắc ký đồ chuẩn loại đường ethanol cho dịch thủy phân enzyme 135 Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit nấm Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit nấm men Thermosacch men Sac-BKHCM Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit nấm Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân axit nấm men Sac-CCC men Sac-SHND Hình 17 Sắc ký đồ dịch lên men chủng nấm men từ dịch thủy phân axit 136 Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm enzyme nấm men Sac-BKHCM enzyme nấm men Thermosacch Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm Sắc ký đồ dịch lên men từ dịch thủy phân chế phẩm enzyme nấm men Sac-CCC enzyme nấm men Sac-SHND Hình 18 Sắc ký đồ dịch lên men chủng chủng nấm men từ dịch thủy phân chế phẩm enzyme 137 Hình 19 Thiết bị say rong, Rong sau say Hình 20 Khảo sát kích thước nguyên liệu cho trình thủy phân 138 Hình 21 Vật liệu sử dụng phân tích polysaccharide rong lục Hình 22 Thiết bị đo độ nhớt mẫu đo Hình 23 Dịch thủy phân axit Hình 24 Dịch thủy phân chế phẩm enzyme Hình 25 Sản phẩm sau lên men dịch Hình 26 Sản phẩm sau lên men dịch thủy phân axit thủy phân chế phẩm enzyme 139 Hình 27 Chuẩn bị rong cho thủy phân, Nồi hấp, tủ ổn nhiệt, lên men Bioflo Hình 28 Nấm men Saccharomyces serevisiae sinh trưởng q trình lên men 140 Hình 29 Bố trí thí nghiệm tối ưu lên men Hình 30 Máy UVvis so màu mẫu phân Hình 31 Hệ thống phân tích HPLC phân tích đường ethanol tích ethanol đường 141