Luận án tiến sĩ sinh học ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng lilium có khả năng chịu nóng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ THU HƯƠNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DỊNG LILIUM CĨ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bùi Thị Thu Hương ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DỊNG LILIUM CĨ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Lê Trần Bình Viện Cơng nghệ sinh học PGS.TS Trịnh Khắc Quang Viện Nghiên cứu Rau Hà Nội, 2015 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Bùi Thị Thu Hương i Lời cám ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình PGS.TS Trịnh Khắc Quang hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học lãnh đạo, cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam môn Công nghệ sinh học, viện Nghiên cứu Rau Quả tạo điều kiện cho tiến hành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo cán thuộc môn Thực vật, khoa Nông học, môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho thực đề tài Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hương ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT Ký hiệu Chữ viết tắt A rhizogenes Agrobacterium rhizogenes A rubi Agrobacterium rubi A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Acid Deoxirionucleic AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) BA 6-benzyl adenine Bp Base pair CaMV Cailiflower Mosaic Virus Car Carbenicillin 10 Cefo Cefotaxime 11 Chloram Chloramphenicol 12 CodA Choline oxidase 13 CS Cộng 14 CT Công thức 15 ĐC Đối chứng 16 E coli Escherichia coli 17 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid 18 Et al Đồng tác giả 19 EtBr Ethidium Bromid 20 GB Glycine betaine 21 Genta Gentamycine 22 GFP Green Fluorescent Protein 23 GUS β-1,4-Glucuronidase 24 Hpt Hygromycine Phosphotransferase 25 HSF Heat shock factor 26 HSPs Heat shock proteins 27 Hygr Hygromycine resistant iii STT Ký hiệu Chữ viết tắt 28 ISSR Inter Simple Sequence Repeat 29 Kana Kanamycine 30 LB Luria Bertani 31 M Thang Marker chuẩn 32 MAS Marker assisted selection 33 MDA Malondialdehyde 34 Mm Millimolar 35 MS Murashige and Skoog, 1962 36 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein 37 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β-D-glucoronide 38 µl micro litte 39 µM Micromolar 40 NptII Neomycin Phosphotransferase II 41 PCR Polymerase Chain Reaction 42 Pic Picloram 43 QTL Quantitative trait loci 44 RAPD Random Amplified Polymorphic AND 45 Rifa Rifamycine POD Peroxidase 46 SOD Superoxide dismutase 47 T-ADN Transfer-ADN 48 TAE Tris-acetate-EDTA 49 Ti-plasmid Tumor inducing Plasmid 50 TP Transit Peptide 51 Vir Virulence 52 WT Dịng khơng chuyển gen 53 X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoronide 54 α-NAA 1- Naphthaleneacetic acid iv MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cám ơn ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iii MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan lily 1.1.1 Giới thiệu chung lily 1.1.2 Nguồn gốc, phân bố đặc điểm thực vật học lily 1.1.3 Lịch sử phát tình hình ngành trồng hoa lily 1.1.4 Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho lily khả chịu nóng lily 1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ cao đến thực vật 1.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ cao đến thực vật 1.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ cao đến lily 1.2.3 Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt thực vật lily 1.3 Glycine betaine kỹ thuật làm tăng cường khả chịu nóng thực vật 15 1.3.1 Giới thiệu chung glycine betaine 15 1.3.2 Chuyển gen codA tăng cường khả chống chịu cho trồng 16 1.4 Thành tựu tạo giống lily công nghệ tế bào công nghệ gen 17 1.4.1 Công nghệ tế bào tạo giống lily 17 1.4.2 Tình hình ứng dụng cơng nghệ gen tạo giống lily 18 v CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu 21 2.1.1 Thực vật 21 2.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector cặp mồi sử dụng 22 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.4 Máy móc thiết bị 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Các phương pháp sử dụng đánh giá vật liệu nghiên cứu 25 2.2.2 Phương pháp tạo giống lily có khả chịu nóng lai tạo cứu phôi 27 2.2.3 Phương pháp tạo giống lily có khả chịu nóng kỹ thuật gen 30 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Đánh giá tập đoàn giống lily nghiên cứu 37 3.1.1 Đánh giá quan hệ di truyền giống lily nghiên cứu thị phân tử 37 3.1.2 Đánh giá khả tái sinh in vitro số giống lily nghiên cứu 39 3.1.3 Ngưỡng chịu nóng in vitro số giống lily nghiên cứu 41 3.2 Tạo dịng lily có khả chịu nóng lai tạo cứu phôi 44 3.2.1 Kiểm tra chất lượng hạt phấn số giống hoa lily nghiên cứu 44 3.2.2 Lai tạo cứu phôi 45 3.2.3 Bước đầu xác định lai thị phân tử 48 3.4.4 Khả chịu nhiệt cao mơ vảy củ dịng lily lai tạo 53 3.3 Tạo dòng lily có khả chịu nóng cơng nghệ gen 55 3.3.1 Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase 55 3.3.2 Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily A tumefaciens 62 vi 3.3.3 Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily 71 3.3.4 Khả chịu nóng dòng lily chuyển gen 73 3.3.5 Khả tích lũy glycine betaine số dòng lily chuyển gen codA 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91 Kết luận 91 Đề nghị 92 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 SUMMARY 112 PHỤ LỤC 115 vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Danh sách tên ký hiệu giống lily (Lilium spp.) sử dụng .21 Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho gen TP-codA-cmyc codA-cmyc 23 Bảng 2.3 Tên trình tự mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.4 Tên trình tự mồi ISSR sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.5 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn .24 Bảng 2.6 Môi trường nuôi cấy chọn lọc lily chuyển gen 24 Bảng 3.1 Hệ số tương đồng di truyền 13 giống lily nghiên cứu 37 Bảng 3.2 Sự phát sinh hình thái cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ giống lily sau tuần nuôi cấy 40 Bảng 3.3 Tỷ lệ hữu dục tỷ lệ nảy mầm hạt phấn giống lily nghiên cứu 44 Bảng 3.4 Tỷ lệ tạo sau thụ phấn tổ hợp lai .46 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BA tới tỷ lệ nảy mầm tạo củ in vitro từ hạt lai tách từ lát cắt non .47 Bảng 3.6 Khả sống sót khả tái sinh củ lát cắt vảy củ dòng lily lai dòng bố mẹ sau xử lý nhiệt (37oC ± 1oC, 13 ngày) 54 Bảng 3.7 Tên trình tự đoạn mồi nhân đoạn promoter HSP18.2 A thaliana 57 Bảng 3.8 Kết chuyển gen codA vào thuốc nhờ A tumefaciens .60 Bảng 3.9 Ảnh hưởng Cefotaxime đến tái sinh củ lát cắt vảy củ biến nạp 64 Bảng 3.10 Ảnh hưởng hygromycine đến khả sống củ lily in vitro 65 Bảng 3.11 Khả chuyển gen chủng A tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily 66 viii Phụ lục 9: Khả nhận cấu trúc gen giống lily nghiên cứu cấu trúc chuyển gen Bel (*1) Yel Sor Bel (*2) Yel Sor Bel (*3) Số mẫu biến nạp (lát cắt) Số củ hình thành (củ) Số củ sống sót sau chọn lọc (củ) Số mẫu dương tính X-gluc 55 45 5 65 40 91 42 5 78 85 80 73 5 65 65 63 45 2 58 45 3 50 30 65 55 65 50 81 42 70 75 65 64 115 111 35 15 2 30 17 2 21 11 1 50 36 75 40 85 50 6 67 55 46 52 27 33 1 35 23 3 32 18 3 24 0 Thí Giống nghiệm Yel Sor (*1): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*2): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*3):35S/Hyg/35SpolyA/HSP/TP-codA-cmyc/Nos/35S-GUS-Nos Phụ lục 10: Tỷ lệ sống sót củ nhỏ in vitro giống nuôi cấy nhiệt độ cao (37 ±1 oC) Số Số mẫu sống sót củ nhỏ sau … ngày nuôi cấy nhiệt độ cao 37 ±1 oC (mô) mẫu đem Giống TN sốc 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 nhiệt (mô) 30 30 30 30 30 30 27 21 12 12 12 12 11 11 11 Bel V Sor F I4 I5 SP 35 35 35 35 35 35 35 22 19 17 15 14 14 14 13 13 0 27 27 27 27 27 27 27 15 15 15 14 14 14 13 13 12 30 30 30 30 30 30 30 30 23 15 10 6 29 29 29 29 29 29 29 29 19 13 13 0 30 30 30 30 30 30 30 30 26 18 12 12 11 0 28 28 28 28 22 17 13 12 12 4 2 33 33 33 33 25 15 13 13 12 10 0 28 28 28 28 28 12 11 11 10 1 33 33 33 33 33 33 33 33 33 20 11 11 11 10 11 11 10 10 2 30 30 30 30 30 30 30 30 30 21 7 5 4 1 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 18 13 6 4 2 0 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 23 9 5 2 1 0 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 15 6 5 1 1 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 12 6 4 1 0 0 25 25 25 25 25 25 25 25 25 15 7 2 0 25 25 25 25 25 25 25 25 25 20 12 7 5 2 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 18 10 6 5 3 27 27 27 27 27 27 27 23 15 13 12 2 30 30 30 30 30 30 30 25 17 14 10 3 25 25 25 25 25 25 25 22 18 13 7 Phụ lục 11 Tỷ lệ sống sót củ nhỏ in vitro giống lily nuôi cấy nhiệt độ 42 oC ± 1oC Giống Số mẫu sốc nhiệt (mô) 20 TN Số mẫu sống sót sau 0.5 1.5 2.5 3.5 ngày 20 17 15 10 22 22 18 15 20 20 20 16 11 22 22 16 10 25 25 17 13 20 20 18 12 20 20 12 20 20 13 22 22 15 24 24 19 15 10 22 22 18 13 22 22 18 14 20 20 19 15 13 10 F 20 20 25 20 20 25 20 18 20 17 16 12 14 14 11 10 2 0 Yel 25 25 18 11 3 25 25 20 14 Bel SP Sor L Phụ lục 12 Khả sống sót dịng lily chuyển gen in vitro sau xử lý nhiệt độ 37 oC ± oC, 13 ngày Cấu trúc gen chuyển Giống Bel (*1) Yel Sor Bel (*2) Yel Sor Bel (*3) Yel Sor Tổng số dòng đem xử lý (dịng) Số dịng sống sót sau thử nhiệt (dịng) Số dịng sống sót sau phục hồi 10 ngày(dịng) Số dịng sống sót sau phục hồi 20 ngày(dịng) Số dịng sống sót sau phục hồi 30 ngày(dịng) 16 16 15 17 16 16 15 14 14 25 25 24 21 21 20 7 17 16 15 14 13 13 6 15 14 13 12 14 13 11 12 12 22 23 24 17 17 18 15 15 16 12 13 13 5 14 13 13 12 13 13 10 10 20 20 20 13 12 12 5 15 14 13 10 13 12 4 14 13 12 12 13 13 6 18 19 19 10 9 13 13 13 10 11 4 13 13 12 12 13 12 3 18 18 19 10 3 13 13 12 9 3 126 Phụ lục 13 Khả sống sót khả tạo củ mô vảy củ dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt 37 oC ±1 oC, 13 ngày Dòng Yel Hsp A6.1 Yel Cod A A1.4 Yel (ĐC) Bel Hsp A5.1 Bel Cod A A2.1 Bel Sp A9.1 Bel (ĐC) Sor Hsp A2.1 Sor Sp A2.8 Sor Cod A A3 Sor (ĐC) Thí nghiệm Số mẫu sốc nhiệt (mơ) Số mẫu sống sót sau sốc nhiệt… ngày (mô) 10 ngày 30 ngày Số mẫu sống sót tạo củ (mơ) Số củ tạo (củ) 21 18 15 12 17 20 17 14 11 18 22 18 15 11 16 17 12 12 15 15 11 10 15 15 12 12 13 21 3 2 23 2 25 2 20 18 16 14 17 17 15 13 13 20 15 14 13 13 18 16 14 13 12 15 15 13 13 13 21 15 11 11 10 17 20 15 14 13 18 23 20 17 16 22 19 17 15 15 22 1 24 3 19 1 1 15 13 10 17 14 11 11 11 10 17 14 15 13 15 13 6 17 14 5 17 13 5 18 15 30 1 28 0 27 0 127 Phụ lục 14 Khả sống sót khả tái sinh củ dòng lily lai dòng bố mẹ chúng sau xử lý nhiệt 37 ±1 oC, 13 ngày Dòng I5 F L SL11 Sor Bel 134 Thí Nghiệm Số mẫu sốc nhiệt (mơ) 3 3 3 25 25 20 22 25 20 15 17 18 20 22 18 25 20 22 28 27 25 20 20 20 Số mẫu sống sót sau sốc nhiệt… ngày (mơ) 10 ngày 10 ngày 12 13 10 8 4 7 5 7 4 0 2 Số mẫu sống sót sau sốc nhiệt… ngày (mô) Hệ số nhân củ 3 6 3 7 1 2 1 2 2 128 PHỤ LỤC 15 – MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN  Tách chiết tinh ADN plasmid (Sambrook et al., 2002) Phương pháp sử dụng dung dịch Sol I, Sol II, Sol III để tách plasmid từ tế bào vi khuẩn, dựa nguyên lý sau: sử dụng EDTA để hòa tan cặn tế bào vi khuẩn, sau đó, sử dụng SDS, NaOH để phá vỡ cấu trúc thành làm biến tính phân tử protein, kết tủa protein cách thay đổi pH dịch chiết tế bào; sau đó, ly tâm tốc độ cao để loại protein bị kết tủa ADN plasmid tủa lại ethanol 100% isopropanol Lượng ARN tồn dung dịch chứa ADN plasmid loại bỏ cách bổ sung ARNase Quy trình tách chiết tiến hành cụ thể sau: - Lấy ml dịch khuẩn nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf ml ly tâm 8000 vòng/phút phút thu cặn tế bào đáy ống - Bổ sung vào cặn khuẩn 100 µl dung dịch Sol I lạnh (Tris HCl 50 mM, pH 8.0; EDTA 10 mM, pH 8.0); hịa tan hồn tồn cặn tế bào voltex Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II (200 mM NaOH + SDS %), đảo nhẹ, ủ đá phút Bổ sung 150 µl dung dịch Sol III lạnh (Potassium acetat 3M; Acetic acid 11,5 %; H20), đảo nhẹ Đặt đá phút - phút Sau đó, tiến hành ly tâm 13000 vịng/phút 15 phút 4oC; thu dịch nổi, bỏ cặn - Bổ sung dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) theo tỷ lệ 1: 1, đảo nhẹ ly tâm hỗn hợp tốc độ 13000 vòng/phút 10 phút chuyển pha sang ống Eppendorf 1,5 ml - Bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1: 1, ủ - 20oC thời gian 30 phút; ly tâm 4oC, 13000 vòng/phút 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu kết tủa ADN - Rửa kết tủa hai lần 500 µl cồn 70 % lạnh; ly tâm 4oC, 13000 vòng/phút phút loại bỏ dịch phía làm khơ tủa - Hồ tan tủa 50 µl nước khử ion vơ trùng TE có bổ sung ARNase đến nồng độ cuối 30 µg/ml, để nhiệt độ phịng cho tan hoàn toàn - Bảo quản plasmid tủ - 20oC để phục vụ cho nghiên cứu 129 - Điện di kiểm tra gel agarose % * Thôi gen từ gel agarose KIT hãng Fermentas, Mỹ Cắt phần gel có chứa đoạn gen codA-cmyc vào ống eppendorf ml Cân đoạn gel vừa cắt xác định thể tích đoạn gel theo quy ước mg trọng lượng tương đương với µl thể tích Bổ sung dịch gắn kết ADN GB (Gel Binding) vào ống chứa mảnh gel theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB = : Ủ hỗn hợp 60oC 10 phút phút - phút đảo nhẹ lần gel tan hoàn toàn Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN (Binding column) ly tâm 13000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch chảy qua cột Tiếp tục bổ sung 500 µl đệm rửa WB (Washing Buffer) lên cột liên kết ADN Ly tâm 13000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch chảy qua cột Ly tâm 13000 vòng/phút phút thêm lần để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa WB Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml Bổ sung 30 µl - 50 µl dung dịch hịa tan ADN (Elution Buffer) (hoặc nước khử ion khử trùng) vào cột, để nhiệt độ phịng phút Ly tâm 13000 vòng/phút phút để thu ADN Bỏ cột bảo quản ADN vừa tinh - 20oC để phục vụ cho nghiên cứu Sản phẩm gel điện di kiểm tra gel agarose 1% * Biến nạp vector tái tổ hợp vào A tumefaciens xung điện (Cohen et al., 1972) Phương pháp dựa sở tạo lỗ màng có tác dụng điện cực lớn, cho phép phân tử ADN ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên tế bào theo điện trường Các bước tiến hành sau: Làm tan tế bào khả biến A tumefaciens đá 10 phút - 15 phút Bổ sung µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến, trộn đặt đá 15 phút Dùng pipet chuyển dung dịch sang cuvette dùng máy xung điện làm lạnh khử trùng từ trước Tiến hành xung điện 25 µF, 200, 2.5 kV, đặt vào đá 130 Bổ sung 500 µl mơi trường LB lỏng vào cuvette chuyển sang ống eppendorf ml, lắc 200 vòng/phút 28oC từ - 1,5 để tế bào hồi phục Cấy trải 100 µl dịch tế bào biến nạp môi trường chọn lọc LB đặc có bổ sung 50 mg/l rifamycin, 50 mg/l kanamycin Nuôi đĩa vi khuẩn cấy trải 28oC, lắc 200 vòng/phút, từ ngày - ngày thu khuẩn lạc riêng rẽ * Kiểm tra biểu gen đích mơ hình nhờ kỹ thuật chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn A tumefaciens (Topping, 1998) Tạo nguyên liệu chuyển gen: Chọn bánh tẻ, có kích thước vừa phải khỏe mạnh tuần tuổi Dùng dao cắt bốn cạnh mép gây tổn thương, tạo thành mảnh có kích thước khoảng cm x cm Sau đó, mảnh đặt mơi trường ½ MS lỏng trước biến nạp để tránh bị khô Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy: Ngâm mảnh vào dịch huyền phù vi khuẩn, OD600 = 0,7 10 phút, có lắc nhẹ Mẫu cấy thấm khơ giấy thấm khử trùng đặt lên môi trường đồng nuôi cấy tối ngày - ngày Sau ngày - ngày đồng nuôi cấy, đặt mảnh lên giấy thấm khô hết dịch khuẩn chuyển lên môi trường tái sinh Sau tuần - tuần, xuất cụm chồi nhỏ từ mép mảnh lá, tách cụm chồi, tiếp tục cấy lên môi trường rễ Đến chồi thật phát triển từ cụm chồi tiến hành tách chồi riêng rẽ cấy lên môi trường chọn lọc lần *Tách chiết ARN: Thực theo kit tách ARN GenElute TM Total RNA Miniprep (hãng Sigma) + Giải phóng ARN từ tế bào mô - Nghiền mẫu nitơ lỏng - Chuẩn bị hỗn hợp bao gồm Lysis + 2-mercaptoethanol (ME) (500µl dung dịch ly giải x số mẫu + 10µl ME x số mẫu); cho hỗn hợp dung dịch vào mẫu (có thể ly tâm nhẹ, hút phần dịch sang cột lọc màu xanh); sau ly tâm 13 000 vòng/ phút, phút 131 - Bỏ cột lọc màu xanh, thu lấy phần dịch phía (dung dịch ly giải) bổ sung ME vào dung dịch ly giải (10 µl 2ME/1ml dung dịch ly giải) Chuyển dung dịch ly giải sang cột lọc màu xanh Ly tâm cột 13 000vòng/ phút, phút + Gắn ARN vào cột: Bổ sung thể tích tương đương cồn ethanol 70% vào cột lọc màu xanh trộn sau chuyển 700 µl hỗn hợp dung dịch ly giải/ethanol sang cột màu đỏ để làm cột bám; ghi lại tên ống ly tâm 13000 vòng/ phút, 30 giây; loại bỏ dịch nước chảy qua lặp lại cần + Rửa để loại bỏ tạp chất Bổ sung 500 µl dung dịch ‘wash 1’ vào cột đỏ, ly tâm 15000 vòng/ phút, phút; đổ bỏ dịch phía dưới, giữ lại cột; bổ sung 500 µl dung dịch ‘wash 2’ vào cột đỏ, ly tâm 13000 vòng/ phút, phút Đổ bỏ phần dịch phía dưới, giữ lại cột (lưu ý: Ethanol phải bổ sung vào dung dịch ‘Wash 2’ để sử dụng); bổ sung lần hai 500 µl dung dịch ‘wash 2’ vào cột; ly tâm 13000 vòng/ phút, phút để loại bỏ ethanol, bỏ dịch phía dưới, giữ lại cột; ly tâm khơng với cột, thấm khô với giấy phần ống + Rửa ARN tinh Chuyển cột vào ống effendox mới, ghi lại tên ống; bổ sung 50 µl dung dịch ‘Elute’ vào ống để yên phút, sau ly tâm 13000 vịng/ phút, phút (lặp lại muốn thu lượng ARN nhiều >100 µg) + Đo hàm lượng mẫu ARN tách chiết máy Nanodrop + Pha loãng dung dịch chứa ARN đến nồng độ thích hợp để sử dụng, thường 100 ng/µl * Tổng hợp cDNA ARN sau tách chiết dùng để tổng hợp cDNA theo kit First Strand cDNA synthesis (hãng Fermentas) để chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR 132 Bước 1: Chuẩn bị ‘working solution’ ống 0,2 ml 0,5 ml sau: STT Thành phần Thể tích (µl) ARN tổng số Random Hexamer Primer DEPC water Ủ (working solution) 650C phút (sử dụng máy PCR) Sau đặt vào đá Bước 2: Thêm thành phần sau vào dung dịch chuẩn bị STT Thành phần Thể tích Reaction buffer 5X dNTP 10mlM RiboLock ARNse Inhibitor 20 µ/µl M-MuLV Reverse Transcriptase 200 µ/ µl Bước 3: Tiến hành phản ứng PCR theo chu trình nhiệt sau Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 250C phút 420C 60 phút 700C phút 40C ∞ Bước 4: Kiểm tra thành công trình tổng hợp cDNA: - cDNA sau tổng hợp kiểm tra mồi actin theo kit GoTaq®FGreen Master Mix (của hãng Promega) 133 - Thành phần phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen Thể tích phản ứng (µl) Thành phần Master Mix (2X) 10 AND Forward Primer 5pM Reverse Primer 5pM H2 O Tổng thể tích 20 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Khởi đầu 94 phút Biến tính 94 30 giây 25 Gắn mồi 55 30 giây Kéo dài 72 30 giây 72 phút ∞ Giữ * Phản ứng PCR: thực theo kit GoTaq®Green Master Mix hãng Promega Thành phần phản ứng RT-PCR kiểm tra có mặt gen TPcodA-cmyc Thành phần Thể tích phản ứng (µl) Master Mix (2X) 10 cDNA Forward Primer pM Reverse Primer pM H2 O Tổng thê tích 20 134 Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR kiểm tra có mặt gen TP-codA-cmyc Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Khởi đầu 940C phút Biến tính 940C phút 35 Gắn mồi 550C 50 giây Kéo dài 720C phút 30 giây 720C 10 phút 40 C ∞ Giữ *Phương pháp lai Weston blot Tách chiết protein PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween 20 Tiến hành lấy mẫu, cân nghiền mẫu (bằng cối chày máy nghiền mẫu) sau bổ sung đệm PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween 20 để đông Tiến hành ly tâm hỗn hợp ống tốc độ 13000 vòng/phút, 15 phút Hút dịch phía Biến tính protein: bổ sung vào dịch vừa hút simple buffer 4X ủ 95oC 10 phút máy PCR Kỹ thuật SDS-PAGE: Protein phân tách điện di biến tính gel acrylamide 12,5% chuyển qua màng nitrocellulose - Đổ gel 1,5 mm với thành phần điện di SDS 20 mA Thành phần Gel tách (9 ml) Gel cô (2ml) dH2O 1,1 ml 1,3 ml Tris HCl 2,25 ml (1,5 M; pH 8,8) 0,5 ml (0,5 M; pH 6,8) Glycerol 50% 1,8 ml Acrylamide 30% 3,78 ml 0,35 ml SDS 10% 90 µl 10 µl APS 10% 60 µl 20 µl Temed µl µl 135 Lai Western blot - Sau điện di biến tính protein gel polyacrylamide-SDS, gel ngâm đệm chuyển màng lạnh (chuẩn bị màng: ngâm giấy lọc màng nitrocellulose đệm chuyển phút) - Bước chuyển màng thực máy Pierce G2 Fast Blotter chế độ 25 V, 1,3 mA 20 phút - Tháo màng, tráng màng nước deion phút; màng chứa kháng nguyên phủ 5% sữa tách bơ pha dung dịch PBS 0,05% Tween để qua đêm - Rửa màng dung dịch PBST lần, lần phút - Phủ kháng thể 1: ngâm màng 15 ml dung dịch sữa 5% có chứa kháng thể c-myc nồng độ 180 µg/ml với độ pha lỗng 100 lần, lắc nhiệt độ phòng - Rửa màng dung dịch PBST lần, lần phút - Phủ kháng thể 2: ngâm màng 15 ml dung dịch sữa tách bơ 5% có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horseradish Peroxidase) với độ pha lỗng 500 lần giờ; rửa màng dung dịch PBST lần, lần 10 phút - Hiện màu dung dịch màu có chứa chất DAB băng màu nâu * Định lượng Glycine betaine (Grieve Grattan, 1983) Hóa chất: Chuẩn bị potassium triiodide: lấy 15,7 g iot 20 g kali iot hòa tan 100 ml nước cất bảo quản tủ 40C Chuẩn bị axit sunfuric 2N (có thể thay HCl 2N): lấy 55 ml axit sunfuric hòa tan vào nước cất dâng lên thể tích tới lít (H2SO4 98% - 18N, HCl 37% - 11N) Tiến trình: - Lấy g khô nghiền nước cất lọc (hoặc thay li tâm thu dịch chiết) Sau lọc, lấy ml dịch chiết trộn với ml HCl 2N 136 - Hỗn hợp chuyển vào cốc thủy tinh bổ sung vào 0,2 ml dung dịch potassium triiodide, tồn thể tích làm mát đá khoảng 90 phút máy lắc - Sau bổ sung ml nước cất làm mát đá 20 ml 1-2diclometan (được làm mát -100C) vào hỗn hợp khoảng phút - phút ống để đá (40C) Bỏ lớp nước phía xác định mật độ quang học lớp chất hữu phía bước sóng 365 nm * Nồng độ glycine betaine tính tốn từ đường chuẩn: Y- nồng độ glycine betain ( µg/ml), X-OD365 nm (Hàm lượng glycine betain (mg/g) = Y(µg/ml).V(ml).df / 1000.w(g)) X: giá trị OD365 nm mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml 1,2 diclometan); df: hệ số pha loãng (trong trường hợp “80” 40 ml dịch chiết pha lỗng H2SO4 2N/0,5 ml phân tích); w: khối lượng mẫu (= 0,5 g); 1000: hệ số chuyển đổi đơn vị µg/g sang mg/g mẫu) Nồng độ glycine betain chuẩn bị 50 µg/ml đến 200 µg/ml axit H2SO4 1N để dựng đường chuẩn