Đang tải... (xem toàn văn)
Untitled LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Hữu Chiến nghiên cứu sinh khóa 32 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan 1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện t[.]
i LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Hữu Chiến nghiên cứu sinh khóa 32 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Huyết học Truyền máu, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực Viện Huyết học Truyền máu Trung ương hướng dẫn của: - GS.TS Nguyễn Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Phó Chủ nhiệm Bộ mơn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội; - PGS.TS Bạch Khánh Hịa, Bộ mơn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng NGUYỄN HỮU CHIẾN năm ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực luận án này, nhận hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tận tình thầy cơ, anh chị bạn đồng nghiệp Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Ban Lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, Phòng Đào tạo sau đại học trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Huyết học - Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện, hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận án Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - GS.TS.AHLĐ Nguyễn Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương; Phó trưởng Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội - PGS.TS Bạch Khánh Hòa, Bộ môn Huyết học - Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội Những người thầy yêu quý dành nhiều tâm sức đào tạo, hướng dẫn, động viên bảo tận tình em suốt trình làm việc, thực hoàn thành luận án Xin trân trọng gửi cảm ơn tới GS.TSKH Đỗ Trung Phấn, người thầy kính yêu hệ, tuổi cao thầy tận tình bảo, hướng dẫn em kinh nghiệm quý báu trình thực luận án Xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phạm Quang Vinh, Trưởng Bộ môn Huyết học - Truyền máu PGS.TS Nguyễn Hà Thanh, Phó trưởng Bộ mơn Huyết học - Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội, thầy nhiệt tình, tâm huyết bảo, dạy dỗ em suốt trình làm việc thực luận án iii Xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới thầy cô Bộ môn Huyết học - Truyền máu, thầy cô Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, thầy cô Trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ em hoàn thành luận án Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới BSCKII Võ Thị Thanh Bình, TS Trần Ngọc Quế bác sĩ, cử nhân, điều dưỡng, kỹ thuật viên Khoa Ghép Tế bào gốc Trung tâm Tế bào gốc nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Các anh chị bạn góp phần khơng nhỏ vào thành cơng luận án Xin gửi lời cảm ơn tới tập thể Phòng Kế hoạch tổng hợp chung tay chia sẻ cơng việc để tơi n tâm thực hồn thành luận án Xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô hội đồng chấm luận án cấp sở, cấp nhà trường cho em đóng góp q báu để luận án hồn thiện Xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể cán bộ, nhân viên Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương quan tâm, động viên giúp đỡ năm tháng vừa qua Xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn đồng nghiệp nước động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hoàn thiện luận án Xin gửi lời cảm ơn đến bệnh nhân gia đình bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu, có hội thực hồn thành luận án Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố Mẹ đã sinh con, ni dạy nên người, đặc biệt xin tỏ lịng thành kính đến linh hồn người Cha khuất chưa dời mái trường Đại học Y Hà Nội Xin cảm iv ơn thành viên gia đình nội, ngoại ln bên tơi lúc khó khăn Tơi xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến vợ yêu quý tôi, động lực sống tôi, người hy sinh nhiều cho nghiệp tôi, luôn bên cạnh tôi, động viên giúp đỡ đến ngày hôm Xin cảm ơn tới quê hương nghèo khó nơi sinh lớn lên, với người chân thật, hiền hậu nuôi dưỡng, cho tơi chí hướng phấn đấu Hà Nội, ngày tháng Nguyễn Hữu Chiến năm v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH .ii DANH MỤC BẢNG .ix DANH MỤC BIỂU xi DANH MỤC SƠ ĐỒ xii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN .2 1.1 Lơ xê mi cấp dòng tủy 1.1.1 Bệnh nguyên chế bệnh sinh LXM cấp dịng tủy 1.1.2 Chẩn đốn 1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đốn LXM cấp dịng tủy .2 1.1.4 Điều trị LXM cấp .2 1.2 Ghép TBG tạo máu đồng loài điều trị LXM cấp dòng tủy .2 1.2.1 Lịch sử ghép TBG tạo máu .2 1.2.2 Nguồn TBG sử dụng cho ghép đồng loài .2 1.2.3 Các phác đồ điều kiện hóa trước ghép TBG tạo máu đồng lồi 1.2.4 Hiệu ghép TBG tạo máu đồng loài điều trị LXM cấp dòng tủy 1.2.5 Các biến chứng ghép TBG tạo máu đồng loài .2 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu .2 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn người hiến TBG vi 2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn đơn vị máu dây rốn 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 2.2.2 Phương pháp chọn mẫu 2.2.3 Chẩn đoán 2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 2.2.5 Các xét nghiệm, quy trình sử dụng nghiên cứu 2.2.6 Các tiêu chuẩn nghiên cứu 2.2.7 Thời gian theo dõi bệnh nhân 2.2.8 Thu thập, xử lý số liệu phân tích kết 2.2.9 Đạo đức nghiên cứu Chương KẾT QUẢ 3.1 Đặc điểm bệnh nhân người hiến trước ghép, thay đổi lâm sàng xét nghiệm sau ghép 3.1.1 Đặc điểm chung bệnh nhân trước ghép .2 3.1.2 Đặc điểm nguồn TBG điều kiện hóa trước ghép 3.1.3 Đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm trước, sau ghép 3.2 Kết ghép số yếu tố liên quan 3.2.1 Tỷ lệ gặp mọc mảnh ghép 3.2.2 Bệnh ghép chống chủ (GVHD) 3.2.3 Kết chung đặc điểm tái phát, tử vong, thời gian sống thêm toàn (OS), thời gian sống thêm không bệnh (DFS) 3.2.4 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng xét nghiệm với kết ghép Chương BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm bệnh nhân người hiến trước ghép, thay đổi lâm sàng xét nghiệm sau ghép .2 vii 4.1.1 Đặc điểm chung bệnh nhân trước ghép .90 4.1.2 Đặc điểm nguồn tế bào gốc điều kiện hóa 4.1.3 Đặc điểm thay đổi lâm sàng xét nghiệm sau ghép 4.1.4 Các biến chứng 4.2 Kết ghép mối liên quan đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm với kết ghép .2 4.2.1 Đặc điểm mọc mảnh ghép 4.2.2 Bệnh ghép chống chủ (GVHD) 4.2.3 Bàn luận số kết ghép 4.2.4 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng xét nghiệm với kết ghép TBG tạo máu đồng lồi bệnh nhân LXM cấp dịng tủy KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 NST bệnh nhân Nguyễn Phương A Hình 3.2 NST bệnh nhân Bùi Mạnh P Hình 3.3 NST bệnh nhân Nguyễn Đình Nam Tr Hình 3.4 NST bệnh nhân Đồn Thị Thanh Th .2 Hình 3.5 Gen NPM1: bệnh nhân Nguyễn Quang H .2 Hình 3.6 Gen ETO-AML1: bệnh nhân Trịnh Huỳnh H Hình 3.7 Gen FLT3-ITD: bệnh nhân Nguyễn Thị Thanh H Hình 3.8 Gen BCR/ABL p210: bệnh nhân Đồn Thị Thanh Th Hình 3.9 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Nguyễn Quang H Hình 3.10 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Trương Văn Th Hình 3.11 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Hà Thị H Hình 3.12 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Vũ Duy H Hình 3.13 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Lê Huyền Tr Hình 3.14 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Nguyễn Hồng H Hình 3.15 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Hoàng Thị Thùy L Hình 3.16 Tác nhân nhiễm trùng bệnh nhân Lê Thị H Hình 3.17 FISH X/Y: bệnh nhân Vũ Duy H Hình 3.18 FISH X/Y: bệnh nhân Nguyễn Hồng H .2 Hình 3.19 FISH X/Y: bệnh nhân Trần Thị Th Hình 3.20 FISH X/Y: bệnh nhân Hồng Thị Thùy L .2 Hình 3.21 GVHD cấp: bệnh nhân Nguyễn Duy Tr Hình 3.22 GVHD cấp: bệnh nhân Nguyễn Hoàng H .2 Hình 3.23 GVHD mạn: bệnh nhân Đồn Thị Thanh Th Hình 3.24 GVHD mạn: bệnh nhân Vũ Duy H .2 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Yếu tố tiên lượng bệnh LXM cấp dòng tủy Bảng 3.1 Tình trạng bệnh trước ghép .2 Bảng 3.2 Nhóm tiên lượng bệnh nhân ghép Bảng 3.3 Bất đồng giới bệnh nhân người hiến Bảng 3.4 Bất đồng nhóm máu bệnh nhân người hiến .2 Bảng 3.5 Đặc điểm nguồn TBG Bảng 3.6 Mức độ phù hợp HLA bệnh nhân người hiến Bảng 3.7 Đặc điểm khối TBG truyền cho bệnh nhân Bảng 3.8 Đặc điểm phác đồ điều kiện hóa trước ghép Bảng 3.9 Đặc điểm phác đồ điều trị dự phòng bệnh ghép chống chủ Bảng 3.10 Thời gian tế bào máu trở giá trị bình thường Bảng 3.11 So sánh thời gian phục hồi dòng tế bào máu ngoại vi bệnh nhân ghép từ máu dây rốn máu ngoại vi Bảng 3.12 Đặc điểm thay đổi xét nghiệm di truyền Bảng 3.13 Đặc điểm thay đổi xét nghiệm sinh học phân tử (gen LXM) Bảng 3.14 Đặc điểm nơn sau điều kiện hóa Bảng 3.15 Biểu viêm loét miệng Bảng 3.16 Biểu tiêu chảy Bảng 3.17 Đặc điểm tổn thương gan Bảng 3.18 Đặc điểm vị trí nhiễm trùng .2 Bảng 3.19 Đặc điểm tác nhân nhiễm trùng .2 Bảng 3.20 Tác dụng phụ điều trị thuốc dự phòng GVHD Bảng 3.21 Biến chứng muộn trình theo dõi bệnh nhân sau ghép Bảng 3.22 Đặc điểm hội chứng mọc mảnh ghép Bảng 3.23 Đánh giá mọc mảnh ghép phục hồi tế bào máu Bảng 3.24 So sánh phục hồi tế bào máu trường hợp ghép từ TBG máu ngoại vi máu dây rốn x Bảng 3.25 Mọc mảnh ghép đánh giá xét nghiệm chimerism Bảng 3.26 Đặc điểm truyền KHC bệnh nhân ghép bất đồng nhóm máu .2 Bảng 3.27 Đặc điểm chung bệnh ghép chống chủ Bảng 3.28 Thời điểm xuất bệnh ghép chống chủ Bảng 3.29 Bệnh ghép chống chủ mức độ phù hợp HLA Bảng 3.30 Bệnh ghép chống chủ nguồn TBG Bảng 3.31 Bệnh ghép chống chủ liều TBG máu ngoại vi Bảng 3.32 Bệnh ghép chống chủ bất đồng giới Bảng 3.33 Bệnh ghép chống chủ phác đồ điều kiện hóa Bảng 3.34 Đặc điểm thải ghép Bảng 3.35 Kết chung ghép TBG tạo máu đồng lồi điều trị LXM cấp dịng tủy Bảng 3.36 Đặc điểm tái phát sau ghép bệnh nhân LXM cấp dòng tủy Bảng 3.37 Đặc điểm tử vong bệnh nhân ghép Bảng 3.38 Tỷ lệ tái phát tình trạng bệnh thời điểm ghép .2 Bảng 3.39 Tỷ lệ tử vong tình trạng bệnh thời điểm ghép .2 Bảng 3.40 Tỷ lệ tái phát yếu tố tiên lượng trước ghép Bảng 3.41 Tỷ lệ tử vong yếu tố tiên lượng trước ghép Bảng 3.42 Tỷ lệ tái phát nguồn TBG ghép cho bệnh nhân .2 Bảng 3.43 Tỷ lệ tử vong nguồn TBG ghép cho bệnh nhân .2 Bảng 3.44 Tỷ lệ tái phát phù hợp HLA bệnh nhân/người hiến Bảng 3.45 Tỷ lệ tử vong phù hợp HLA bệnh nhân/người hiến Bảng 3.46 Bất đồng giới tỷ lệ tái phát .2 Bảng 3.47 Bất đồng giới tỷ lệ tử vong .2 Bảng 3.48 Bệnh ghép chống chủ tỷ lệ tái phát Bảng 3.49 Bệnh ghép chống chủ tỷ lệ tử vong - Máy trộn mẫu vortex; - Máy tính phần mềm phân tích kết (LABScan); - Micro Pipet, đầu côn lọc, ống nghiệm 1,5 ml, hốt vô trùng; - Găng tay, mũ, trang 2.2 Hóa chất: - Kít PCR gồm khay 96 giếng ống nghiệm chạy PCR, mồi DNA (primer) đặc hiệu HLA, đệm D-mix; - Kít lai DNA chứa hạt nhựa gắn đầu dò (probe) đặc hiệu DNA alen HLA, dung dịch streptavidin gắn huỳnh quang (SAPE), dung dịch đệm lai, đệm hồi tính, đệm biến tính, đệm rửa; - Taq polymerase; - Dung dịch sheath chạy máy; - Cồn 96o - 100oC; - Nước khử ion Mẫu bệnh phẩm: Mẫu DNA (nồng độ 20-200 ng/µl) tách từ bệnh phẩm máu ngoại vi, máu dây rốn, dịch tủy xương V CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Khuếch đại mẫu DNA sau tách: - Hút µl DNA vào ống nghiệm giếng; - Trộn mồi DNA, dung dịch đệm D-mix Taq polymerase theo tỷ lệ phù hợp, trộn đều; - Thêm 18µl hỗn hợp vào giếng ống nghiệm có DNA, đạt thể tích cuối 20µl; - Đậy kín phiến ống nghiệm, chuyển vào máy chạy PCR Lai sản phẩm DNA khuếch đại với hạt SSO: - Biến tính hồi tính: + Chuyển 5µl sản phẩm DNA khuếch đại vào giếng phiến 96 giếng (số lượng giếng cần dùng tùy thuộc vào số locus cần xét nghiệm); + Thêm 2,5µl đệm biến tính vào giếng, trộn đều, ủ nhiệt độ phịng 10 phút; + Thêm 5µl đệm hồi tính, trộn đều; + Giữ phiến bể đá trước lai - Lai với đầu dò DNA: + Trộn hạt nhựa gắn đầu dò DNA đệm lai theo tỷ lệ phù hợp vào giếng phiến xử lý, đậy chặt phiến, votex nhẹ; + Ủ phiến máy ủ nhiệt 60oC, 15 phút; + Thêm 100µl đệm rửa vào giếng, đậy kín, ly tâm 1.000-1.300g phút, hút bỏ dịch nổi, lặp lại bước rửa lần - Đánh dấu phân tích: + Hút 50 µl dung dịch SAPE 1X vào giếng, đậy phiến, trộn nhẹ; + Chuyển phiến vào máy ủ nhiệt, ủ phiến 60oC phút; + Rửa phiến, chuyển vào hệ thống máy Luminex để đọc; + Chạy máy theo chương trình phân tích kết dựa theo phần mềm kèm với kít Trả kết quả: - Ghi kết vào phiếu sổ xét nghiệm; - Ký duyệt kết cho phận định Thu dọn dụng cụ, vệ sinh máy XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization) XÁC ĐỊNH NHIỄM SẮC THỂ X, Y DETECTION OF X,Y CHROMOSOMES BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION I NGUYÊN LÝ Nguyên lý chung: xem “ Quy trình xét nghiệm gen kỹ thuật FISH” Dựa đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định nhiễm sắc thể X, Y sử dụng probe đoạn ADN có gắn huỳnh quang có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu cho đoạn ADN nhiễm sắc thể X, Y để lai ghép với đoạn ADN tương đồng nhiễm sắc thể X Y Từ đó, phát nhiễm sắc thể cách xác II CHỈ ĐỊNH Xét nghiệm định cần xác định giới tính xác định mọc mảnh ghép sau ghép khác giới tính III CHỐNG CHỈ ĐỊNH Khơng có chống định IV CHUẨN BỊ Người thực hiện: Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền - Sinh học phân tử đào tạo Phương tiện, hóa chất 2.1 Phương tiện: - Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, kính hiển vi huỳnh quang; - Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100µl, 10µl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm 2.2 Hóa chất: - X/Y ADN Probe Kit Probe , DAPI/antifade; - Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC; - Dung dịch 2X SSC; - Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40; - Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40; - Cồn 70o, 85o, 100o Bệnh phẩm 2ml máu ngoại vi dịch hút tủy xương đựng bơm tiêm có tráng chất chống đơng heparin 5.000 đơn vị/ml V CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Xem “Quy trình xét nghiệm gen kỹ thuật FISH” VI NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ Quan sát kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, thấy màu: + Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào; + Màu xanh cây: màu probe gắn nhiễm sắc thể X; + Màu đỏ: màu probe gắn nhiễm sắc thể Y Nhận định kết quả: + Một tín hiệu đỏ, tín hiệu xanh: XY; + Hai tín hiệu đỏ: XX VII NHỮNG SAI SĨT VÀ XỬ TRÍ Xem “ Quy trình xét nghiệm gen kỹ thuật FISH” ĐỊNH LƯỢNG VIRUS CYTOMEGALO (CMV) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR I NGUYÊN LÝ Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân đoạn gen đặc trưng virus CMV kết hợp với việc bổ sung taqman probe - chất phát huỳnh quang vào phản ứng PCR Dựa vào kiểm soát số lượng huỳnh quang tiêu tốn phản ứng với chuẩn AND-CMV biết trước nồng độ, phần mềm hệ thống tính tốn đếm số lượng virus CMV ban đầu có mẫu bệnh phẩm Chỉ định: - Xét nghiệm dùng để phát hiện/định lượng CMV mẫu máu người bị nghi ngờ nhiễm CMV - Chỉ định để chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh (với BN sau ghép quan) - Chỉ định để sàng lọc nguy mang mầm bệnh người cho quan ghép tạng II CHUẨN BỊ 2.1 Hóa chất sinh phẩm - Kít tách ADN hãng Qiagen gồm: buffer AL, Wash I, Wash II, proteinase K, cột lọc - Kít định lượng CMV Nam Khoa gồm: standar 103, 104,105, CMV mix, HBG mix, IC control, chứng trắng 2.2 Vật tư - trang thiết bị - Máy ly tâm eppendoft - Máy ủ nhiệt - Máy vortex - Box vô trùng - Đầu 1ml, 200µl, 20 µl vơ trùng , free-nuclease - Ống eppendoft 1,5 ml, 0,2ml vô trùng , free-nuclease - Pipetman 1ml, 200µl, 20 µl 2.3 Bệnh phẩm - 2ml máu toàn phần đựng ống chống đông EDTA III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Tách ADN - Quan sát, đối chiếu cẩn thận tên ống máu giấy xét nghiệm - Dùng pipet hút 200µl máu vào eppendoft vơ trùng - Bổ sung 20µl proteinase K, trộn nhẹ nhàng hút đẩy - Thêm 200 µl dung dịch AL, vortex 10 giây - Ủ 56oC 10 phút - Thêm 200 µl cồn 96o, lắc ngược nhẹ nhàng, không vortex - Chuyển hết dịch eppendoft sang cột lọc - Ly tâm cột 10.000v/p phút - Đổ bỏ hoàn toàn dịch ly tâm typ 2ml cột lọc - Thêm 500 µl dung dịch rửa AW1 vào cột lọc - Ly tâm cột 10.000v/p phút - Đổ bỏ hoàn toàn dịch ly tâm typ 2ml cột lọc - Thêm 500 µl dung dịch rửa AW2 vào cột lọc - Ly tâm cột 10.000v/p phút - Đổ bỏ hoàn toàn dịch ly tâm typ 2ml cột lọc - Đăt cột lọc lên ống 2ml - Ly tâm cột lọc 14.000v/p phút - Đặt cột lên ống eppendoft ghi tên người bệnh - Nhỏ 100 µl nước vơ trùng vào cột lọc - Ly tâm cột 14.000v/p phút - Thu dịch ADN ống eppendoft - Bảo quản -200 chưa sử dụng Thực phản ứng Real-time PCR - Đưa thành phần kit định lượng nhiệt độ phòng 10 phút để rã đơng hồn tồn - Trộn kỹ vortex ống standar 103, 104,105, IC control - Trộn nhẹ nhàng lắc ngược ống CMV-mix, HBG mix - Lấy ống eppendoft 0,2 ml đánh số thứ tự S1, S2, S3, Nev-HBG, NeCMV, BN-HBG, BN- CMV - Nhỏ 5µl standar nồng độ 103, 104,105 tương ứng vào ống S1, S2, S3 - Nhỏ 5µl IC control vào ống Nev-HBG, Ne-CMV, BN-HBG, BNCMV - Nhỏ 5µl chứng trắng vào ống Nev-HBG, Ne-CMV - Nhỏ 5µl AND người bệnh cần xét nghiệm vào ống BN-HBG, BNCMV - Nhỏ 20µl HBG-mix vào ống Nev-HBG, BN-HBG - Nhỏ 20µl CMV-mix vào ống S1, S2, S3, Ne-CMV, BN- CMV - Trộn nhẹ nhàng tất ống tay - Spin down 10 giây - Đặt ống vào máy Real-time PCR CFX 96 cài đạt sơ đồ giếng theo thứ tự đặt máy - Chọn chương trình nhiệt CMV protocol - Chọn nơi lưu kết CMV result - Bấm start để máy chạy Chương trình chạy kết thúc sau 1h 40 phút IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ Kết phản ứng Real-time PCR hiển thị lên hình kết thúc chương trình chạy: - Nếu mẫu âm tính, trả kết âm tính kèm với hình ảnh chạy ghi “Ngưỡng phát 102 copies/ml máu” - Nếu mẫu dương tính lấy số lượng virus kết hình máy tính nhân với 50 (độ pha lỗng) trả kết hình ảnh chạy kèm theo số lượng virus tính sau nhân với độ pha loãng BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài điều trị bệnh Lơ xê mi cấp dòng tủy I Phần hành chính: 1.1 Người nhận: - Họ tên:………………………………… - Tuổi:………… Giới:…………… - Địa chỉ:………………… …………………………………………………… - Điện thoại liên hệ: …………………………………………………………… 1.2 Người hiến tế bào gốc: - Họ tên:…………………………………- Tuổi:………… Giới:…………… - Mã hồ sơ:…………………………………………………………………… - Địa chỉ:……………………………………………………………………… - Điện thoại liên hệ:……………………………………………………… … 1.3 Đơn vị máu dây rốn: - Mã số: ……………………………………………………………………… 1.4 Ngày vào viện:………………….Ngày ghép:…………………………… 1.5 Ngày viện:……………… Mã hồ sơ:…….…………………………… II Các đặc điểm nghiên cứu: 2.1 Đặc điểm người hiến anh chị em ruột: - Số lượng người cho (để tìm người phù hợp nhất):………………… …… - Virus viêm gan:……………………………………………………………… - Nhóm máu:…………………………………………………………………… - Bệnh lý kèm theo:…………………………………………………………… - Diễn biến huy động tế bào gốc: Thông số Số lượng BC BC đa nhân Uric/LDH XN khác Lâm sàng D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 - CD34+ trước ghép:… … ….sau gạn:………….sau bảo quản:.…………… - Số lần gạn:……………… … - Thể tích lần gạn:…… ……………… - Điều kiện bảo quản tế bào gốc:………….…………………………………… - Tỷ lệ tế bào sống/chết sau bảo quản:………….…………………………… Tác dụng phụ tiêm G-CSF Có Khơng Có Khơng - Đau xương/cơ - Đau đầu - Tăng LDH - Lách to - Tăng huyết áp - Tăng acid uric Tác dụng phụ trình gạn TBG - Đau đầu - Rét run - Tê vùng môi - Chuột rút 2.2 Đặc điểm đơn vị tế bào gốc máu dây rốn: - Virus viêm gan:……………………………………………………………… - Nhóm máu:…………………………………………………………………… - Tổng phân tích tế bào máu: ……………………………………… - Điện di huyết sắc tố: ………………………………………………………… - HLA: ………………………………………………………………………… - Tế bào CD34(+): …………………………………………………………… - Thể tích: …………………………………………………………………… 2.3 Đặc điểm người nhận: 2.3.1 Đặc điểm chung trước ghép: - Chẩn đốn: Nhóm tiên lượng - Đợt lui bệnh: - Thời gian từ lúc chẩn đoán bệnh đến ghép (tháng): - Thời gian ghép đến kết thúc nghiên cứu (tháng /20 ): - Viêm gan: Khơng: Có: - Bệnh lý khác: - Mức độ phù hợp HLA: - Bất đồng nhóm máu hệ ABO: - Phác đồ điều kiện hoá: - Liều tế bào gốc truyền/kg - Dự phịng aGVHD (CSA+MTX): Khơng: Có: 2.3.2 Biến chứng sau ghép: 2.3.2.1 Biến chứng ghép chống chủ: Thời gian Vị trí Mức độ Điều trị Đáp ứng Có Khơng aGVHD cGVHD 2.3.2.2 Các biến chứng khác: Biến chứng - Viêm bàng quang chảy máu - Nhiễm trùng - Xuất huyết - VOD - Hội chứng mọc mảnh ghép - CMV tái hoạt động - Tái phát (D+) 2.3.2.3 Biến chứng CSA Biến chứng cyclosporin A Có Khơng Có Khơng - Tăng huyết áp - Phì đại lợi - Tăng Bilirubin máu - Giảm magie - Rối loạn chuyển hóa lipid máu - Đau tay chân, co giật - Tổn thương thận 2.3.2.4 Biến chứng muộn Biến chứng - CMV tái hoạt động - Nhiễm trùng muộn - Tái phát - cGVHD - Rối loạn nội tiết - Ung thư thứ phát 2.3.3 Kết ghép: - Thời gian tế bào hồi phục (ngày): TB hồi phục D1 D5 D8 D12 D15 D30 D60 D90 ANC tăng > 0,5G/l Tiểu cầu >20* * không truyền tiểu cầu ngày liên tiếp - Kết thời điểm D+30, 90, 180: + Tổng phân tích tế bào máu:…………………………………………… + Chimerism: Máu toàn phần………………… T cell……………………… + Tủy đồ:…………………………………………………………………… + Sinh thiết tủy xương:…………………………………………………… + Di truyền: Công thức NST…………………… FISH X/Y……………… + Sinh học phân tử (gen lơ xê mi): …………………………………………… - Kết sinh hóa: Kết sinh hóa Bilirubin máu LDH Creatinin Magie Lipid máu Acid uric Nồng độ CSA D1 D3 D7 D10 D15 D18 DANH SÁCH BỆNH NHÂN ST T Họ tên bệnh nhân Giới Giang Thị Thanh H Lê Thị Ph Nguyễn Quang H Nguyễn Thị Ngọc Đ Địa Nữ Năm sinh 1987 Nữ Nam 1968 1976 Hà Nội Nam Định Nữ 1989 Hà Nội Hà Nội Nguyễn Thị Thanh H Vũ Thị Nh Trần Thị Bích Ng Nguyễn Khắc L Nguyễn Thị Phương A 10 Nguyễn Đình Nam Tr Nữ Nữ Nữ Nam Nữ 1989 1982 1977 1992 1995 Bắc Giang Nam Định Hà Nội Nghệ An Ninh Bình Nam 2003 Hà Nội 11 12 13 14 15 Nữ Nam Nam Nam Nam 1984 1972 1965 1977 1977 Hà Nội Hải Dương Hà Nam Hà Nội Hà Nội Nam 1975 Hải Phòng Nữ 1985 Nam 1965 Tuyên Quang Hà Nội 19 Hồng Thị Thùy L Nữ 1986 Quảng Bình 20 Hà Thị H Nữ 1979 Bình Phước Nam 1976 Bắc Giang Đoàn Thị Thanh Th Bùi Mạnh Ph Trương Văn Th Trịnh Huỳnh H Lê Minh Ng 16 Nguyễn Duy Tr 17 Trần Thị Th 18 Vũ Duy H 21 Nguyễn Văn Đ Ngày ghép 09/09/201 25/9/2012 16/11/201 11/01/201 08/3/2013 13/3/2013 29/5/2013 03/6/2013 01/11/201 21/11/201 18/2/2013 12/6/2014 22/7/2014 01/8/2014 17/10/201 21/10/201 11/11/201 02/12/201 30/12/201 08/01/201 09/3/2015 ST T 22 23 24 25 Họ tên bệnh nhân Giới Lê Huyền Tr Nguyễn Hoàng H Huỳnh Trần Bảo Tr Lê Thị H Nữ Nam Nữ Nữ Xác nhận Giáo viên hướng dẫn GS.TS Nguyễn Anh Trí Năm sinh 1989 1989 1998 1985 Địa Hà Nội Hà Nội Đà Nẵng Hà Nội Ngày ghép 15/4/2015 29/5/2015 25/9/2015 12/10/201 Xác nhận Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương