Untitled ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157 H7 TRONG THỊT BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU PHẠM[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU PHẠM THỊ TÂM CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y M Tính c p thi t c a V n U tài v sinh an toàn th c ph m Vi t Nam ang c Chính ph h u h t Ngành, c p ngư i tiêu dùng quan tâm G n ây báo chí thư ng xuyên lên ti ng ph n i vi c s d ng hormone, kháng sinh, thu c b o v th c v t không úng m c ích khơng phù h p v i qui nh hư ng nguy hi m lòng ngư ng quy nh, gây n s c kho ngư i Vi c phát hi n th y ch t sudan tr ng gà, melamin s a, kim lo i n ng g p nhi u l n so v i nh nh ng h i chuông c nh báo cho s m t an toàn c a th c ph m ang lưu hành t i Vi t Nam Theo s li u th ng kê c a C c V sinh An toàn Th c ph m – B Y T , n m 2010 c nư c ã x y 132 v ng c th c ph m v i 4.676 ngư i m c b nh, 3.281 ngư i nh p vi n có 41 trư ng h p t vong Nguyên nhân vi khu n (Salmonella, Streptoccocus, E coli Staphylococcus); c t t nhiên hóa ch t) [2] E.coli O15:H7 m t ch ng vi khu n nguy hi m gây ng th c ph m c nhi u qu c gia th gi i v i h i ch ng: tiêu ch y, viêm ru t xu t huy t, urê huy t (Haemolytic ureamic syndrome-HUS) Th t bò s n ph m ch bi n t! bò nh ng lo i th c ph m có nguy cao nhi#m vi khu n E.coli O15:H7 Theo báo cáo c a Griffin P.M, (1995) [47], 3,7% m$u th t bò vùng Nam M% nhi#m vi khu n E.coli O15:H7 & Châu Á, E.coli O157:H7 ã c phát hi n Nh t B n, Trung Qu c, 'n ( , Malaysia (Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133] & Vi t Nam, vi khu n c phát hi n th y phân bò v i t) l 2% (Norobu c ng s , 2005) [90] Bên c nh ó, nghiên c u c a tác gi nư c ã phát hi n th y gen ct i n hình c a vi khu n E.coli O157:H7 th t bò, th t l n, phân bò, phân l n v i t) l m$u nhi#m cao (Ph m Công Ho t c ng s , 2003) [3], (Tr n Thanh Phong c ng s , 2007) [5] Như v y, v i i u ki n ch n nuôi v sinh gi t m* m t v sinh, thi u ki m soát hi n c bi t i u ki n Vi t Nam nguy nhi#m vi khu n E.coli O157:H7 vào lo i th c ph m gây ng c th c ph m cho ngư i tiêu dùng r t d# x y V i m c ích xác nh s có m t c a vi khu n th t bị ng cơng tác phịng, i u tr b nh ng kháng th ơn dòng ph c v ch t o kit xác ti n hành th c hi n tài: “ Xác th t bò bán m t s kháng th ơn òng M c tiêu c a - Xác ch c th c ph m s n xu t nh nhanh vi khu n, nh t l nhi m Escherichia coli O157:H7 a i m t i Hà N i, nghiên c u s n xu t c hi u” tài nh c t) l nhi#m E.coli O157:H7 th t bò bán m ts a i m t i Hà N i; - S n xu t c kháng th ơn dòng c hi u c a vi khu n E.coli O157:H7 Ý ngh a khoa h c th c ti n c a tài 3.1 Ý ngh a khoa h c - Vi c xác nh c t) l nhi#m vi khu n E.coli O157:H7 tính sinh hóa c+ng t# h-c c a h i ch ng ng s c l c c a vi khu n s, s xác c nh d ch c th c ph m vi khu n gây ra, t! ó t o xây d ng bi n pháp phịng ng!a q trình nhi#m th c ph m i u tr b nh vi khu n gây nên - ( tài ã ưa c quy trình ch t o kháng th v i vi khu n E.coli O157:H7 có th huy t h-c xác ng d ng nh vi khu n ơn dòng c hi u s n xu t kit ch n oán 3.2 Ý ngh a th c ti n - ( tài ã xác th t bị bán nh c s có m t c a vi khu n E.coli O157:H7 Hà N i m t s vùng ph c n, ng th i ch ng minh c kh n ng gây b nh c a ch ng - ( tài ã ch t o c kháng th ơn dòng c hi u 100% v i vi khu n E.coli O157:H7 Hai kháng th ã c s d ng nghiên c u t o ph c h p kháng th h t nano silica phát hi n s lư ng vi khu n E.coli O157:H7 Vi n Công ngh sinh h-c ch trì th c hi n - Vi c xác nh c vi khu n E.coli O157:H7 s n xu t kháng th ơn dòng ph c v ch t o kit phát hi n vi khu n s, góp ph n tích c c cơng tác m b o v sinh an toàn th c ph m Nh ng óng góp m i c a K t qu c a tài tài hoàn toàn m i - ( tài c th c hi n v i nhi#m th t bò ch ng Vi t Nam, v i lý do: i tư ng vi khu n E.coli O157:H7 c tính gây i n hình K t qu c a u tiên cho s có m t c a vi khu n th t bò tài minh Hà N i vùng ph c n -L n u tiên Vi t Nam ch t o c kháng th c a vi khu n E.coli O157:H7 ơn dịng ng d ng vào quy trình xác th c ph m ch n oán cho b nh nhân ng c hi u nh vi khu n c th c ph m Escherichia coli (E.coli) vi khu n thư ng trú ng ru t c a ngư i ng v t máu nóng H u h t ch ng E.coli vô h i Tuy nhiên, s suy gi m mi#n d ch ho c có s t*n thương niêm m c ng tiêu hoá mà c ch ng E.coli thơng thư ng c+ng có th gây b nh V i ch ng gây b nh, vi khu n có th xâm nh p vào th thông qua b m t màng nhày niêm m c ho c da gây nên h i ch ng lâm sàng ch y u, bao g m: i) nhi#m khu n ng ti t ni u, ii) nhi#m trùng huy t ho c viêm màng não, iii) viêm ru t, tiêu ch y Theo th ng kê c a James Nataro c ng s , (1998) [53], ch ng vi khu n E.coli gây b nh c chia thành nhóm ( ph l c b ng 1) + Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): g m ch ng E.coli gây viêm ru t, tiêu ch y tr em dư i tu*i (Polotsky c ng s , 1977) [106] + Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): g m ch ng E.coli ti t c t ru t b n nhi t (heat stable toxin- ST) (heat-labile enterotoxin- LT) Trong , c t ru t không b n nhi t c t LT ho t hóa men adenyl cyclase t bào ru t làm gia t ng y u t C.AMP (cyclic adenozin 5’ monophosphat) Y u t s, kích thích ion Cl- bicarbonat tách kh i t bào ng th i c ch Na+ bên t bào, gây hi n tư ng kéo nư c t! t bào, mơ vào lịng ng tiêu hóa h u qu gây tiêu ch y m t nư c Cịn ct ST ho t hóa men guanyl cyclase làm t ng y u t C.GMC (cyclic guanosin 5’ monophosphat) bên t bào d$n tiêu ch y Nh ng n kích thích ti t mu i nư c gây E.coli có c lo i n i c t LT ST s, gây tiêu ch y tr m tr-ng kéo dài (Levine c ng s , 1987) [70] + Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): nh ng ch E.coli bám lên niêm m c làm bong tróc gây loét niêm m c ó gây tiêu ch y l$n máu (gi ng tri u ch ng b nh l vi khu n Shigella) (DuPont c ng s , 1971) [35] + Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): nhóm E.coli gây tiêu ch y khơng s n sinh c t (Cravioto c ng s , 1979) [29] + Nhóm EHEC: nhóm E.coli gây tiêu ch y xu t huy t, khu n E.coli O157: H7 Vi khu n gây b nh i di n vi ngư i v i tri u ch ng c p tính như: tiêu ch y c p, xu t huy t ng tiêu hoá, phân có l$n máu, gây h i ch ng ure huy t (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trư ng h p nghiêm tr-ng có th gây t vong 85-95% ca b nh nhi#m E.coli O157:H7 có bi u hi n h i ch ng urê huy t (Riley c ng s , 1983) [119] E.coli O157:H7 vi khu n nh t thu c loài E.coli nh t gây ng c th c ph m ngư i Theo c tính c a CDC, (1999) [26], hàng n m s ca nhi#m vi khu n E.coli O157:H7 t i nư c chi m kho ng 20.000 ngư i, ó, kho ng 250 trư ng h p t vong Nguyên nhân c a tình tr ng ng c E.coli O157:H7 nhi#m nư c u ng, rau xanh, th t bò s n ph m th c ph m có ngu n g c t! bò Theo tác gi Faith c ng s , (1996) [39], Hancock c ng s , (1994) [48], t) l E coli O157:H7 gia súc non l n gia súc trư ng thành Còn theo nghiên c u c a Doyle c ng s , (1997) [34] cho bi t: E coli O157:H7 có m t 3,7% m$u th t bò bán l , 1,5% m$u th t l n, 1,5% m$u th t gà, 2% m$u th t c!u Bên c nh ó, nghiên c u khác c a Le Saux c ng s , (1993) [68], c+ng ch ng minh r/ng vi khu n E coli O157:H7 nhi#m th t bò tái, s a tươi bánh humburger nguyên nhân gây nhi u v ng c th c ph m M% Canada Ngoài ra, ngư i ta c+ng ã xác c s có m t c a vi khu n nh s t mayonaire (Griffin, 1995) [47], nư c hoa qu chưa trùng (Besser c ng s , 1993) [14], (Mc Carthy, 1996) [78] rau s ng (Morgan, 1988) [83] & Vi t Nam, m c dù chưa có báo cáo v s trư ng h p ng c th c ph m E.coli O157:H7, nhiên, theo báo cáo c a Noboru c ng s , (2005) [90], 2/100 m$u phân bị ni t i Vi t Nam có m t vi khu n Theo m t s nghiên c u c ng s , (2003) [3] ã xác nư c c a tác gi như: Ph m Công Ho t nh c 8/33 m$u phân l n tiêu ch y nhi#m c t Stx c a vi khu n E.coli O157:H7 Còn nghiên c u c a tác gi Tr n Thanh Phong c ng s , (2007) [5], gen ct c trưng c a vi khu n E.coli O157:H7 Stx1, Stx2, eae, hly, stb c phát hi n th y th t bò, th t l n, phân bò, phân l n bình thư ng tiêu ch y v i t) l tương i cao, c th : có t i 50% m$u phân bê tiêu ch y, 57,1% m$u phân bị bình thư ng, 55,9% m$u th t bị mang l n có n gen cl c c trưng c a nhóm EHEC; cịn n 33,3% m$u phân l n tiêu ch y, 62,5% m$u phân l n cai s a tiêu ch y, 20% m$u phân l n bình thư ng, 24,5% m$u th t l n mang 1.2 Các 1.2.1 n gen cl c c trưng c a nhóm EHEC c tính c a vi khu n E.coli O157:H7 c tính sinh h c 1.2.1.1 ( c i m hình thái E.coli O157: H7 tr c khu n hình que ng n, b t màu gram âm, kích thư c t bào kho ng 2x0,5µm, khơng hình thành nha bào, có lơng roi, có kh n ng di ng Khu n l c vi khu n d ng S, trịn trơn, bóng, có l p màng bao b-c, g n ch t b m t môi trư ng th ch, khu n l c có màu nâu nh t môi trư ng th ch Sorbitol MacConkey(SMAC) 1.2.1.2 ( c tính ni c y Khác v i h u h t ch ng E.coli khác, E.coli O157:H7 không lên men ng D-sorbitol, ó, môi trư ng th ch Sorbitol MacKonkey c s d ng làm môi trư ng c hi u phân bi t vi khu n (March c ng s , 1986) [77] Trên môi trư ng SMAC, vi khu n E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nh t ch ng vi khu n E.coli khác có màu h ng cánh sen Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 khơng sinh enzyme βglucuronidase, ó mơi trư ng có b* sung ch t 4- methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG), vi khu n không phát quang, vi khu n E.coli khác l i có kh n ng ó Vì v y, ngư i ta có th phân bi t c khu n l c E.coli O157:H7 môi trư ng th ch MUG dư i ánh sáng t ngo i Ngoài ra, khu n l c E.coli O157:H7 có th phân bi t c môi trư ng Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., M%) ho c Fluorocult E.coli O157 (Merck, ( c) Trên mơi trư ng th ch Fluorocult® khu n l c c a vi khu n có màu xanh nh t E.coli khác có màu vàng Cịn mơi trư ng th ch Rainbow, khu n l c vi khu n E.coli O157 có ph* màu en, xám, , xanh, tím 1.2.1.3 S c kháng + Nhi t : kh n ng thích ng v i nhi t c a vi khu n E.coli nhóm EHEC, bao g m c ch ng E.coli O157:H7 tương t v i nhóm khác Theo Doyle c ng s , (1984) [32], ch ng vi khu n b c ch i u ki n 440C Tuy nhiên, Palumbo c ng s , (1995) [99] l i cho bi t, kh n ng thích ng v i nhi t c a E.coli O157:H7 ph thu c vào môi trư ng nuôi c y: môi trư ng BHI (Brain Heart Infusion), vi khu n v$n phát tri n t t nhi t nhi t 450C, cịn v i mơi trư ng EC (E.coli) chúng l i b c ch 440C Theo Buchanan c ng s , (1994) [21], Rajkowski c ng s , (1995) [108], nhi t t i thi u cho s sinh trư ng c a vi khu n E.coli O157:H7 kho ng 8-100C + pH: theo Buchanan c ng s , (1992) [20], pH thích h p cho vi khu n E.coli O157:H7 5,5-7,5 Vi khu n b c ch m nh m c pH 4,0-4,5, nhiên nh hư ng c a pH t i s phát tri n c a vi khu n ph thu c vào y u t có liên quan khác như: th i gian, nhi t axit, n ng axit s d ng chu n nuôi c y, lo i môi trư ng (Leyer c ng s , 1995) [71] Còn theo nghiên c u c a Benjamin c ng s , (1995) [13], Buchanan c ng s , (1996) [22], ch ng vi khu n thu c nhóm EHEC có kh n ng ch u c pH 2,5 2-7 gi 370C Trong lo i th c ph m lên men nư c ép trái cây, mát, E.coli O157:H7 có th t n t i sau vài tháng Tuy nhiên, kh n ng s ng sót c a vi khu n ph thu c nhi u vào th i gian b o qu n, ví d : nư c ép hoa qu vi khu n có th t n t i t! 2-3 ngày 250C, 80C, vi khu n ch0 t n t i t! 10-30 ngày (Zhao c ng s , 1993) [148] + Kh n ng ch u m n: theo Buchanan c ng s , (1994) [22], vi khu n E.coli O157:H7 có th ch u c n ng 1.2.2 mu i t! 0,5-5% c tính sinh hố Ki m tra c tính sinh hóa c a vi khu n E.coli O157:H7 c th c hi n sau bư c nuôi c y vi khu n môi trư ng c hi u SMAC Các khu n l c có màu vàng nâu nh t c c y chuy n lên môi trư ng th ch LB (Luria Agar), sau 18 gi nuôi c y 420C, thu nh n khu n l c làm ph n ng sinh hóa b ng 1.1 ng riêng r, B ng 1.1 Các ph n ng sinh hoá c a vi khu n E.coli O157:H7 ( Samuel c ng s , 1998) [122] Ph n ng 1-Glucuronidase Sorbitol Salicin Esculin Arginine dihydrolase Adonitol Inositol Cellobiose Urease Citrate KCN Sucrose Glucose (acid) Glucose (gas) Indol Arabinose Trehalose Mannitol Lactose Maltose Rhamnose Xylose Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Raffinose Dulcitol K t qu ph n ng + + + + + + + + + + + + + + + Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính 143 Sbjct 787 728 AAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA Query 848 789 TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG Sbjct 847 788 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG Query 908 849 CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA Sbjct 907 848 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA Query 968 909 AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC Sbjct 967 908 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC Query 1028 969 AACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC Sbjct 1027 968 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC Query 1088 1029 CTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG Sbjct 1087 1028 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG Query 1148 1089 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAAC Sbjct 1147 1088 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAAC Query 1208 1149 TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCGTCATGG Sbjct 1207 1148 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG Query 1268 1209 CCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGC Sbjct 1267 1208 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGC Query 1328 1269 GAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGGGTGGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGGCTC Sbjct 1327 1268 ||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||| ||| GAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTC 144 Query 1388 1329 CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG Sbjct 1387 1328 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG Query 1448 1389 CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAGGAAGTAGGTAGCTTAA Sbjct 1447 1388 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAA Query 1508 1449 CCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTA Sbjct 1507 1448 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| CCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA Query 1509 Sbjct 1508 GCCGTA ||||| ACCGTA 1514 1513 Hình So sánh trình t gen 16s ARNr c a vi khu n E.coli O157:H7 M61 v i trình t c a GeneBank ( mã s : EU118103.1) Hình Chai ni c y t bào VERO ki m tra c t c a E.coli O157:H7 Hình Ki m tra b nh tích t bào VERO c t vi khu n 145 Hình Hình nh ni c y t bào lai sau tách dịng Hình Hình nh t bào u t y chu t dịng Sp 2/0-Ag14 Hình Hai khu n l c t bào lai c9ng m t gi ng ni sau tách dịng ( gi ng lai b lo i) 146 Hình 10 Khu n l c t bào lai sau tách dòng III Các lo i mơi trư!ng, hóa ch t thí nghi m Hóa ch t dùng tách chi t DNA plasmid t vi khu n Dung d ch sol I (glucose 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM, EDTA (pH 8,0) 10 mM), dung d ch sol II (sodium dodecyl sulfat (SDS) 1%, NaOH 0,2 M), dung d ch III (potassium acetate M pH 5), RNase 10 mg/ml Hóa ch t dùng cho ph n ng t o dòng Dung d ch CaCl2 100 mM l nh, NdeI, SalI (Fermentas), T4 DNA ligase (Fermentas) Hóa ch t dùng cho c m ng bi u hi n protein Dung d ch IPTG (isopropylthio-&-D-galactoside) 100 mM (gi -20oC) (Fermentas) Hóa ch t dùng cho i n di protein - Gel phân tách (separating gel), acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O, ml acrylamide 30 %, 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 0,1 ml SDS 10 %, 0,1 ml APS 10 %, 30 µl TEMED - Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %, 0,5 ml Tris-HCl 1M (pH 6,8), 0,04 ml SDS 10 %, 0,04 ml APS 10 %, 16 µl TEMED 4oC): SDS 10 % (w/v), DTT 10 mM, Tris-HCl (pH 6,8) - Dung d ch n p m$u 5X (gi 0,2 M, glycerol 20 % (v/v), bromophenol blue 0,05 % - Dung d ch i n di 5X (gi thêm dH2O cho phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; g SDS ; nhi t phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue, 112,5 ml l - Dung d ch nhu m gel (gi ethanol t nhi t i, 25 ml glacial acetic acid ; thêm dH2O cho - Dung d ch gi i nhu m (gi 100 ml ethanol t nhi t i, 800 ml dH2O 250 ml phòng): 100 ml glacial acetic acid, 147 Hóa ch t dùng cho Western blot - Dung d ch i n chuy n 1X (gi methanol, thêm dH2O cho 4oC): 3,03 g Tris-base, 14,41 g glycine, 200 ml l - Dung d ch TBS 1X: 0,605 g Tris-base, 4,39 g NaCl, thêm dH2O 500 ml - Dung d ch TBST (dung d ch r a): TBS + Tween 20 (1 %) - Dung d ch khóa màng (membrane blocking): TBST + s a g y (5 %) - Kháng th a dòng kháng IgG chu t ánh d u horseradish peroxidase (Santa Cruz biotechnology) - Dung d ch ly gi i t bào (b o qu n -20oC): Tris HCl 10 mM pH 7.4, NaCl 50 mM, Triton X100 1%, Na3VO4 (sodium orthovanadate) mM, NaF (sodium fluoride) 50 mM, Na4P2O7 (tetrasodium pyrophosphate) 25 mM, EDTA mM, Pepstatin 10 µg/ml, Protease inhibitor viên/50 ml dung d ch ly gi i - Phim, dung d ch developer fixer (Kodak) Hóa ch t dùng ELISA ki m tra áp ng mi n d ch c a ng v t Dung d ch PBS 1X (KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 10 mM, KCl 2,7 mM; NaCl 137mM), dung d ch PBS – BSA % (PBS 1X + BSA % (w/v), dung d ch PBS – Tween 0,05 % (v/v), kháng IgG th /chu t ánh d u HRP (horseradish peroxidase) (Dako), dung d ch TMB (3,3´,5,5´- tetramethylbenzidine) (Kem-En-Tec), dung d ch H2SO4 0,18 M Hóa ch t dùng cho dung h p t o t bào hydridoma: PEG 1500 (Sigma), dung d ch NH4Cl 0,17 M, HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma) Hóa ch t dùng tinh s ch kháng th ơn dòng - C t Sepharose g n protein A (GE Health Care), dung d ch g n c t (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M), dung d ch dung gi i (glycine 0,1 M pH 2,8), dung d ch trung hịa 10 Mơi tr #ng - Mơi trư ng Luria-Bertani (LB): 10 g NaCl, 10 g bacto trypton, g cao n m men, hòa tan H2O, ch0nh pH 7, thêm nư c cho l H p kh trùng 121°C 30 phút - Môi trư ng LB + kanamycin : môi trư ng LB thêm agar 15 g/l, b* sung kanamycin t n ng cu i 30 µg/ml 148 - Môi trư ng MEM nuôi c y t bào (Sigma) 8,12 g/l, phenol mM, NaHCO3 0,4 %, L-glutamine 0,1125 %, HEPES 20 mM, amphotericin-B 0,025 µg/ml, penicillin G 100 UI/ml, streptomycin 100 µg/ml, huy t (FBS – fetal bovine serum) 10 %, ch0nh pH 7,2 - Môi trư ng DMEM b* sung HAT: môi trư ng DMEM (Gibco) b* sung dung d ch HAT 1X (Hypoxanthine x 10-4M, Aminopterin x 10-7 M, Thymidine 1,6 x 10-5 M) 149 i L:I CAM OAN Tơi xin cam oan ây cơng trình nghiên c u c a Các s li u k t qu nghiên c u lu n án hoàn toàn trung th c chưa c cơng b b t k5 cơng trình khác M-i thơng tin trích d$n lu n án c ch0 rõ ngu n g c TÁC GI/ LU*N ÁN Ph m Th Tâm 150 ii L:I C/M ƠN Trong trình th c hi n ( tài hồn thành lu n án, tơi ã nh n c s quan tâm giúp c a Khoa Sau i h-c, Khoa Ch n nuôi- Thú y, B môn Vi sinh v t B nh lý Trư ng (HNL - ( i h-c Thái Nguyên th y cô giáo, ng nghi p c a Trư ng (HNL Thái Nguyên ( ng th i, c+ng nh n c s giúp nhi t tình c a Ban lãnh o t p th cán b Vi n Cơng ngh sinh h-c, Phịng thí nghi m T bào g c, trư ng (H Khoa h-c T nhiên Thành ph H Chí Minh Tơi xin trân tr-ng c m ơn t i nh ng s quan tâm giúp q báu ó Tơi xin bày t lịng bi t ơn sâu s c t i Th y hư ng d$n khoa h-c: TS Ph m Công Ho t, B Khoa h-c Công ngh ; PGS.TS Tô Long Thành, Giám c Trung tâm Ch n oán Qu c giaC c Thú y, B Nông nghi p Phát tri n nông thôn Hai Th y ã t n tình hư ng d$n tơi th c hi n tài t o m-i i u ki n giúp tơi hồn thành Lu n án Tơi xin bày t lòng bi t ơn t i s giúp c a th y, cô: PGS.TS Nguy#n Th Kim Lan, Khoa Sau i h-c, trư ng (HNL Thái Nguyên ã ng viên, nh c nh , t o i u ki n cho tơi hồn thành Lu n án này; PGS.TS.Tr n Th H nhH i Thú y, GS.TS Nguy#n Quang Tuyên- trư ng (HNL Thái Nguyên ã t n tình giúp tơi q trình hồn thành Lu n án; Ths Phan Kim Ng-c- Giám c Phịng thí nghi m T bào g c trư ng (H KHTN Thành ph H Chí Minh, PGS.TS (inh Duy Kháng – Vi n CNSH ã t o i u ki n s v t ch t, phịng thí nghi m cho th c hi n ( tài; PGS.TS T ng Kim Thu n- Vi n CNSH ã giúp tơi kinh phí th c hi n nhánh tài s n xu t kháng th ơn dòng c a vi khu n E.coli O157:H7 Tôi xin chân thành c m ơn Ban giám hi u Vi n ( i h-c M Hà N i, ban Lãnh o toàn th cán b , gi ng viên Khoa CNSH, Vi n ( i h-c M Hà N i ã t o i u ki n, giúp , ng viên q trình làm vi c c+ng hồn thành Lu n án này; Tôi vô bi t ơn thành viên gia ình ã ln bên tơi su t q trình nghiên c u hồn thành lu n án Tôi xin trân tr ng c m n! NGHIÊN C-U SINH 151 v DANH M7C CÁC B/NG DANH M7C CÁC HÌNH /NH, ; TH6 Danh m c b ng báo cáo Trang B ng 1.1 Các ph n ng sinh hoá c a vi khu n E.coli O157:H7 B ng 1.2 B ng 1.3 B ng 3.1 Các c p m i s d ng cho ph n ng PCR- Multiplex phát hi n vi khu n E.coli O157:H7 Tr t t b ba axit amin gen fliC c a subtype kháng nguyên H7 vi khu n E.coli O157: H7 T) l nhi#m E.coli O157:H7 th t bò bán s m t a i m t i Hà N i B ng 3.2 Thành ph n ph n ng c t ADN plasmide B ng 3.3 B ng 3.4 B ng 3.5 B ng 3.6 B ng 3.7 B ng 3.8 B ng 3.9 So sánh m c tương ng c a trình t xác gen 16s nh gen c t c a vi khu n E.coli O157:H7 K t qu xác nh gen c t c a ch ng E.coli O157:H7 phân l p K t qu th ánh giá kh n ng gây áp ng mi#n d ch c a kháng nguyên K t qu ki m tra kh n ng phát hi n c hi u kháng nguyên c a kháng th t o thành th K t qu theo dõi thí nghi m nh hư ng c a li u lư ng kháng nguyên n áp ng mi#n d ch c a chu t K t qu theo dõi thí nghi m nh hư ng c a ch t b* tr n áp ng mi#n d ch c a chu t B ng ?nh hư ng c a lo i mu i n ng 3.10 phá v h ng c u lách chu t 18 26 60 67 ARNr thu c v i trình t c a GeneBank Các c p m i s d ng n kh n ng 69 71 71 78 80 82 85 88 152 B ng 3.11 B ng K t qu theo dõi nh hư ng c a y u t thí nghi m 91 n q trình dung h p t bào Phân tích mơ hình thí nghi m dung h p t bào 92 3.12 B ng K t qu thí nghi m nh hư ng c a y u t 3.13 trình sinh trư ng sinh kháng th c a t bào lai B ng K t qu tách dòng t bào lai sinh kháng th 3.14 dòng B ng 3.15 K t qu xác nh ơn 96 102 c hi u c a dòng kháng th c hi u v i kháng nguyên H7 c a vi khu n E.coli 105 O157:H7 (OD450) Danh m c b ng ph l c B ng Các ch ng vi khu n E.coli gây b nh i n hình B ng Kháng nguyên c a ch ng vi khu n E.coli B ng C u trúc c a kháng nguyên O m t s ch ng vi khu n E.coli gây b nh i n hình B ng Ph n ng chéo gi a ki u kháng nguyên O c a E coli B ng Ph n ng chéo gi a kháng nguyên O c a E coli v i vi khu n khác B ng Thành ph n c u t o c a m t s lo i kháng nguyên K thu c nhóm vi khu n E.coli O8, O9, O101, O20 B ng C u trúc c a m t s lo i kháng nguyên K c a vi khu n E.coli thu c nhóm O8, O9, O101, O20 B ng Thành ph n c u t o c a m t s lo i kháng ngun K khơng thu c nhóm vi khu n E.coli O8, O9, O101, O20 ơn dòng B ng S phát tri n nghiên c u v kháng th B ng 10 Thành ph n ph n ng PCR B ng 11 Thành ph n ph n ng n i ghép s n ph m PCR vector pBT 153 B ng 12 Thành ph n ph n ng c t o n DNA b/ng enzym Bam HI B ng 13 Thành ph n gel SDS-PAGE Hình nh báo cáo Trang Hình 1.1 C u trúc c a Hình 1.2 C u trúc b n c a LPS 20 Hình Sơ gen mã hố kháng ngun O157 23 Hình 1.4 C u trúc b m t tiên mao c a vi khu n E.coli 23 Hình 1.5 Sơ gen t*ng h p kháng nguyên H7 25 Hình 1.6 Sơ gen c a ch ng vi khu n E.coli K12 30 Hình 1.7 Các lo i kháng th Hình 3.1 Hình 3.2 c t Stx ch gây b nh 14 ơn dịng tái t* h p Các hình nh sinh hóa 40 nh typ b/ng kháng huy t c a vi khu n E.coli O157:H7 K t qu tách chi t ADN t*ng s c a ch ng vi khu n E.coli O157:H7 phân l p 61 63 Hình 3.3 K t qu ph n ng nhân o n gen 16s ARNr 63 Hình 3.4 Sơ 64 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 vector pBT Khu n l c vi khu n E.coli DH5α sau bi n n p vector tái t* h p K t qu tách chi t DNA plasmide t! khu n l c xanh, tr ng K t qu c t ADN plasmide b/ng enzyme Bam HI Hình nh tách ADN t*ng s c a vi khu n E.coli O157:H7 K t qu xác nh gen c t c a ch ng ct tách t! ch ng E.coli O157:H7 M61 (pha loãng 102) K t qu 67 68 70 72 E.coli O157:H7 phân l p Bi u hi n b nh tích t bào b gây nhi#m b i 66 i n di kháng nguyên c a vi khu n E.coli 74 77 154 O157:H7 gel SDS-PAGE Hình 3.12 Hình 3.13 ?nh hư ng c a i u ki n y u t dung h p n trình lai t bào ( i th c bào thu nh n t! * b ng chu t BALB/c làm t bào nuôi du ng 94 97 ?nh hư ng c a thành ph n b* sung vào mơi Hình 3.14 trư ng nuôi n kh n ng sinh trư ng sinh kháng 99 th c a t bào lai Hình 3.15 Hình 3.16 T bào lai gi ng c a phi n nh a 96 l3 Dòng t bào sau ngày tách dòng (trong phi n nh a 96 l3) Hình nh Hình 3.17 101 103 i n di kháng nguyên vi khu n E.coli O157:H7 gel SDS-PAGE Western blot v i 104 Mab C3.26.IV Bi u , ( th 3.1 ( th 3.2 ( th 3.3 ( th 3.4 th báo cáo Bi n thiên kháng th t o thành th c gây mi#n d ch Bi n thiên kháng th chu t c tiêm kháng nguyên H7 v i hàm lư ng khác Bi n thiên hàm lư ng kháng th c a chu t c tiêm ch t b* tr khác K t qu theo dõi trình sinh trư ng sinh kháng th c a dòng t bào lai 79 83 86 100 Hình nh ph l c Hình Th i gian bi u hi n b nh ngư i E coli O157:H7 Hình Các gen có liên quan Hình Sơ n c t c a vi khu n nhóm EHEC phân l p E coli O157:H7 155 Hình Trình t gen 16s ARNr c a vi khu n E.coli O157:H7 máy gi i trình t Perkin Elmer Hình Chai ni c y t bào VERO ki m tra Hình Ki m tra b nh tích t bào VERO Hình Hình nh ni c y t bào lai sau tách dịng Hình Hình nh t bào u t y chu t dịng Sp 2/0-Ag14 Hình Hình 10 c t c a E.coli O157:H7 c t vi khu n Hai khu n l c t bào lai c+ng m t gi ng nuôi sau tách dòng (gi ng lai b lo i) Khu n l c t bào lai sau tách dòng 156 iv DANH MEC CÁC CHF VIAT TGT ADN : Acid deoxyribonucleic ARN : Acid ribonucleic ARNr : Acid ribonucleic ribosome BHI : Brain Heart Infusion (TB : ( i th c bào E.coli O157:H7 : Escherichia coli O157:H7 EPEC : Enteropathogenic E.coli ETEC : Enterotoxigenic E.coli EIEC : Enteroinvasine E.coli EAEC : Enteroaggregative E.coli EHEC : Enterohaemorhagic E.coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid CDC : Center for Disease Control and Prevetion Cl : Clorua CFU : Colony Forming Unit ELISA : Enzyme Link Immunosorbent Assay FAO : Food and Agriculture Organization FDA : Food and Drug Administration FCA : Freund's Complete Ajuvant FCS : Fetal Carf Serum FIA : Freund's incomplete Ajuvant KIA : Kligler Iron Agar LB : Luria Agar LPS : Lipopolysaccharide Kda : Kilo Dalton 157 Kb : Kilobase HAT : Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine HT : Hypoxanthine, Thymidine JICA : Japan International Cooperation Agency Kháng nguyên O: Kháng nguyên thân Kháng nguyên H: Kháng nguyên lông Kháng nguyên K: Kháng nguyên giáp mô LT : heat-labile toxin HGKT : Hi u giá kháng th HUS : Haemolytic Ureamic Syndrome MDCS : mi#n d ch s Na : Natri OPI : oxaloacetate, pyruvate, bovine insulin PCR : Polymerase Chain Reaction PBS : Phosphate buffer saline PEG : polyethylene glycol SMAC : Sorbitol MacConkey ST : Heat stable toxin Stx : Shiga toxin TBL : t bào lai USDA : United States Department of Agriculture Wzx : Gen mã hóa kháng nguyên thân Wzy : Gen trùng h p kháng nguyên thân