Le Duy Toan ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ DUY TOÀN Tên đề tài NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF YB2 VÀO MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Ch[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ DUY TOÀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF-YB2 VÀO MỘT SỐ DỊNG NGƠ VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 n ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM LÊ DUY TỒN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF-YB2 VÀO MỘT SỐ DỊNG NGƠ VIỆT NAM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Cơng nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng (Viện Di truyền Nông nghiệp) Th.S Lương Thị Thu Hường (Khoa CNSH&CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên, năm 2014 n LỜI CẢM ƠN Được quan tâm, tận tình giảng dạy thầy giáo, cô giáo khoa CNSH&CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên trang bị vốn kiến thức khoa học định để tham gia nghiên cứu thực đồ án tốt nghiệp Thời gian thực tập để thực đồ án tốt nghiệp thời gian vô quý giá để trau dồi thêm kiến thức thực tế, củng cố lý thuyết học ghế nhà trường, tiếp cận với cơng nghệ tiên tiến ngành theo học Xuất phát từ kính trọng, cho phép tơi gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Đồng – Phó Giám đốc Viện Di truyền Nơng nghiệp Việt Nam Thầy ln tận tình bảo, dìu dắt tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến cô giáo ThS Lương Thị Thu Hường công tác Khoa CNSH&CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Ngun ln quan tâm, động viên, tận tình giảng dạy, củng cố kiến thức giúp tơi hồn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến KS Nguyễn Hữu Kiên người dành nhiều thời gian quý báu để trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể giáo viên Khoa CNSH&CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên dạy bảo suốt q trình học tập Cuối cho phép tơi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Thái Nguyên, ngày 24 tháng năm 2014 Sinh viên Lê Duy Toàn n DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT cDNA : Complementary DNA Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylene diamine tetraacetate EtBr : Ethydium Bromide FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp phát triển nông thôn NTCB : Ngô tẻ Cao Bằng PEG : Polyethylene Glycol PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Axit ribonucleic RT-PCR Kĩ thuật Real Time PCR SPAD : Chỉ số đánh giá hàm lượng diệp lục SSC : Saline-sodium citrate TAE : Tris-acetate-EDTA TE : Tris-EDTA CCTB : Chiều cao trung bình n MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược ngô 2.1.1 Nguồn gốc lan truyền ngô 2.1.2 Đặc điểm nông sinh học ngô 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng hạt ngô 10 2.1.4 Vai trị ngơ 10 2.2 Tình hình sản xuất ngơ giới Việt Nam 11 2.2.1 Tình hình sản xuất ngô giới 11 2.2.2 Tình hình sản xuất ngơ Việt Nam 12 2.3 Các phương pháp chuyển gen thực vật 13 2.3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 13 2.3.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 13 2.4 Tổng quan gen ZmNF-YB2 14 2.4.1 Tình hình nghiên cứu gen ZmNF-YB2 giới 14 2.4.2 Tình hình nghiên cứu gen ZmNF-YB2 nước 16 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Vật liệu thực vật 18 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 18 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 19 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 n 3.4.1 Kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 ngơ chuyển gen phương pháp PCR 19 3.4.2 Đánh giá khả chịu hạn ngô chuyển gen ZmNF-YB2 giai đoạn non hệ T1 22 3.4.3 Kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 ngô chuyển gen hệ T1 phương pháp Southern Blot 24 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết xác định có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dịng ngơ chuyển gen hệ T0 phương pháp PCR 27 4.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 27 4.1.2 Kết phân tích PCR 28 4.2 Đánh giá khả chịu hạn dịng ngơ chuyển gen hệ T1 giai đoạn non 30 4.2.1 Kết đánh giá khả chịu hạn hệ T1 thông qua tiêu đo chiều cao 30 4.2.2 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dịng ngơ hệ T1 35 4.3 Kết phân tích, xác định có mặt gen ZmNF-YB2 dịng ngơ chuyển gen hệ T1 phương pháp lai Southern Blot 37 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC n DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1: Tình hình sản xuất ngơ giới từ năm 2009 – 2012 11 Bảng 2.2:Tình hình sản xuất ngô Việt Nam từ năm 2009 – 2012 12 Bảng 3.1: Danh sách dòng ngô hệ T0 sử dụng để đánh giá khả chịu hạn hệ T1 18 Bảng 3.2: Trình tự mồi phân tích PCR 21 Bảng 4.1: Kết đo chiều cao trung bình dịng ngơ chuyển gen hệ T1 trước xử lý hạn đợt 30 Bảng 4.2: Kết đo chiều cao trung bình dịng sau đợt xử lý hạn 31 Bảng 4.3: Chiều cao trung bình dịng ngơ lơ tưới nước đầy đủ (lô số 1) 34 Bảng 4.4: Các lựa chọn dòng để tiến hành phân tích Southern Blot 37 n DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình ảnh ngơ Hình 2.2: Hình ảnh rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng ngơ Hình 2.3: Hình ảnh ngô Hình 2.4: Cấu trúc vector biểu gen NTCB ZmNFY-B2 17 Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 1% 27 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 hệ T0 28 Hình 4.3: A) Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 hệ T0; B) Marker 1kb plus 29 Hình 4.4: Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dịng ngơ chuyển gen 21NF.2 dòng đối chứng Vh1.2 32 Hình 4.5: Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dịng ngơ chuyển gen 3NF.2, 13NF.2, 15NF.2, 22NF.2 với dòng đối chứng C8H9.2 33 Hình 4.6: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 1% 35 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 hệ T1 36 Hình 4.8: Kết lai Southern Blot sản phẩm cắt gen ZmNF-YB2 với mẫu dò tương ứng từ dịng ngơ chuyển gen hệ T1 38 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ngơ có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Graminaae Ngô ngũ cốc quan trọng cung cấp lương thực cho người, cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Ngô năm loại lương thực giới (ngơ, lúa nước, lúa mì, sắn khoai tây) [3] Năm 2010 tổng sản lượng ngơ tồn giới đạt 851173441 thu hoạch từ 164305102 (FAO,2014) [15] Ở Việt Nam ngô loại lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, có phát triển rộng khắp, liên tục Hiện việc chọn tạo giống ngô tốt, bệnh, chất lượng cao, phẩm chất tốt, chống chịu điều kiện ngoại cảnh khắc nghiệt vấn đề quan tâm đặt hàng đầu Bên cạnh phương pháp chọn lọc truyền thống, với phát triển vượt bậc công nghệ sinh học đại tạo thực vật chuyển gen nói chung, dịng ngơ chuyển gen nói riêng mang đặc tính quý mà phương pháp truyền thống thường tốn nhiều thời gian thực Kĩ thuật chuyển gen vào ngô nghiên cứu trở thành công cụ quan trọng từ năm 1990 Hai phương pháp thường áp dụng vào chuyển gen ngô chuyển gen trực tiếp súng bắn gen chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Một số tính trạng tập trung nghiên cứu chuyển gen vào ngô năm qua nâng cao tính chịu mặn hay tính chịu hạn [1] Ở Việt Nam nguồn gen ngô bảo tồn Viện nghiên cứu ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự 3.000 dòng [9] Hạn hán yếu tố bất thuận làm giảm sinh khối thân, suất ngô giới Việt Nam, vùng trồng ngô dựa vào nguồn nước tự nhiên Theo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam diện tích trồng ngơ phụ thuộc vào nước mưa chiếm khoảng 70%, diện tích chủ động nước tưới chiếm khoảng gần 30% Ở nước ta lượng mưa hàng năm phổ biến từ 1700 – 2000 mm đủ cho nhu cầu n phát triển ngô, nhiên lượng mưa tập trung theo mùa nên mùa khô ngô không đủ nước để phát triển Để cải thiện suất điều kiện hạn hán trồng nơng nghiệp nói chung ngơ nói riêng gặp phải nhiều khó khăn hiểu biết chế sinh học xảy điều kiện hạn hán hạn chế [12], [29] Hệ số di truyền tính trạng thấp, tính chất khơng thể đốn trước thời gian xảy hạn hán, mức độ hạn hán [11], [13], [18], [27] Do cần tiếp cận phát triển phương pháp nghiên cứu để cải thiện suất trồng điều kiện hạn hán Kỹ thuật chuyển gen vào ngô đạt thành công ban đầu q trình phát triển giống ngơ chuyển gen chịu hạn Năm 2008, công ty Mosanto, công ty đầu tư mạnh công nghệ chuyển gen giới, chuyển gen chịu hạn vào ngô thành công [1] Ở Việt Nam vấn đề chuyển gen chịu hạn vào dịng ngơ tập trung tiến hành nghiên cứu [1] Tuy nhiên kết nghiên cứu kiêm tốn chưa có cơng bố thức [1] Với tiến khoa học kĩ thuật, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam tạo số dịng ngơ chuyển gen chịu hạn ZmNF-YB2 phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bước đầu thu kết Việc chuyển gen vào dịng ngơ thành cơng bước đầu, có ý nghĩa quan trọng việc chọn, tạo giống ngơ biến đổi gen nước ta Các dịng ngô chuyển gen tạo cần xác định có mặt xác định biểu gen chuyển với mục đích khẳng định khả chịu hạn so với giống ngô gốc Do nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu kết biến nạp gen chịu hạn ZmNF-YB2 vào số dịng ngơ Việt Nam“ 1.2 Mục đích đề tài Xác định có mặt biểu gen chuyển ZmNF-YB2 số dịng ngơ chuyển gen 1.3 u cầu đề tài - Xác định có mặt hay không gen chịu hạn ZmNF-YB2 số dịng ngơ chuyển gen hệ T0 T1 kĩ thuật PCR n ... biến nạp gen chịu hạn ZmNF- YB2 vào số dịng ngơ Việt Nam? ?? 1.2 Mục đích đề tài Xác định có mặt biểu gen chuyển ZmNF- YB2 số dịng ngơ chuyển gen 1.3 u cầu đề tài - Xác định có mặt hay khơng gen chịu. .. công nghệ chuyển gen giới, chuyển gen chịu hạn vào ngô thành công [1] Ở Việt Nam vấn đề chuyển gen chịu hạn vào dịng ngơ tập trung tiến hành nghiên cứu [1] Tuy nhiên kết nghiên cứu cịn kiêm tốn... THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ DUY TOÀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF- YB2 VÀO MỘT SỐ DỊNG NGƠ VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun