(Luận văn thạc sĩ) phân lập một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào ứng dụng trong sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi

ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM Lê Viết Tùng Tên đề tài: Phân lập số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào ứng dơng s¶n xt chÕ phÈm xư lý chÊt th¶i chăn nuôi khoá luận tốt nghiệp đại học Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh häc Khoa : CNSH - CNTP Kho¸ häc : 2010 - 2014 Thái Nguyên - 2014 n ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM Lê Viết Tùng Tên đề tài: Phân lập số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào ứng dụng sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi khoá luận tốt nghiệp đại học Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Lớp Khoá học Giảng viên hớng dẫn : Chính quy : C«ng nghƯ Sinh häc : CNSH - CNTP : 42 - CNSH : 2010 - 2014 : GS.TS Ngun Quang Tuyªn - ViƯn Khoa häc Sù sèng TS Nguyễn Văn Duy - Khoa CNSH & CNTP ThS Đỗ Bích Duệ - Viện Khoa học Sự sống Thái Nguyên - 2014 n LI CM N hồn thành khóa luận tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Tuyên – Phó viện trưởng Viện Khoa học Sự sống Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn tận tình tơi q trình thực tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy - Phó trưởng khoa Cơng nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm người tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Th.S Đỗ Bích Duệ cán Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, cán nhân viên Viện Khoa học Sự sống - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Và cuối cùng, xin cảm ơn quan tâm, giúp đỡ, động viên tinh thần tất người thân bạn bè suốt thời gian qua Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Lê Viết Tùng n DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1 Thành phần chất vô (%) số loại vật Bảng 2.2 Khối lượng chất thải rắn chăn nuôi Việt Nam Bảng 2.3 Tính chất nước thải chăn nuôi lợn .6 Bảng 2.4 Ước tính chất thải rắn chăn ni năm 2007 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi phản ứng PCR 18 Bảng 3.2 Dụng cụ thí nghiệm 19 Bảng 3.3 Thiết bị thí nghiệm 20 Bảng 4.1 Kết phân lập xạ khuẩn đất phân ủ hoai mục 28 Bảng 4.2 Đặc điểm chủng xạ khuẩn phân lập 29 Bảng 4.3 Kết xác định hoạt tính enzyme chủng XK phân lập 30 Bảng 4.4 Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau 48h 32 Bảng 4.5 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn T1 T4 33 Bảng 4.6 Đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn T1 T4 35 Bảng 4.7 Khả đồng hóa đường 36 Bảng 4.8 Khả chống chịu muối chủng XK T1 T4 37 Bảng 4.9 HTKS chủng xạ khuẩn tuyển chọn 37 Bảng 4.10 Kết so sánh trình tự gen chủng T1 với gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank 39 Bảng 4.11 Kết so sánh trình tự gen chủng T4 với gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank 39 n DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Trang Hình 4.1 Hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng xạ khuẩn 31 Hình 4.2 Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn nghiên cứu sau 48 32 Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc CSBT chủng xạ khuẩn T1 T4 34 Hình 4.4 Điện di đồ 37 Hình 4.5 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR 38 Hình 4.6 Cây phân loại thể mức độ tương đồng di truyền chủng Streptomyces T1 T4 với chủng khác thuộc chi Streptomyces 40 n DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ từ Từ viết tắt VSV Nhu cầu oxi sinh hóa Colony Forming Unit Nhu cầu oxi hóa học Cuống sinh bào tử Chất thải rắn Khuẩn ty chất Khuẩn ty khí sinh Chất rắn hịa tan Tổng cục thống kê Vi sinh vật XK Xạ khuẩn BOD CFU COD CSBT CTR KTCC KTKS SS TCTK n MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.2 Tổng quan chất thải chăn nuôi 2.2.1 Đặc điểm chất thải chăn nuôi 2.2.2 Tình hình nhiễm mơi trường chất thải chăn nuôi Việt Nam 2.2.3 Khả gây ô nhiễm chất thải chăn nuôi 2.3 Xạ khuẩn 2.3.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên .9 2.3.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 10 2.3.4 Phân loại xạ khuẩn 14 2.3.5 Enzyme ngoại bào phổ biến từ xạ khuẩn 16 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.3 Hóa chất thiết bị 19 3.3.1 Hóa chất 19 3.3.2 Dụng cụ thiết bị 19 3.3.3 Môi trường nghiên cứu 20 n 3.4 Nội dung nghiên cứu 20 3.5 Phương pháp nghiên cứu 21 3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 21 3.5.2 Phương pháp phân lập nuôi cấy xạ khuẩn 21 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu số đặc điểm sinh học xạ khuẩn 23 3.5.3 Phương pháp đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào [10] 23 3.5.5 Kiểm tra tính kháng số loại vi sinh vật gây bệnh [10], [11] 24 3.5.6 Phương pháp xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA 25 3.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 27 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn 28 4.1.1 Kết phân lập chủng XK đất phân ủ hoai mục 28 4.1.2 Đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc 14 chủng xạ khuẩn phân lập 29 4.2 Kết tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme ngoại bào 30 4.3 Kết đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng phân lập 31 4.4 Kết xác định số đặc điêm sinh học chủng XK T1 T4 33 4.4.1 Đặc điểm hình thái ni cấy 33 4.4.2 Kết xác định số đặc điểm sinh học chủng XK T1 T4 35 4.5 Kết xác định tính kháng vi sinh vật kiểm định 37 3.6 Kết định danh sinh học phân tử 37 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nông nghiệp ngành kinh tế quan trọng Việt Nam, có vai trò quan trọng chiến lược ổn định phát triển kinh tế - xã hội Hằng năm ngành đóng góp khoảng 18% tổng GDP nước [3] Trong cấu ngành Nông Nghiệp nước ta, ngành chăn ni đóng vai trị quan trọng Sản phẩm ngành nhu yếu phẩm, mặt hàng cần thiết sống ngày người Đây ngành kinh tế giúp người nông dân tăng thu nhập, giải nhiều công ăn việc làm cho người lao động Tuy nhiên, bên cạnh việc sản xuất cung cấp số lượng lớn sản phẩm quan trọng cho nhu cầu người, ngành chăn nuôi gây nên nhiều tượng tiêu cực mơi trường Ngồi chất thải rắn chất thải lỏng, chăn ni đóng góp khoảng 18% hiệu ứng nóng lên trái đất thải khí gây hiệu ứng nhà kính, có 9% tổng số khí CO2 sinh ra, 37% khí mêtan (CH4) 65% oxit nitơ (N2O) [25] Ngày nay, xã hội phát triển kèm theo gia tăng dân số diễn không ngừng dẫn tới nhu cầu sản phẩm ngành chăn nuôi ngày lớn Để đáp ứng yêu cầu ngày lớn ngành chăn ni cần phải có thay đổi tích cực Đó mở rộng quy mơ sản xuất, thay đổi phương thức sản xuất hay ứng dụng biện pháp khoa học kỹ để làm tăng suất, chất lượng, sản lượng sản phẩm ngành Và việc mở rộng quy mô sản xuất chăn nuôi đồng nghĩa với lượng chất thải chăn nuôi thải tăng lên Từ làm nảy sinh thêm nhiều vấn đề môi trường hệ lụy tác động tiêu cực tới người Đối với hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, không tập trung thông thường nguồn chất thải từ chăn nuôi gia súc, gia cầm thu dọn sơ sài không xử lý triệt để gây ô nhiễm nguồn nước, khơng khí mơi trường sống Hầu hết trang trại chăn nuôi người ta chưa quan tâm mức đến vấn đề xử lý chất thải q trình chăn ni tạo Điều gây thiệt hại lớn kinh tế đe doạ sức khoẻ dân cư, nguyên nhân phát sinh nhiều dịch bệnh nguy hiểm gia súc, gia cầm người (sốt xuất huyết, viêm não nhật bản, cúm virut …) [8] n Thành phần chất thải chăn ni có chứa nhiều hợp chất hữu tinh bột, cellulose, protein… [25] Đây nguồn hữu phong phú đem xử lý tái sử dụng phục vụ sản xuất nông nghiệp Như vậy, vừa có giá trị kinh tế mà quan trọng giảm thiểu nguy gây ô nhiễm mơi trường Hiện nay, có nhiều phương pháp xử lý chất thải chăn nuôi phương pháp ủ hoai mục thơng thường, cơng nghệ biogas, sử dụng làm phân bón, … [25] Nhưng phương pháp thường cần phải có kinh phí đầu tư cao, u cầu kỹ thuật, nhiều thời gian xử lý chưa thực tiện dụng với bà nông dân Sử dụng phương pháp sinh học để xử lý môi trường ngày trở nên phổ biến ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, kết hợp với biện pháp khác để nâng cao hiệu xử lý Từ thực tiễn tơi tiến hành thực đề tài: “Phân lập số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào ứng dụng sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào mạnh - Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả sinh enzyme ngoại bào để làm sở cho việc sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn Thái Nguyên có khả sinh enzyme ngoại bào - Bổ sung sở liệu nghiên cứu xạ khuẩn - Bổ sung thêm liệu khả sử dụng xạ khuẩn xử lý chất thải chăn nuôi 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Xác định chủng xạ khuẩn phân giải chất thải chăn nuôi ứng dụng vào thực tế sản xuất chế phẩm vi sinh nhằm làm đơn giản rút ngắn trình phân giải chất thải chăn nuôi n 36 Bảng 4.7 Khả đồng hóa đường Mức độ sinh trưởng Nguồn đường STT Chủng T1 Chủng T4 D - glucose Saccharose Fructose Lactose Manitol Inositol ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ Xylose +++ +++ Maltose + + Arabinose ++ +++ 10 Khơng có đường (đối chứng âm) + + Ghi chú: +++ sinh trưởng mạnh + sinh trưởng yếu ++ sinh trưởng trung bình - khơng sinh trưởng Các chủng xạ khuẩn có khả sử dụng nhiều nguồn đường khác Đánh giá khả đồng hóa nguồn đường xạ khuẩn có ý nghĩa quan trọng việc phân loại, ứng dụng chúng vào thực tiễn sản xuất Theo kết nghiên cứu, chủng xạ khuẩn có khả đồng hóa nguồn đường nghiên cứu mức độ khác Chủng T4 sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn đường saccharose, lactose, inositol, xylose, arabinose sinh trưởng mơi trường maltose, mơi trường cịn lại mức sinh trưởng trung bình Chủng T1 sinh trưởng tốt môi trường chứa lactose, manitol, inositol xylose.Và sinh trưởng môi trường chứa maltose 4.3.2.2 Khả chống chịu muối Hai chủng xạ khuẩn nuôi cấy mơi trường ISP1 có bổ sung NaCl nồng độ 1, 3, 5, 9% 0% (đối chứng) Sau - 14 ngày nuôi n 37 cấy, kết thu được trình bày bảng 4.8 cho thấy chủng có khả sinh trưởng nồng độ muối tối đa 7% Bảng 4.8 Khả chống chịu muối chủng XK T1 T4 Nồng độ muối 0% 1% 3% 5% 7% 9% T1 ++ ++ ++ ++ ++ - T4 ++ +++ ++ ++ + - Ghi chú: +++: sinh trưởng tốt ++: sinh trưởng trung bình +: sinh trưởng yếu -: không sinh trưởng 4.4 Kết xác định tính kháng vi sinh vật kiểm định Sử dụng phương pháp thỏi thạch để đánh giá khả ức chế vi sinh vật gây bệnh Hoạt tính kháng sinh xác định theo kích thước vịng vơ khuẩn: D - d (mm), D đường kính vịng vơ khuẩn, d đường kính thỏi thạch Kết thể bảng 4.8 Bảng 4.9 HTKS chủng xạ khuẩn tuyển chọn Hoạt tính ức chế VSV gây bệnh (D - d, mm) Chủng Escherichia coli Salmonella 10 T1 15 T4 Qua bảng ta thấy chủng T1 T4 có khả kháng E coli (T1=10, T4=15) cao khả kháng với Salmonella sp (T1=5, T4=6) Tuy nhiên mức độ kháng hai chủng chưa cao 4.6 Kết định danh sinh học phân tử Tách chiết DNA tổng số chủng xạ khuẩn T1 T4 Đường chạy 1: DNA tổng số chủng T1 Đường chạy 2: DNA tổng số chủng T4 Hình 4.4 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số n 38 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số hình 4.4 cho thấy băng DNA tổng số gọn, rõ ràng chứng tỏ sản phẩm tách chiết bị đứt gãy đủ điều kiện để làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại vùng gen 16S rRNA, sử dụng cặp mồi 341F 907R phục vụ cho việc gắn trình tự gen: kết khuếch đại vùng gen 16S rRNA chủng T1 T4 cặp mồi 341F 907R thể hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR chủng T1 T4 thể hình 4.6 cho thấy: đường băng xuất băng DNA rõ nét có kích thước khoảng 546bp, chứng tỏ sản phẩm PCR đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự Kết giải trình tự gen 16S rRNA chủng T1 T4 trình bầy phần phụ lục Trình tự gen 16S rRNA so sánh với chủng xạ khuẩn công bố ngân hàng gen chương trình Blast 546bp Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1kb Đường chạy 1: Sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn T1 Đường chạy 2: Sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn T4 Hình 4.5 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR n 39 Bảng 4.10 Kết so sánh trình tự gen chủng T1 với gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank Trình tự gen 16S-rRNA chủng Mã số truy cập Độ tương xạ khuẩn T1 GenBank đồng (%) Streptomyces scabiei JQ860222 99 Streptomyces rimosus DQ299944 99 Streptomyces reticuli GU383165 99 Streptomyces erumpens EF031295 99 Streptomyces griseus EF661794 99 Streptomyces albospinus FJ406369 99 Streptomyces megasporus AY289795 99 Streptomyces griseorubens KF938603 99 Bảng 4.11 Kết so sánh trình tự gen chủng T4 với gen tương ứng chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank Trình tự gen 16S-rRNA Mã số truy cập Độ tương chủng xạ khuẩn T4 GenBank đồng (%) Streptomyces sp XKNA21 AM398159 99 Streptomyces sp SCAUEC4 KJ093410 99 Streptomyces sp SDT 101 KJ019011 99 Streptomyces sp MUSC193T KF692201 99 Streptomyces sp SDT85 KJ018998 99 Streptomyces sp VITJS JQ234978 99 Streptomyces sp Coeruleofuscus JQ659879 99 n 40 Khi so sánh trình tự gen nhận nghiên cứu với trình tự gen tương ứng ngân hàng sở liệu Genbank công cụ Blast (NCBI) cho thấy gen 16S- r RNA chủng xạ khuẩn T1 T4 có độ tương đồng cao (99%) so với gen tương ứng chủng ngân hàng gen Như vậy, kết phân loại cho thấy chủng xạ khuẩn T1 T4 thuộc chi Streptomyces Hình 4.6 Cây phân loại thể mức độ tương đồng di truyền chủng Streptomyces T1 T4 với chủng khác thuộc chi Streptomyces Qua phân loại ta nhận thấy hai chủng xạ khuẩn T1 T4 có chung nguồn gốc tách biệt với chủng xạ khuẩn so sánh Tuy nhiên mối quan hệ họ hàng hai chủng xạ khuẩn T1 T4 với chủng xạ khuẩn sử dụng so sánh có khác Các chủng Streptomyces rimosus, Streptomyces reticuli, Streptomyces griseorubens có mối quan hệ họ hàng với chủng xạ khuẩn T1 T4 gần cả, chủng xạ khuẩn với T1 T4 nằm nhánh phân loại Ở nhánh phân loại khác gồm có chủng Streptomyces scabiei, Streptomyces erumpens, Streptomyces stelliscabiei, Streptomyces griseus, Streptomyces albospinus có mối quan hệ họ hàng xa Nằm tách biệt riêng hẳn nhánh phân loại, chủng Streptomyces megasporus có mối quan hệ họ hàng xa hai chủng xạ khuẩn T1 T4 n 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập mẫu đất phân ủ hoai mục địa bàn Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Thái Nguyên Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose, tinh bột protein cao, có khả ức chế vi sinh vật gây bệnh Đã nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn thuộc chi Streptomyces, chúng có hoạt tính tính enzyme ngoại bào mạnh (cellulase, amylase, protease) Có thể tiếp tục nghiên cứu làm sở sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, sử dụng hai chủng Streptomyces T1 T4 phân lập để chế tạo chế phẩm sinh học thử nghiệm hiệu chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi n 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005), Tập giảng bảo vệ môi trường phát triển chăn nuôi theo hướng bền vững, Hà Nội Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005), Khoa học công nghệ nơng nghiệp 20 năm đổi mới, NXB Chính trị quốc gia, Hà Nội, tr.11-13 Bộ Nông Nghiệp phát triển Nông thôn (2013), Báo cáo Tổng kết ngành Nông nghiệp PTNT năm 2013, Hà Nội Bộ Tài Nguyên Môi trường (2011), Báo cáo môi trường Quốc gia năm 2011, Hà Nội Tăng Thị Chính (2007), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật ứng dụng để xử lý ô nhiễm môi trường, Viện Công Nghệ Môi Trường, Viện KH&CN Việt Nam Vi Thị Đoan Chính (2011), Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ, Mã số B2009 TN07 - 02 Cục chăn ni (2008), Ơ nhiễm mơi trường chăn ni gia súc, gia cầm tập trung giải pháp khắc phục, Hà Nội Cục chăn nuôi (2008), Báo cáo ô nhiễm môi trường chăn nuôi gia súc, gia cầm tập trung giải pháp khắc phục, Hà Nội Cục Thú y (2008), Ơ nhiễm mơi trường hoạt động chăn nuôi thú y giải pháp khắc phục, Hà Nội 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học (tập 1, 2), NXB Giáo Dục 11 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 12 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội n 43 13 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietciences 14 Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1993), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội 15 Nguyễn Hữu Đoàn, Bùi Xuân Trạch, Vũ Đình Tơn (2011), Quản lý chất thải chăn ni, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 16 Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia 17 Hoàng Kim Giao, Bùi Thị Oanh , Đào Lệ Hằng (2008), “Ơ nhiễm mơi trường chăn nuôi gia súc, gia cầm tập trung giải pháp khắc phục”, Tạp chí nơng Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 10/2008, tr5-10 18 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 19 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 20 Trần Thanh Loan, Đỗ Ngọc Biên (2012), kỹ thuật sử dụng chế phẩm sinh học sản xuất nông nghiệp, Tài liệu kỹ thuật, tr.2 21 Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh (2008), Thực tập vi sinh sở, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh 22 Nguyễn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, NXB Giáo dục 23 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Thị Hiền (2003), Giáo trình vi sinh vật học nơng nghiệp, NXB Đại học Sư phạm 24 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), “Tương lai ứng dụng Enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 23, 75 - 85 25 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội (2009), Báo cáo hội thảo khoa học Chất thải chăn nuôi - Hiện trạng giải pháp, Hà Nội n 44 26 Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất Giáo dục 27 Đỗ Kim Tuyến (2011), Nghiên cứu đa dạng sinh học số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập Thái Nguyên định hướng ứng dụng Luận văn thạc sĩ 28 Viện Chăn nuôi (2006), Điều tra đánh giá trạng môi trường chăn nuôi, Hà Nội 29 Trần Thị Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 30 Lê Thị Xuân, Phan Thị Tuyết Minh, Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính (2005), Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenllulaza cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, Nghiên cứu khoa học sống, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 872- 875 B TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 31 Agrios, G N(1997), Plant Pathology, 4th Edition Academic Press, San Diego, USA 32 Bergeỵ's Manual of determination of bacteria(1986), Academic press, London and New York 33 Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F (2008), “Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment”, Arch Microbiol, 183, 301- 305 34 Geschva, A Shurk and W Romer (1979), "Phosphate inhbition of secondary metabolism in Streptomyces hygroscopicus and its reversal by cylic AMP", Arch Microbiol, 121, p 91 - 96 35 Haijun D, Taifo M., Ingo T., Sungsook L., Heinz G (2001), “Biosynthesis of the Validamycin A by Streptomyces hygroscopicus var limoneus”, J Am Chem Soc., 123, 2733 - 2742 n 45 36 HeshamM Abdulla (2007), “ Enhancement of rice straw compostinh by lignocelluloselytic Actinomyces strain”, Int J Agriculture & biology, (1), pp 106-109 37 Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M (2003), "Natrural products as ourees of new drugs over the period", J Nat Prod, 66, 1022 - 1037 38 Jesus G M., Silvia G A., Ana I A , Francisco R V (1999), “Use of the 16S–23S ribosomal gens spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Unidad de Microbiological, Centro de Biologia Molecular y Celular, 18 , Spain 39 Jeffrey L S H (2008), “Isolation, characterization and identification of actinomycetes from agriculture soils at Semongok, Sarawak”, African Journal of Biotechnology, (20), 3697 - 3702 40 Ludwig W., Schleifer K H (1994), “Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis”, FEMS Microbiol Rev., 15, 155 - 173 41 Ramasamy Vijaykumar, Chinasamy Muthukumar, Nooruddin Thajuddin, namalai Panneerselvam, and Regasamy Saravanamuthu (2007), Studies on the diversity of actinomycetes in the Palk Stait region of Bay of Bengal, India, Actinomycetologica 42 Sahnay S., Benton M J and Ferry P A.(2010), “Links bettween global taxonomic diversity and the expansion of vertebrates on land”, Biology Letters, 6(4), pp.544-547 43 Shang S Y., Jan Y W (1999), “Protease and amylase production of Streptomyces rimosus in submerged and solid state cultivations”, Bot.Bull.Acad Sin, (40), 259 - 265 44 Shirling E.B., Gottlieb D (1996), “Methods for characterization of Streptomycesspecies”, International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3) 45 Vasanthabharathi V., Lakshminarayana R., Jayalakshmi S (2011), “Melanin production from manine Streptomyces”, African Journal of Biotechnology, 10(54), 11224 - 11234 n 46 46 Waksman S A (1961), “The Actinomycet es: Classification, identification and descriptions of genera and species”, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, USA 47 William S.T and Dacier F.L(1965), Use of antibiotics for selective isolation and enumeration of actimomycetes in soil, J.Gen, Microbiol, 38: 251 - 261 48 Williams S T., Sharpe M E., Holt J G (1989), “Bergey’s manual of systematic bacteriology”, Williams & Wilkins, Baltimore, USA n PHỤ LỤC >gi|T1 TGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACGACG TGGAATGTCGCCCACACCTAGTGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC TAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGAT CCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGG AATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGG TTAAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCC CAATAATTCCGGACAACGCTCGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGA GGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCG CCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGT >gi|T4 TGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACAACG TGGAATGTTGCCCACACCTAGTGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC TAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGAT CCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGG AATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGG TTAAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGCGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCC CAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGA GGTTTACACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGC CCATTGTGCAATATTCCCCACTGTGGCCTCCCGTAGGAGG n PHỤ LỤC STT Hóa chất Khối lượng (g) Mơi trường Gause (g/l) (Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn) Tinh bột 20 NaCl K2HPO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.5 KNO3 FeSO4 0.01 Agar 20 H2O 1000 ml Môi trường tinh bột Tinh bột 20 Pepton NaCl 0.5 Agar 20 H2O 1000ml Môi trường casein NaCl K2HPO4 1.5 KH2PO4 0.5 Casein Cao thịt Agar 20 H2O 1000ml Môi trường cellulose (NH4)2HPO4 20 KH2PO4 0.5 MgSO4 0.4 NaCl 0.1 FeSO4, MnSO4 Vết n STT 4 5 Hóa chất Bột giấy Agar H2O 4.Môi trường Gause Cao thịt Pepton NaCl Glucose Agar H2O Môi trường ISP1 Trypone Cao nấm men Agar H2O Môi trường ISP6 (pH7-7,2) Pepton Agar Cao nấm men Xtrat sắt Nước cất Môi trường ISP9 (pH 6,8-7) (NH4)2SO4 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O Agar Nước cất Muối A MPA 1000ml (pH7,0 - 7,2) n Khối lượng (g) 20 1000ml 5 10 20 1000ml 20 1000ml 20 0,5 1000ml 2,64 5,65 2,38 20 1000ml 1ml STT Hóa chất Cao thịt Pepton NaCl Agar Nước cất Khối lượng (g) 3g 5g 5g 20g 1000ml Muối A: CuSO4.5H2O: 0,64g; FeSO4.7H2O: 0,11g; MgCl2: 0,79g; nước cất: 100ml n ... chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào ứng dụng sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào mạnh... cho chế tạo sản xuất chế phẩm vi sinh phân giải chất thải chăn nuôi Bẩy chủng xạ khuẩn tiếp tục đem nghiên cứu đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào 4.2.2 Kết đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào chủng. .. sản xuất chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, sử dụng hai chủng Streptomyces T1 T4 phân lập để chế tạo chế phẩm sinh học thử nghiệm hiệu chế phẩm xử lý chất thải