(Luận văn thạc sĩ) phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM B TH I Tờn ti: Phân lập nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HäC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K42 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2010-2014 Giảng viên hướng dẫn: TS Dương Văn Cường Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên ThS Lương Hùng Tiến Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 n LỜI CẢM ƠN! Để thực đề tài em nhận quan tâm, giúp đỡ, bảo tận tình thầy hướng dẫn thầy cô giáo, bạn sinh viên Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Dương Văn Cường, thầy Lương Hùng Tiến - giảng viên khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, thầy quan tâm giúp đỡ bảo em suốt trình thực đề tài Tiếp theo em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm tận tình bảo, tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ dành thời gian cho em để em hồn thành tốt khóa luận Do trình độ điều kiện thời gian thực đề tài có hạn nên đề tài khơng tránh khỏi sai sót Em mong nhận góp ý thầy bạn để đề tài hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, Ngày 30 tháng năm 2014 Sinh viên thực Bế Thị Đài n DANH MỤC BẢNG BIỂU trang Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 21 Bảng 4.1: Kết phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đông từ Boza 26 Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 27 Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 28 n DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 2.1: Natto enzyme Nattokinase Hình 2.2: Các chế tác động lên fibrin Nattokinase Hình 2.3 Hình ảnh sản phẩm Boza 16 Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 27 Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian ni cấy tới hoạt tính Nattokinase vi khuẩn BL4 29 Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng pH tới hoạt tính sinh Nattokinase vi khuẩn BL4 30 Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 31 n DANH MỤC VIẾT TẮT pI Da MW B subtilis TS t-PA Bệnh viện TƯ cs Điểm đẳng điện Dalton Khối lượng phân tử Bacillus subtilis Tiến sĩ Tissue plasminogen activator Bệnh viện trung ương Cộng n MỤC LỤC trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Enzyme Nattokinase 2.1.1 Đậu tương 2.1.2 Natto Nattokinase 2.2 Boza 16 2.3 Tình hình nghiên cứu nước 17 2.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 17 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 20 3.3.1 Hóa chất 20 3.3.2 Thiết bị sử dụng 21 3.3.3 Các môi trường sử dụng (Sambrook Russel, 2006) 21 3.4 Nội dung nghiên cứu 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1.Phương pháp phân lập 22 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khuẩn 22 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa vi khuẩn 23 n 3.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả sinh tổng hợp nattokinase vi khuẩn 23 3.5.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25 3.5.6 Phương pháp nhân giống vi khuẩn 25 3.6 Phương pháp sử lý số liệu 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza 26 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza 26 4.2.1 Kết nghiên cứu hình thái vi khuẩn BL4 26 4.2.2 Kết nghiên cứu đặc tinh sinh hóa vi khuẩn BL4 28 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 29 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới trình sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 29 3.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường tới khả tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 30 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 31 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1 Kết luận 33 4.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch cục máu đông (trombus) chứng nhồi máu tim hay nhồi máu não tăng cao Việt Nam giới Vì enzyme Nattokinase quan tâm nghiên cứu sản xuất sử dụng rộng rãi để phòng bệnh nghẽn động mạch cục máu đông [1] Nattokinase serine protease gồm 275 axit amin, hoạt động pH tối ưu từ 8-10, nhiệt độ tối ưu từ 30 - 70oC, có trọng lượng phân tử từ 27,7 - 44kDa, điểm đẳng điện (pI) cấu trúc tương đồng với subtilisin Cơ chế hoạt động nattokianse trực tiếp phân cắt fibrin huyết khối gián tiếp cách hoạt hóa sản xuất urokinase plasmin mơ Sự tuần hồn máu người bị tác động số enzyme đặc biệt Nattokinase hỗ trợ cho máu lưu thơng tốt giúp cho huyết áp mức bình thường.[32] Nattokinase tổng hợp từ vi sinh vật (nhân sơ nhân thật) Bacillus subtilis, Fusarium Rhizomucor sp enzyme tương tự tổng hợp từ tuyến tụy người (Trypsin chymotrypsin) Vi sinh vật dùng để sản xuất Nattokinase Bacillus subtilis (Vi khuẩn) Rhizomucor sp (Nấm mốc) Vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ nhiều loại thực phẩm lên men truyền thống như: Natto Nhật (Fujita M cs., 1993); Bacillus amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi, Trung Quốc (Peng Y cs., 2003), Bacillus sp CK 11-4 từ Chungkook-Jang Bacillus sp DJ-4 từ Doc-Jang, Hàn Quốc.[14][15] Boza đồ uống lên men truyền thống từ lúa mạch nhiều nước đông Âu Thổ Nhĩ Kỳ Trong Boza có hệ vi sinh đa dạng, bao gồm nhiều loại lợi khuẩn vi khuẩn lactic như: Lactobacillus brevis, Lb platarum, Lb graminis, Lb paraplantarum, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis [18] Các chủng vi khuẩn Boza không lên men tạo sản phẩm giàu dinh dưỡng từ lúa mạch mà tổng n hợp sinh Nattokinase sản phẩm Để đánh giá điều này, lựa chọn đề tài “Phân lập nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza” đề tài nghiên cứu 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme Nattokinase chủng vi khuẩn từ Boza 1.3 Yêu cầu - Phân lập chủng có khả sinh enzyme phân hủy máu đông Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza - Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng phân lập - Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh Nattokinase chủng phân lập 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme phân hùy máu đông từ Boza, làm sở để nghiên cứu thực tiễn - Giúp sinh viên tiếp cận với thực tế nghiên cứu khoa học, thành thạo thao tác phịng thí nghiệm vi sinh 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Phân lập chủng vi khuẩn từ Boza có khả ứng dụng sản xuất chế phẩm phân hủy huyết khối phòng, chữa bệnh tim mạch n PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Enzyme Nattokinase 2.1.1 Đậu tương Đậu nành cịn có tên đậu tương Nguồn gốc từ Trung Quốc, sau lan sang Việt Nam, Nhật Bản, Triều Tiên Châu Âu biết đến đậu nành từ kỷ 18 Từ cổ xưa, đậu nành dùng làm thực phẩm, gần y học giới phát nhiều tác dụng chữa bệnh Đây kết luận chuyên gia Mỹ đưa hội nghị khai thác giá trị dinh dưỡng từ đậu nành sức khỏe người Viện Dinh dưỡng thuộc Đại học Columbia (Mỹ) - Ngừa ung thư vú phụ nữ Một khảo sát nhà khoa học thuộc Đại học Georgetown (Mỹ) cho thấy bổ sung đậu nành mức độ vừa phải giúp giảm nguy bị ung thư vú Theo Hiệp hội Ung thư Mỹ, dùng phần đậu nành ngày đem lại nhiều ích lợi cho phụ nữ có nguy có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư vú [33] -Tác dụng tim mạch Theo khảo sát, bổ sung 20-133g protein từ đậu nành ngày giúp giảm 7-10% hàm lượng cholesterol xấu LDL thể “Dùng đậu nành phần chế độ dinh dưỡng giúp giảm nguy mắc bệnh tim”, Wahida Karmally – Giám đốc dinh dưỡng Viện Nghiên cứu Irving nói Cịn theo Cơ quan Quản lý dược phẩm thực phẩm Mỹ (FDA), thêm 25g protein từ đậu nành ngày có tác dụng giảm lượng chất béo bão hịa, qua giảm nguy mắc bệnh tim mạch Các nhà khoa học thuộc Hội mãn kinh Bắc Mỹ kết luận: Đậu nành chất chiết từ đậu nành có tác dụng giảm huyết áp tâm trương, giảm cholesterol toàn phần, giảm cholesterol xấu (tức LDL-cholesterol), ngăn chặn tiến triển n 24 (pH=7,4) trộn 35ml dung dịch agar 2% tiệt trùng đĩa petri (đường kính 100mm - Độ dày thạch 5mm) Để cố định 30 phút để thạch đông cứng, sau sử dụng que đục lỗ thạch tạo giếng thạch có đường kính 5mm 100µl dịch ly tâm dịch lên men vi khuẩn đưa vào giếng thạch ủ 37oC 18h Sau đo đường kính vịng phân giải để xác định hoạt tính enzyme Một đơn vị (U) định nghĩa lượng enzyme có 25µl dung dịch enzyme có khả tạo vòng phân giải 1mm2 pH 7,4 nhiệt độ 37oC 18h Hoạt tính enzyme = (D2 – 52) * 3,14/16 (U) 3.5.4.2.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Để xác định ảnh hưởng thời gian ni cấy tới q trình tổng hợp Nattokinase, chủng vi khuẩn nuôi lắc (150 vịng/phút) 50ml mơi trường CM bình tam giác 250ml 37oC Sau khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 72 tiến hành hút 5ml dịch nuôi cấy, cho vào ống Falcon 15ml ly tâm chế độ 6000 vòng/phút, 4oC 20 phút Sau dịch sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch 3.5.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường tới khả tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Chủng vi khuẩn ni lắc (150 vịng/phút) 20ml mơi trường CM bình tam giác 50ml 37oC pH ban đầu môi trường điều chỉnh với giá trị: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dung dịch NaOH 1N HCL 1N Sau 36h nuôi cấy tiến hành ly tâm chế độ 6000 vòng/phút, 4oC 20 phút Sau dịch sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch 3.5.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Chủng vi khuẩn ni cấy lắc (150 vịng/phút) nhiệt độ 37oC 20ml mơi trường CM có nguồn cacbon (nồng độ 0,1%) sau: n 25 Môi trường Nguồn cacbon CM1 Glucose CM2 Glycerol CM3 Maltose CM4 Sucrose Vi khuẩn nuôi cấy môi trường 37oC, lắc 150 vịng/phút bình tam giác 50ml Sau 36h ni cấy tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy 6000 vòng/phút; nhiệt độ 4oC 20 phút để loại bỏ sinh khối Sau dịch sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch 3.5.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Giống vi sinh vật bảo quản môi trường thạch nghiêng LBA nhiệt độ 4oC Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật cấy chuyển lần để đảm bảo sức sống ổn định giống vi sinh vật trình nghiên cứu 3.5.6 Phương pháp nhân giống vi khuẩn Dùng que cấy lấy sinh khối từ ống giống cấy vào mơi trường LB, sau ni lắc (150 vịng/phút) nhiệt độ 37oC 24h Sau kết thúc thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào tăng lên khoảng 108 tế bào/ml cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 10% 3.6 Phương pháp sử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để tính tốn vẽ đồ thị n 26 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu đồ uống lên men Boza thể bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đơng từ Boza STT Chủng vi khuẩn Vòng phân giải (cm) BL1 1,1 BL2 - BL3 - BL4 1,7 BL5 - Kết phân lập thu chủng vi khuẩn khiết ký hiệu BL1, BL2, BL3, BL4, L5 Sau cấy chủng lên môi trường dinh dưỡng chứa máu thỏ BAM, chủng BL2, BL3, BL5 khơng tạo vịng phân giải đĩa mơi trường Chỉ có chủng BL1 BL4 có hoạt tính phân giải máu đơng, chủng BL4 có hoạt tính phân giải mạnh (vịng phân giải >1,5cm) chọn làm đối tượng cho nghiên cứu 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên men Boza 4.2.1 Kết nghiên cứu hình thái vi khuẩn BL4 Kết nghiên cứu hình thái vi khuẩn BL4 thể bảng 4.2 hình 4.1 n 27 Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 Chủng Hình dạng, kích thước Màu sắc Bề mặt Ria Hình trịn BL4 gần trịn, trung Trắng sữa, Ướt, có nếp nhăn, bám yếu Ria khơng bình (0,2không tiết sắc tố lên bề mặt môi trường 0,3cm) Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 Vi khuẩn BL4 có khuẩn lạc hình trịn gần trịn, kích thước trung bình từ 2-3mm, màu trắng sữa không tiết sắc tố Bề mặt khuẩn lạc BL4 ướt, nhăn, dễ bong khỏi mặt thạch Khuẩn lạc vi khuẩn BL4 có ria khơng dạng cưa Tế bào vi khuẩn BL4 có đạng hình que, kích thước 0,8 x 1,5 µm, hai đầu tế bào trịn đều, có khả sinh bào tử, phù hợp với đặc tính vi khuẩn Bacillus subtilis n 28 4.2.2 Kết nghiên cứu đặc tinh sinh hóa vi khuẩn BL4 Một số đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 đánh giá, kết nghiên cứu trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa vi khuẩn BL4 Đặc tính Kết đánh giá Bắt màu nhuộm Gram + Sinh bào tử + Sinh catalase + Sinh oxidase + Phân giải glucosea + Phân giải glucoseb + Phân giải lactoseb - Phân giải sucroseb + Sinh + Sinh H2S + Ghi chú: (+): có, phát triển dương tính; (-): Khơng, khơng phát triển âm tính; (a) Chuyển hóa đường tạo acid; (b): Chuyển hóa đường sinh khí Vi khuẩn BL4 có đặc tính sinh hóa đặc trưng vi khuẩn Bacillus, khả sinh catalase, hơ hấp hiếu khí, có khả chuyển hóa loại đường tiết acid mơi trường, sinh khí H2S Để xác định lồi vi khuẩn BL4 cần có nghiên cứu bổ sung đặc tính sinh hóa khác theo hệ thống phân loại vi n 29 khuẩncủa Bergey phương pháp sinh học phân tử thơng qua phân tích trình tự rDNA 16S ribosome 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên trình tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ni cấy tới q trình sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 Vi khuẩn Bacillus subtilis thường bắt đầu tổng hợp Nattokinase vào pha sinh trưởng vi khuẩn đạt hoạt tính cao pha cân (sau 36h nuôi cấy) [5] Kết đánh giá ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trình tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 thể hình 4.2 Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian ni cấy tới hoạt tính Nattokinase vi khuẩn BL4 Qua hình 4.2 cho thấy vi khuẩn BL4 sau 12h nuôi cấy tổng hợp Nattokinase tiết mơi trường với hoạt tính 200U Sau hàm lượng Nattokinase tiếp tục tăng lên 350U 24h lên men đạt cao 36h lên men Hoạt tính enzyme Nattokinase vi khuẩn BL4 thời điểm 36h nuôi cấy n 30 370U Sau thời điểm hoạt tính Nattokinase giảm mạnh, sau 48h 60h lên men, hoạt tính enzyme 60% so với thời điểm 36h Điều cho thấy tương đồng ảnh hưởng thời gian lên men tới hoạt tính sinh Nattokinase vi khuẩn BL4 vi khuẩn Bacillus subtilis nghiên cứu Aydin Berenjian cs năm 2013 [4] 3.3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường tới khả tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 pH ảnh hưởng mạnh tới trình xúc tác enzyme vận chuyển chất qua màng tế bào phục vụ cho phát triển tổng hợp sản phẩm vi khuẩn [22] Vì khẳng định pH mơi trường có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Để đánh giá ảnh hưởng pH tới khả tổng hợp enzyme vi khuẩn BL4, vi khuẩn nuôi pH môi trường ban đầu có giá trị khoảng từ 5-8 Kết nghiên cứu thể hình 4.3 Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng pH tới hoạt tính sinh Nattokinase vi khuẩn BL4 Qua hình 4.3 ta thấy thay đổi pH khoảng từ - ảnh hưởng không đáng kể tới khả sinh Nattokinase vi khuẩn BL1 Trong giá trị pH khảo sát pH = cho kết tốt với hoạt tính Nattokinase n 31 390U Nếu pH môi trường cao thấp làm cho hoạt tính sinh enzyme bị giảm không đáng kể 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 Nguồn dinh dưỡng cacbon nhân tố định tới phát triển tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Avhad DN cs (2013) [4] tiến hành khảo sát yếu tố nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ muối khoáng tới sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Bacillus sphaericus MTCC 3672 Kết nghiên cứu cho thấy glucose chất tốt cho tổng hợp enzyme Nattokinase vi khuẩn Các hợp chất cacbon khác sucrose, maltose cho kết thấp hơn, đặc biết glycerol cho kết thấp nhiều lần Để đánh giá ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon tới tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4, môi trường lên men CM thay đổi nguồn cacbon glucose, maltose, sucrose glycerol Kết nghiên cứu thể hình 4.4 Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 Qua hình 4.4 cho thấy nguồn dinh dưỡng cacbon có ảnh hưởng định tới tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 Nguồn cacbon thích hợp maltose, sau glucose với hoạt tính enzyme tương ứng 390 U 380 U Sucrose chất cho kết tổng hợp enzyme thấp loại chất khảo n 32 sát với hoạt tính Nattokinase 301, thấp 20% so với maltose có nồng độ môi trường n 33 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ sản phầm đồ uống lên men truyền thống phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải fibrin (fibrinolytic enzyme), chủng BL4 có khả phân giải mạnh - Chủng BL4 vi khuẩn gram dương, hình que, có đặc điểm hình thái sinh hóa với nhiều điểm tương đồng với Bacillus subtilis - Điều kiện sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn BL4 là: môi trường nuôi cấy CM với nguồn cacbon thay maltose 0,1%; pH môi trường thời gian nuôi cấy 36h Với điều kiện nuôi cấy cho hoạt tính Nattokinase cao 390 U 4.2 Kiến nghị Do thời gian điều kiện nghiên cứu cịn hạn chế, để đề tài hồn thiện cần phải thực nghiên cứu sau đây: - Định danh chủng vi khuẩn BL4 nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng khác nhiệt độ ni cấy, nguồn nitơ, khống đến sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn nhằm tối ưu hóa q trình - Nghiên cứu sản xuất chế phẩm, thực phẩm từ vi khuẩn BL4 nhằm sử dụng để phòng ngừa, điều trị bệnh tụ huyết gây n 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012) Phân lập tuyển chọn số chủng bacillus sinh tổng hợp nattokinase Tạp chí Sinh học Lê Hồng Thọ (2008) Phát độc đáo GS Sumi Hiroyuki, Vietsciences Lê Hồng Thọ (2011) Natto gì? Vietsciences Tài liệu tiếng anh Aydin Berenjian, Raja Mahanama, John Kavanagh, Fariba Dehghani, Younes Ghasemi (2013) Nattokinase production: Medium components and feeding strategy studies Scientific paper Bin Chen, Junzhu Huo, Zhengbo He, Qiyi He, Youjin Hao and Zhilin Chen (2013) Isolation and identification of an effective fibrinolitic strain Bacillus subtilis FR-33 from the Chinese doufuru and primary analysis of its fibrinolytic enzyme African Journal of Microbiology Reasearch Vol 7(19), 2001-2009 Cesarin et al (2003) Nattokinase - DVT prevention Angiology, 54(5): 5319 Dja-shin Wang, Chau-chen Torng, I-ping Lin, Bor-wen Cheng, Hui-rong Liu and Chao-yu Chou (2005) Optimization of nattokinase production conduction using response surface methodology.Journal of Food Process Engineering Dubey R., Kumar J., Agrawala D., Char T and Pusp P (2011) Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources African Journal of Biotechnology Vol 10(8), pp.1408-1420 ISSN 1684-5315 n 35 Fujita M., Nomura K., Hong K., Ito Y., Asada A., Nishimuro S (1993) Purification and characterization of strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan Biochem Biophys Res Commun, 197 (3): 1340 - 1347 10 Fujita M., Hong K., Ito Y., Fujii R., Kariya K., Nishimuro S (1995) Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat US National Library of Medicine National Institutes of Health 11 Fujita, M., Hong, K., Ito, Y., Fujii, R., Kariya,K., Nishimuro, S (1995) Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat Biol Pharm Bull 12 Fujita, M., Hong, K., Ito, Y., Misawa, S.,Takeuchi, N., Kariya, K., Nishimuro, S., (1995).Transport of nattokinase across the rat intestinal tract Biol Pharm Bull 13 Jang JY, Kim TS, Cai J, Kim J, Kim Y, Shin K, Kim KS, Park SK, Lee SP, Choi EK, Rhee MH., Kim YB (2013) Nattokinase improves blood flow by inhibiting platelet aggregation and thrombus formation US National Library of Medicine National Institutes of Health 14 Kim S., Choi N (2000) Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang Biotechnol Biochem, 64: 1722-1725 15 Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S (1996) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Appl Environ Microbiolo., 62 (7): 1488-2482 16 Martin Milner, N.D., Kouhei Makise, M.D (2002) Natto and Its Active Ingredient Nattokinase, Alternative & Complementary Therapies 17 Maruyama M & Sumi H (2008) Effect on Natto diet on blood pressure, JTTAS n 36 18 Merith Kivanc, Meral Yilmaz, Erdogan Cakir (2011) Isolation and identification of lactic acid bacteria from boza and their microbial activity against several reporter strains Turk Biol 35: 313-314 19 Murayama, M., Sumi, H (1998).Basic and Clinical Aspects of Japanese Traditional Food Natto.Miyazaki, Japan: Department of Physiology, Miyazaki Medical College 20 Ohkuro I., Komatsuzaki T (1981) The level of serum lysozyme activity in animals fed a diet containing natto bacilli in Japanese, Med Bio 21, Okamoto A., Hanagata H., Kawamura Y.,Yanagida F (1995).Antihypertensive substances in fermented soybean, natto Plant Foods Hum Nutr 22 Peddapalli Siva Rasagnya and Meena Vangalapati (2013) Study on optymization of process parameters for Nattokinase production by Bacillus subtilis NCIM 2724 and purification by liquid-liquid extraction International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technology, Vol 2, Issue ISSN: 2319-8753 23 Peng Y., Huang Q., Zhang R., Zhang Y (2003) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme proceduced by Bacillus amyliquefaciens DC-4 screened from dauchi, a traditional Chinese soybean food Comp Biochem Physiol Biochem MolBiol., 134: 45-52 24 Ralph E., Holsworth Jr.(2002).Nattokinase and Cardiovascular Health.Special Report 25 Sumi H (1994) Structure and Fibrinolytic Properties of Nattokinase Okayama, Japan: Department of Nutrition, Faculty of Health and Welfare Science, Okayama Prefectural University 26 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K.,Hirantani H (1990).Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase Acta Haematol n 37 27 Sumi H., Hamada H., Tsushima H et al (1987) A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto Fibrinolysis 2: 67 28 Sumi H., 1995, Healthy Mirobe “Bacillius Natto” , Japan Bio Science Laboratory 29 Sumi H Maruyama M 1995 Ảnh hưởng chế độ ăn Natto với huyết áp JTTAS 30 Svetoslav D Todorov, Leon M T Dicks (2005) Growth parameters influencing the production of Lactobacillus rhamnosus bacteriocins ST461BZ and ST462BZ Annals of Microbiology, 55(4) 283-289 31 Unrean P1., Nguyen NH (2012).Metabolic pathway analysis and kinetic studies for production of nattokinase in Bacillus subtilis US National Library of Medicine National Institutes of Health 32 Meruvu H., Vangalapati M., 2011 Nattokinase: A Review on Fibrinolytic Enzyme, International Journal of Chemical Tài liệu internet 33 http://giaoduc.net.vn/Suc-khoe/Chuyen-gia-Dinh-duong/9-cong-dungchua-benh-it-biet-cua-dau-nanh-post119335.gd n 38 PHỤ LỤC Bảng 7.1: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh Nattokinase chủng BL4 Thời gian nuôi cấy (h) Hoạt tính Nattokinase (U) 12 200 24 350 36 370 48 220 Bảng 7.2: Ảnh hưởng pH tới hoạt tính sinh Nattokinase vi khuẩn BL4 pH Hoạt tính Nattokinase (U) 320 330 390 300 Bảng 7.3: Ảnh hưởng nguồn cacbon tới tổng hợp Nattkinase vi khuẩn BL4 Nguồn cacbon 0,1% Glucose Maltose Sucrose Glycerol Hoạt tính (U) 380 390 310 350 n ... Phân lập nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme Nattokinase chủng vi khuẩn từ Boza 1.3 Yêu cầu - Phân lập chủng có khả sinh enzyme phân hủy máu đông Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza - Nghiên cứu. .. sinh Nattokinase sản phẩm Để đánh giá điều này, lựa chọn đề tài ? ?Phân lập nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza? ?? đề tài nghiên cứu 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân. .. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ Boza - Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn phân lập - Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng