O72 hzfqyrv4 dqxu

Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí ĐẶT VẤN ĐỀ Alginat polysaccarid tự nhiên, có nguồn gốc từ rong nâu số loài vi sinh vật Cho tới alginat muối ứng dụng nhiều ngành công nghiệp, dược phẩm thực phẩm… Trong lĩnh vực dược phẩm alginat dùng làm gạc băng vết thương, làm khuôn răng, làm tá dược sản xuất thuốc… Đặc biệt alginat sử dụng làm chất mang tốt kỹ thuật cố định tế bào Đây hướng ứng dụng với nhiều hứa hẹn Việt Nam nước nhiệt đới, với diện tích vùng biển rộng triệu km2, đường bờ biển dài 3000km, tài nguyên vô phong phú biển nước ta hệ sinh thái rong biển Với hàm lượng alginat thành phần rong từ 19% đến 44%, cao hẳn lồi rong giới, nguồn lợi có ý nghĩa to lớn mặt khoa học thực tiễn [9] Tuy nghiên cứu chiết xuất alginat phục vụ nhu cầu dược phẩm ứng dụng gel alginat cố định tế bào cịn quan tâm Vì đề tài “Khảo sát điều kiện chiết tách alginat từ rong mơ” tiến hành với hai mục tiêu:  Bước đầu khảo sát số điều kiện chiết xuất ảnh hưởng tới hiệu suất độ nhớt alginat thu  Đánh giá khả tạo gel khả cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae alginat chiết xuất Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí Chương I TỔNG QUAN 1.1 Rong mơ Việt Nam 1.1.1 Phân bố sản lượng Các loài rong mơ Việt Nam chủ yếu thuộc chi rong mơ (Sargassum), họ rong mơ (Sargassaceae), rong đuôi ngựa (Fucales), ngành rong nâu (Phaeophyta) [6] Đây nhóm rong biển có thành phần loài phong phú, phân bố phổ biến, sản lượng cao nguồn lợi tự nhiên lớn nguồn lợi rong biển Việt Nam Sản lượng rong mơ vùng ven biển nước ta vào khoảng 30.000-35.000 tươi/năm Đặc biệt có nơi sinh khối rong mơ lên đến 12kg/m2 [5, 10] Dọc theo khu vực bờ biển miền Trung có khoảng 68 lồi rong mơ phát hiện, thường phân bố tỉnh như: Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế…, hay gặp loài rong mơ nhánh bò S polycystum, rong mơ mềm S tenenium, rong mơ liềm S hemiphyllum [5, 10] Nhiều vùng thuận tiện cho việc khai thác vận chuyển, nhiên mùa vụ ngắn nên cần có biện pháp xử lý bảo quản nguyên liệu để sử dụng lâu dài cho năm 1.1.2 Thành phần hóa học số lồi rong mơ thường gặp Hàm lượng protein rong mơ không cao, khoảng 5-15% so với trọng lượng khô Lượng protein không phụ thuộc vào thành phần lồi mà cịn phụ thuộc vào trình phát triển cá thể, điều kiện sống rong, cách phơi sấy, bảo quản rong nguyên liệu Rong mơ chứa 17 loại acid amin có mặt tất acid amin thiết yếu Vì protein rong mơ có tính dinh dưỡng cao so với protein trồng cạn [10] Hàm lượng lipid chiếm phần nhỏ so với chất hữu khác rong Rong mơ có tới 28 loại acid béo chủ yếu acid palmitic, acid Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí oleic, acid linoleic với hàm lượng khoảng 0,2-0,6% so với trọng lượng khô [10] Thành phần quan trọng rong glucid, gồm nhóm monosaccarid polysaccarid Nhóm monosaccarid gồm đường đơn với tỷ lệ khác mannitol, galactose, mannose, xylose… Nhóm polysaccarid gồm có alginat, laminarin, fucoidan, cellulose… thành phần hóa học quan trọng alginat Laminarin chiếm 10-15%, có tới 43%; fucoidan chiếm khoảng 4%, có tới 20% Dạng chủ yếu alginat rong sợi calci magie alginat không tan, giúp tạo độ rắn cho thành tế bào Phần nhầy vô định hình bao quanh dạng sợi chủ yếu alginat tan nước fucoidan [7] Hàm lượng alginat rong vào khoảng 19-44% So với hàm lượng loài rong nâu giới hàm lượng rong mơ Việt Nam cao Đây tiêu cần thiết để rong mơ trở thành nguồn ngun liệu có giá trị cơng nghiệp sản xuất alginat [9] Các chất khống có mặt rong với tỷ lệ tùy loài, nơi phân bố giai đoạn phát triển Tổng lượng khống theo trọng lượng khơ dao động từ 20-40% [5, 10] Ngoài nguyên tố phổ biến K, Na, Ca, Mg…, rong mơ Việt Nam có khả tích tụ ngun tố stronti cao Hàm lượng iod khoảng 0,05-0,25% [9] Ngoài cịn có chất diệp lục số loại vitamin khác 1.1.3 Sử dụng nguồn lợi rong mơ nước ta  Cách sử dụng truyền thống: Hiện chưa có số liệu xác tình hình khai thác sử dụng rong mơ nước Nhiều vùng ven biển, rong thường khai thác dùng làm phân bón cho lồi thuốc lá, khoai lang, hành, tỏi… Đa Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí phần dùng rong làm thức ăn cho gia súc nguồn cung cấp khoáng nguyên tố vi lượng quan trọng Các hiệu thuốc Đông y bán rong khô loại dược thảo Chúng ngâm vào nước nóng uống trà để chữa bệnh bướu cổ cung cấp nguyên tố vi lượng khác [5, 10]  Sử dụng công nghiệp: Rong mơ nguồn nguyên liệu quan trọng công nghiệp sản xuất alginat có sản lượng lớn chứa hàm lượng alginat cao Trong khoảng thời gian 1980-1985 rong mơ khai thác đáng kể để sản xuất alginat dùng công nghiệp dệt (hồ vải, in vải) sau sản phẩm nước khơng cạnh tranh với alginat nhập ngoại chất lượng Việc mở hướng ứng dụng làm tăng giá trị sản phẩm alginat điều cần thiết để khai thác tối đa nguồn lợi rong mơ nước [5, 10] 1.2 Alginat 1.2.1 Cấu trúc alginat  Hai gốc monome: Alginat tên gọi chung muối acid alginic Acid alginic polysaccarid từ rong nâu (Phaeophyta) hay từ số loài vi sinh vật Khối lượng phân tử trung bình acid alginic từ 32.000 – 200.000 [9] Nó cấu tạo từ hai gốc thành phần acid α-L guluronic (G) acid β-D mannuronic (M) Hai cơng thức khác nhóm carboxyl (-COOH) nằm phía hay phía mặt phẳng vịng pyranose Hai gốc uronic có cấu tạo dạng ghế cấu hình khác Acid mannuronic có cấu hình C1 cịn acid guluronic có cấu hình 1C4 [9, 12, 18] Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic Hình 1.1: Cấu hình hai gốc monome phân tử acid alginic  Các block phân tử alginat: Hai monome không liên kết cách ngẫu nhiên mà tạo thành ba loại block: block homopolymeguluronic gồm gốc acid guluronic nối tiếp GGGG, block homopolymemannuronic gồm gốc acid mannuronic nối tiếp MMMM, block liên hợp MGMG [12] Chuỗi poly G có dạng gấp nếp cịn chuỗi poly M có dạng phẳng [9, 24, 25] Hình 1.2: Mơ hình số phân tử acid alginic Ngoài block G, block M block liên hợp MG trên, chuỗi alginat cịn có cấu trúc lặp không đặn GGM, MMG [7, 22] Như alginat chứa tất bốn loại liên kết glycosid MM, GG, MG, GM [12] Độ bền vững khối gia tăng theo trật tự MG < MM < GG [9] Tùy theo nguồn gốc Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí alginat mà độ dài trung bình mạch phân tử, độ dài block, tỷ lệ trình tự kết hợp chúng với có khác Điều làm cho tính chất alginat biến đổi dải rộng 1.2.2 Tính chất alginat  Độ tan: Acid alginic acid yếu, không tan dung môi hữu nước, lại có khả hấp thụ lượng nước từ 10-20 lần trọng lượng trương nở mạnh Acid alginic có khả hịa tan kiềm hóa trị I (Na+, K+ ) tạo dung dịch muối kiềm alginat có độ nhớt cao Muối amoni, muối amin phân tử lượng thấp muối hợp chất amin bậc bốn acid alginic tan nước Các muối kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+…) khơng tan nước (trừ muối Mg2+) mà tạo dạng gel với màu sắc khác tùy kim loại Khi cho acid mạnh tác dụng với muối kiềm alginat acid alginic tách kết tủa lên bề mặt dung dịch Tính chất quan trọng ứng dụng vào quy trình chiết xuất alginat Các muối alginat tan dung môi thân nước alcol, ceton…, hịa tan dễ dàng đun nóng [8]  Độ nhớt: Khi nằm vách tế bào, alginat có độ nhớt cao tách chiết phương pháp khác nhau, alginat bị giảm độ nhớt Alginat có khối lượng phân tử trung bình lớn độ nhớt dung dịch lớn Tỷ lệ M/G ảnh hưởng tới độ nhớt sản phẩm Tuy nhiên tỷ lệ M/G trọng lượng phân tử lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài rong, độ trưởng thành, khu vực sinh trưởng, kỹ thuật chiết xuất, thời gian bảo quản [7] Độ nhớt dung dịch alginat biến thiên dải rộng từ 10mPa.s – 1000mPa.s (dung dịch 1%) Với chút muối calci làm tăng độ nhớt cho sản phẩm Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí hay độ cứng gel calci alginat tạo Các alginat mà có tỷ lệ G cao hay M/G thấp cho gel rắn Nồng độ alginat tăng độ nhớt dung dịch alginat tăng theo Độ nhớt dung dịch phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, alginat dễ bị cắt mạch dẫn đến giảm độ nhớt Khi làm nguội độ nhớt quay giá trị thấp ban đầu Nếu hạ nhiệt độ tới nhiệt độ đông đặc sau rã băng khơng làm alginat giảm độ nhớt [9]  Độ ổn định: Giống polysaccarid tự nhiên khác alginat không bền với nhiệt ion kim loại Độ ổn định alginat xếp theo thứ tự: natri alginat > amoni alginat > acid alginic Alginat có độ nhớt cao ổn định alginat có độ nhớt trung bình thấp Bột alginat dễ bị giảm độ nhớt không bảo quản nhiệt độ thấp Khi lưu trữ alginat có độ nhớt khoảng 50mPa.s 10-200C, thời gian năm, độ nhớt thay đổi so với ban đầu Cịn với alginat có độ nhớt cao (khoảng 400mPa.s), bảo quản 250C sau năm độ nhớt bị giảm 10% 330C bị giảm 45% [25] Dung dịch alginat công nghiệp dễ bị rã vi sinh vật có khơng khí Dung dịch alginat ổn định pH từ 5,5-10 nhiệt độ phòng thời gian dài, chuyển dạng gel pH nhỏ 5,5 Một lượng nhỏ ion calci làm tăng độ ổn định dung dịch alginat [9]  Tính chất tạo gel: Dung dịch natri alginat có khả tạo gel với tham gia ion hoá trị II, III Khi nhỏ giọt dung dịch natri alginat vào dung dịch CaCl2 tạo gel xảy gần tức thời bề mặt giọt cho ta hạt gel có dạng hình cầu Các gel tạo thành nhiệt độ (dưới 1000C) khơng bị chảy đun nóng Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí Khả tạo gel giải thích mơ hình cấu trúc phân tử alginat – mơ hình “vỉ trứng” Khi có mặt ion hóa trị II, III nồng độ thích hợp tạo gel xảy ra, phân tử xếp song song, phần gấp nếp đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian chỗ đặt trứng Các ion calci chui vào khoảng trống này, liên kết với nhóm carboxyl ngun tử oxy vịng đoạn song song Lúc phân đoạn GGGG nối với qua ion Ca2+ làm cho phân tử gần ép nước ngồi, gel alginat hình thành [8, 24] Gel tạo tương tác tĩnh điện qua ion calci nên gel không thuận nghịch với nhiệt đàn hồi [7] Khả tạo gel độ bền phụ thuộc vào hàm lượng đoạn guluronic (G) Phản ứng tạo liên kết gel không xảy đoạn polymannuronic đoạn MG (mannuronic-guluronic) [8] Nhiều tài liệu cho thấy tỷ lệ G lớn so với M khả tạo gel alginat tốt Tỷ lệ M/G nhỏ khả tạo gel alginat cao [7, 8, 9] Hình 1.3: Mơ hình hạt gel calci alginat Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí Hình 1.4: Liên kết block G với ion calci Khả tạo gel muối alginat phụ thuộc vào kích thước ion kim loại Ion strontri có kích thước phù hợp với khoảng trống nên liên kết mạnh ưu tiên giữ lại có cạnh tranh Ca2+ Sr2+ Ion Mg2+ có kích thước nhỏ nên khơng tạo gel với natri alginat muối magnesi alginat tan nước [8, 16] Ái lực ion kim loại alginat xếp theo thứ tự sau: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+ [8] 1.2.3 Ứng dụng alginat Việc sử dụng alginat phụ thuộc vào ba thuộc tính Thứ khả hòa tan vào nước tạo dung dịch có độ nhớt tùy thuộc nồng độ Thứ hai khả tạo gel calci alginat Thứ ba thuộc tính tạo màng natri calci alginat sợi calci alginat [10] Alginat có nhiều ứng dụng ngành công nghiệp dệt, thực phẩm, giấy, dược phẩm… Ngành dệt sử dụng tới 50% lượng alginat chủ yếu loại sợi tổng hợp Thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng alginat khơng phản ứng với cellulose vải dễ rửa [11] Ngành cơng nghiệp thực phẩm dùng tới 20% lượng alginat để làm kem, thạch, bánh kẹo, nước sốt, xiro… Alginat sử dụng công nghiệp giấy, cao su… nhiều loại mỹ phẩm dầu gội, kem… Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 10 Trong ngành y tế dược phẩm, alginat dùng chiếm 5% tổng lượng alginat sử dụng Loại vải sợi sản xuất từ natri calci alginat sử dụng để băng vết thương có tác dụng cầm máu làm lành vết thương tốt Alginat dùng làm tá dược viên nén, tá dược kiểm sốt giải phóng dược chất dùng để đóng nang bao phim Với khả trương nở tiếp xúc với nước, alginat dùng ngăn trào ngược dày, giảm chứng ợ nóng, khó tiêu [11, 16] Trần Văn Luân cộng (1967), Trần Huy Thái (1976) nghiên cứu rong mơ làm thuốc ngừa chống bệnh bướu cổ, dùng làm phân bón hay thức ăn cho gia súc Khoa Dược trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh (1981) phân tích hàm lượng acid alginic số loài rong mơ thường gặp nguồn iod rong mơ dùng làm thuốc Hiện kỹ thuật bất động tế bào ngày phát triển đưa vào sử dụng rộng rãi thực tế Alginat ứng dụng để tạo bẫy dạng lưới Các enzym tế bào bẫy, nhốt khuôn gel calci alginat Gel calci alginat có nhiều ưu điểm như: khơng độc với tế bào, rẻ tiền, thực đơn giản, quy trình vi gói thực nhiệt độ bình thường nên không làm tổn thương tế bào… Sự sống tế bào kéo dài lâu hơn, giúp nâng cao hiệu suất hoạt động tế bào Ví dụ cố định tế bào nấm men hạt gel cho dịch đường chảy qua, đường lên men chuyển thành rượu [9] 1.3 Phương pháp chiết xuất 1.3.1 Nguyên tắc chung Alginat rong tồn dạng muối không tan Ca2+ Mg2+, phần muối Na+ Nguyên tắc chung sản xuất alginat chuyển đổi dạng muối không tan calci magnesi alginat rong sang dạng natri alginat tan nước điều kiện chiết xuất kiềm [13] Hiệu suất (%) Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 35 30 25 20 15 10 25 32.48 28.34 22.34 1% 2% 3% Nồng độ natri carbonat (%) Độ nhớt ( mPa.s) Hình 3.1: Sự thay đổi hiệu suất chiết theo nồng độ natri carbonat 3.21 3.5 2.77 1% 2% 3% Nồng độ natri carbonat (%) Hình 3.2: Sự thay đổi độ nhớt alginat thu theo nồng độ natri carbonat Khi tăng nồng độ kiềm, độ nhớt tăng lên giải thích: lúc đầu kiềm thấp, thành tế bào rong rắn có phần alginat phân tử nhỏ khuếch tán nên độ nhớt thấp Với nồng độ natri carbonat 1% 1000C/3h độ nhớt thu 3,21mPa.s Khi tăng nồng độ kiềm 2%, phản ứng xảy triệt để hơn, nồng độ alginat chiết cao hơn, độ nhớt tăng lên 3,50mPa.s Tuy nhiên lượng kiềm 3%, liên kết glucosid bị phá hủy, alginat phân tử lớn bị cắt mạch nhiều làm độ nhớt dung dịch đo giảm [8], 2,77mPa.s Điều hoàn toàn phù hợp với kết nghiên Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 26 cứu Võ Thị Mai Hương luận án tiến sỹ (2003) Khi tăng nồng độ natri carbonat từ 0,7% lên 2,1% độ nhớt tăng từ 287,67mPa.s đến 377,00mPa.s [7] Như với nồng độ natri carbonat 2% dung dịch alginat thu có độ nhớt lớn Trong thí nghiệm ta sử dụng nồng độ natri carbonat 2% 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian  Mục tiêu: Khảo sátảnh hưởng thời gian chiết lên hiệu suất alginat thu độ nhớt dung dịch alginate thu  Tiến hành: Cố định nồng độ natri carbonat 2%, nhiệt độ chiết 1000C, thay đổi thời gian chiết theo giá trị 1h, 2h, 3h Ở thời gian làm với ba mẫu rong, xác định hiệu suất độ nhớt alginat thu được, lấy kết trung bình  Kết thu sau: Bảng 3.2: Ảnh hưởng thời gian chiết tới hiệu suất độ nhớt alginat Thời gian 1h 2h 3h Hiệu suất (%) 25,44 27,44 28,34 Độ nhớt (mPa.s) 3,97 4,07 3,50 Thời gian chiết gồm thời gian natri carbonat thấm vào tế bào, trao đổi ion thời gian natri alginat khuếch tán ngồi Vì thời gian dài alginat thu nhiều hơn, cụ thể thời gian tăng từ 1h lên 3h hiệu suất tăng từ 25,44% đến 28,34% Cũng theo nghiên cứu P Vauchel cộng (2009), loài Laminaria digitata, tăng dần thời gian, hiệu suất tăng dần Đến mốc thời gian khoảng 3h, hiệu suất thu tối đa gần không tăng thêm kéo dài thời gian chiết [25] Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 27 29 28.34 Hiệu suất (%) 28 27.44 27 26 25.44 25 24 23 1h 2h 3h Thời gian (h) Hình 3.3: Sự thay đổi hiệu suất chiết theo thời gian chiết Tuy nhiên kéo dài thời gian gây giảm độ nhớt alginat Khi chiết với thời gian 1h độ nhớt 3,97mPa.s, tăng thời gian chiết lên 2h độ nhớt có tăng 4,07mPa.s, nhiên kéo dài thời gian lên 3h độ nhớt giảm cịn 3,50mPa.s Kết thời gian kéo dài làm chuỗi polysaccarid alginat bị cắt mạch nhiều [1] Độ nhớt (mPa.s) 4.2 4.07 3.97 3.8 3.6 3.5 3.4 3.2 1h 2h 3h Thời gian (h) Hình 3.4: Sự thay đổi độ nhớt dung dịch alginat theo thời gian Đồ thị cho thấy chiết điều kiện nồng độ natri carbonat 2% thời gian 2h cho alginat có độ nhớt cao Kết khác với kết luận Marcia R Torres cộng nghiên cứu (2007) loài S Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 28 vulgare Độ nhớt dung dịch alginat với điều kiện chiết 2% natri carbonat mà tác giả thu được, đạt cao sau khoảng 3h Điều lồi rong khác nhau, thời kỳ phát triển rong khác nhau, nên cấu trúc phân tử alginat rong khác dẫn đến khoảng thời gian cho độ nhớt cao khác [23] 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ  Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết lên hiệu suất alginat thu độ nhớt dung dịch alginat thu  Tiến hành: Cố định nồng độ natri carbonat 2%, thời gian chiết 2h, thay đổi nhiệt độ chiết theo ba giá trị 500C, 800C, 1000C Làm ba lần, xác định hiệu suất độ nhớt alginat thu được, lấy kết trung bình  Kết thu sau: Bảng 3.3: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết tới hiệu suất độ nhớt alginat Nhiệt độ 1000C 800C 500C Hiệu suất (%) 27,44 25,34 18,92 Độ nhớt (mPa.s) 4,07 4,92 4,42 Kết bảng cho thấy tăng nhiệt độ từ 500C tới 1000C, hiệu suất thu tăng từ 18,92% lên 27,44% Hiệu suất (%) Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 30 25 20 15 10 29 25.34 27.44 18.92 50 80 100 Nhiệt độ (độ C) Hình 3.5: Sự thay đổi hiệu suất chiết theo nhiệt độ chiết Điều giải thích sau: nhiệt độ tăng phản ứng xảy với tốc độ nhanh hơn, đồng thời nhiệt độ tăng làm phá vỡ tế bào rong, rong mềm ra, tạo điều kiện cho khuếch tán kiềm vào tế bào phía trong, phản ứng acid alginic natri carbonat thuận lợi hơn, đồng thời tạo điều kiện cho khuếch tán phân tử alginat Kết phù hợp với kết luận Gustavo cộng [19] Theo Gustavo, nghiên cứu chiết ba nhiệt độ 700C, 800C, 900C, 900C hiệu suất alginat thu cao 21,9% Độ nhớt (mPa.s) 4.42 4.92 4.07 50 80 100 Nhiệt độ (độ C) Hình 3.6: Sự thay đổi độ nhớt dung dịch alginat theo nhiệt độ chiết Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 30 Tuy nhiên, nhiệt độ cao gây giảm độ nhớt đáng kể, chiết xuất nồng độ kiềm 2%, thời gian chiết 2h, 1000C độ nhớt thu 4,07mPa.s, 500C độ nhớt thu 4,42mPa.s Thực nghiệm cho thấy, mức nhiệt khoảng 800C, hiệu suất độ nhớt alginat đạt giá trị cao Điều giống với nghiên cứu Ricardo cộng (2007) [25], nghiên cứu Thomas A Davis (2004) [26] 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alginat lên trình cố định tế bào vi sinh vật 3.2.1 Xác định nồng độ alginat thích hợp tạo gel  Mục tiêu: Xác định nồng độ alginat thích hợp tạo gel sử dụng cố định tế bào  Tiến hành: Pha dung dịch alginat có nồng độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 6% Mỗi nồng độ khoảng 20ml Chuẩn bị 300 ml dung dịch calci clorid 2% chia vào cốc có mỏ Dùng pipet Pasteur nhỏ dung dịch alginat vào calci clorid 2% Giữ hạt dung dịch CaCl2 khoảng 1,5h Đánh giá tiêu cảm quan hạt, thể chất hạt, hình dạng, độ cứng hạt tạo  Kết thu sau: Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 31 Bảng 3.4: Thể chất hạt gel tạo alginat chiết nồng độ khác Nồng độ alginat (%) 1,0 Thể chất hạt sau tạo gel Không tạo gel 2,0 Tạo gel, hạt méo, có đi, hạt gel mềm 3,0 Tạo gel, hạt méo, mềm 4,0 Tạo gel, hạt cầu, cứng, đặc 5,0 Tạo gel, cứng, chắc, hình cầu 6,0 Tạo gel, cầu, rắn Cơ chế tạo gel: Khi nhỏ alginat vào dung dịch CaCl2 ion Ca2+ tạo phức với gốc α – L – Guluronic (G) tạo thành gel bề mặt ngồi giọt dung dịch natri alginat, sau Ca2+ tiếp tục khuếch tán vào bên giọt để phản ứng Nói cách khác, q trình tạo gel xảy bề mặt giọt dung dịch phát triển vào bên Alginat tập trung nhiều bề mặt giảm dần vào trung tâm, mạng lưới gel trung tâm thưa [9] Với nồng độ alginat thấp, có lớp mỏng bên ngồi tạo gel, hạt gel mềm, rỗng giữa, khả cố định tế bào thấp Còn với nồng độ cao, dung dịch alginat đặc, tạo gel khó khăn Mặt khác, hạt gel rắn, gây khó khăn cho khuếch tán chất vào hạt gel khuếch tán sản phẩm ngồi khó khăn Sử dụng nồng độ từ 4% trở lên, alginat có khả tạo hạt hình cầu, có độ phù hợp với việc giữ cố định tế bào hệ gel Do thí nghiệm sử dụng alginat 4% để tạo hệ gel cố định tế bào Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 32 Hình 3.7: Hạt gel calci alginat thu nồng độ alginat 4% 3.2.2 Số lượng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có hạt gel calci alginat cố định  Mục tiêu: Xác định số lượng tế bào nấm men mà alginat chiết xuất cố định được, so sánh với alginat thị trường (nguồn gốc Trung Quốc)  Tiến hành: Nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào nấm men, cố định tế bào nấm men với alginat chiết nồng độ 4% theo phương pháp mục 2.3.2.2, xác định số lượng tế bào nấm men cố định 1g hạt calci alginat theo phương pháp mục 2.3.2.3  Kết thu sau: Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 33  Đối với alginat chiết xuất được: Bảng 3.5: Số lượng tế bào nấm men cố định alginat chiết xuất Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Χ 10 1,33 10,33 156,00 2,67 28,67 128,00 2,33 17,00 223,00 2,33 20,67 143,00 Trung bình 2,17 19,17 162,50 Χ 10 Χ 10 Nhận xét: Bảng 3.5 cho thấy số lượng tế bào nấm men cố định 1g hạt gel calci alginat 4% vào khoảng 1,63 Χ 107 – 2,17 Χ 107 tế bào  Đối với alginat thị trường (nguồn gốc Trung Quốc): Bảng 3.6: Số lượng tế bào nấm men cố định alginat thị trường (nguồn gốc Trung Quốc) Số lượng tế bào Lần thí nghiệm Χ 10 8,33 48,67 183,33 6,33 15,67 106,33 39,67 48,67 + 37,33 90,00 147,33 Trung bình 22,92 50,75 145,66 Χ 10 Χ 10 Nhận xét: Kết cho thấy số lượng tế bào nấm men cố định 1g hạt gel calci alginat 4% vào khoảng 1,45 Χ 107 – 2,29 Χ 108 tế bào [3] Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 34 Bảng 3.7: So sánh số lượng tế bào gói 1g hạt alginat chiết xuất alginat thị trường Alginat chiết xuất Số lượng tế bào trung 1,63 Χ 107 – 2,17 Χ 107 Alginat thị trường 1,45 Χ 107 – 2,29 Χ 108 bình Khả cố định tế bào alginat thu thấp alginat thị trường, giải thích alginat chiết xuất có độ nhớt thấp hơn, khả tạo gel hơn, hạt gel hình thành có cấu trúc lưới khó giữ tế bào cố định Thực tế, trình chiết, độ nhớt dung dịch alginat bị ảnh hưởng nhiều yếu tố: trình xử lý rong acid (ảnh hưởng tới liên kết glucosid acid alginic), oxy hóa hợp chất phenol, ảnh hưởng kiềm chiết xuất, trình tủa với cồn cao độ, nhiệt độ sấy khô Sự cắt mạch polysaccarid alginat yếu tố gây giảm độ nhớt, giảm khả tạo gel [9] Tùy theo loài rong, độ trưởng thành vùng sinh trưởng, cấu trúc mạch alginat có khác Ngay yếu tố kiềm, acid, enzym thân rong gây tác động không nhỏ Chính q trình thu hái, bảo quản tách chiết, chuỗi polysaccarid alginat bị cắt mạch nhiều làm ảnh hưởng đáng kể tới cấu trúc alginat thu Điều làm alginat chiết xuất có tỷ lệ block G alginat thị trường nên khả tạo gel hơn, gel bền vững Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT  Kết luận: Trên sở nghiên cứu đề tài, rút số kết luận: Đã chiết xuất alginat từ rong mơ, phương pháp chiết nóng với kiềm natri carbonat Khảo sát ảnh hưởng nồng độ natri carbonat, thời gian, nhiệt độ chiết, đến hiệu suất độ nhớt alginat thu Theo chiều tăng nồng độ natri carbonat (1% – 3%), thời gian (1h – 3h) nhiệt độ (500C – 1000C), hiệu suất độ nhớt tăng Tuy nhiên đến giới hạn định việc tăng thông số điều kiện chiết lại làm ảnh hưởng tới độ nhớt Xác định điều kiện chiết xuất: nồng độ natri carbonat 2%, nhiệt độ 800C thời gian 2h cho độ nhớt cao tương ứng 4,92mPa.s hiệu suất đạt 25,34% Alginat chiết xuất tạo gel nồng độ 4% với số lượng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định 1,63 Χ 107 – 2,17 Χ 107 tế bào 1g hạt  Đề xuất: Do hạn chế thời gian hóa chất nghiên cứu, để đề tài hồn thiện hơn, đề xuất sau: Tiếp tục nghiên cứu điều kiện chiết xuất tinh chế để thu alginat có hiệu suất độ nhớt mong muốn Tiếp tục nghiên cứu khả cố định tế bào alginat thu được, ứng dụng sản xuất sản phẩm phục vụ nhu cầu ngành Dược Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 36 MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I TỔNG QUAN 1.1 Rong mơ Việt Nam 1.1.1 Phân bố sản lượng 1.1.2 Thành phần hóa học số loài rong mơ thường gặp 1.1.3 Sử dụng nguồn lợi rong mơ nước ta 1.2 Alginat 1.2.1 Cấu trúc alginat 1.2.2 Tính chất alginat 1.2.3 Ứng dụng alginat 1.3 Phương pháp chiết xuất 10 1.3.1 Nguyên tắc chung 10 1.3.2 Quy trình tách chiết 13 1.3.3 Tình hình nghiên cứu chiết xuất alginat 14 Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Rong mơ 17 2.1.2 Các hóa chất sử dụng 17 2.1.3 Chủng vi sinh vật môi trường sử dụng 17 2.1.4 Các máy móc, thiết bị sử dụng 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 37 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chiết xuất rong mơ lên hiệu suất độ nhớt alginat thu 19 2.2.2 Đánh giá khả cố định tế bào vi sinh vật alginat thu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp chiết xuất alginat từ rong mơ 19 2.3.2 Phương pháp đánh giá khả cố định tế bào alginat thu 21 2.3.2.1 Phương pháp xác định nồng độ alginat tạo gel 21 2.3.2.2 Phương pháp cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hạt calci alginat 22 2.3.2.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào có 1g hạt calci alginat 23 Chương III KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chiết xuất rong mơ lên hiệu suất độ nhớt alginat thu 24 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ natri carbonat 24 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian 26 3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 28 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alginat lên trình cố định tế bào vi sinh vật 30 3.2.1 Xác định nồng độ alginat thích hợp tạo gel 30 3.2.2 Số lượng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có hạt gel calci alginat cố định 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 38 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm thay đổi điều kiện chiết alginat từ rong mơ 20 Bảng 3.1: Ảnh hưởng nồng độ natri carbonat tới hiệu suất độ nhớt alginat 24 Bảng 3.2: Ảnh hưởng thời gian chiết tới hiệu suất độ nhớt alginat 26 Bảng 3.3: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết tới hiệu suất độ nhớt alginat 28 Bảng 3.4: Thể chất hạt gel tạo alginat chiết nồng độ khác 31 Bảng 3.5: Số lượng tế bào nấm men cố định alginat chiết xuất 33 Bảng 3.6: Số lượng tế bào nấm men cố định alginat thị trường (nguồn gốc Trung Quốc) 33 Bảng 3.7: So sánh số lượng tế bào gói 1g hạt alginat chiết xuất alginat thị trường 34 Ket-noi.com kho tài liệu miễn phí 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Cấu hình hai gốc monome phân tử acid alginic Hình 1.2: Mơ hình số phân tử acid alginic Hình 1.3: Mơ hình hạt gel calci alginat Hình 1.4: Liên kết block G với ion calci Hình 1.5: Sơ đồ hai quy trình tinh chế natri alginat 13 Hình 2.1: Nhớt kế Ốt – oan 21 Hình 2.2: Sơ đồ trình cố định tế bào 22 Hình 3.1: Sự thay đổi hiệu suất chiết theo nồng độ natri carbonat 25 Hình 3.2: Sự thay đổi độ nhớt alginat thu theo nồng độ natri carbonat 25 Hình 3.3: Sự thay đổi hiệu suất chiết theo thời gian chiết 27 Hình 3.4: Sự thay đổi độ nhớt dung dịch alginat theo thời gian 27 Hình 3.5: Sự thay đổi hiệu suất chiết theo nhiệt độ chiết 29 Hình 3.6: Sự thay đổi độ nhớt dung dịch alginat theo nhiệt độ chiết 29 Hình 3.7: Hạt gel calci alginat thu nồng độ alginat 4% 32