Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể của loài dầu nước (dipterocarpus alatusroxb ex g don) ở rừng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o NGUYỄN MINH ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CỦA LOÀI DẦU NƯỚC (DIPTEROCARPUS ALATUS ROXB EX G.DON) Ở RỪNG NHIỆT ĐỚI ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Thị Phương Trang Hà Nội – 2014 c MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Mục lục Lời cảm ơn i Danh mục từ viết tắt, ký hiệu ii Danh mục bảng iii Danh mục hình iv MỞ ĐẦU NỘI DUNG Chương Tổng quan tài liệu 1.1Tổng quan họ Dầu 1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) 1.3 Một số khái niệm quần thể thực vật phân cắt nơi sống 1.3.1 Quần thể thực vật 1.3.2 Nơi sống phân cắt 1.3.3 Quần thể nhỏ cô lập 1.3.4 Bảo tồn quản lý tài nguyên di truyền thực vật 1.4 Một số kỹ thuật nghiên cứu đa dạng di truyền tiến hóa phân tử 1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) 13 1.6 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) sở vùng gen matK 14 Chương Đối tượng, địa điểm phương pháp nghiên cứu 17 c 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể 10 quần thể Dầu nước (Dipterocapus alatus) 18 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài loài họ Dầu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Khảo sát thực địa 22 2.3.2 Phương pháp thu mẫu 22 2.3.2 Phân tích phịng thí nghiệm 22 2.4 Phân tích số liệu 28 2.4.1 Đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước 28 2.4.2 Mối quan hệ di truyền số loài họ Dầu 28 Chương Kết thảo luận 30 3.1 Nơi sống, cấu trúc phân tầng rừng, trạng quần thể Dầu nước tự nhiên 30 3.1.1 Nơi sống cấu trúc phân tầng rừng 30 3.1.2 Cấu trúc tuổi quần thể loài Dầu nước 45 3.1.3 Hiện trạng quần thể Dầu nước tự nhiên, số nguyên nhân làm suy giảm kích thước quần thể 46 3.2 Đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước 48 3.2.1 Kết tách chiết DNA, PCR điện di sản phẩm 48 3.2.2 Kết phân tích đa dạng di truyền quần thể 51 3.3 Đặc điểm vùng gen matK mối quan hệ di truyền 11 loài Dầu Việt Nam 58 Danh sách trình tự công bố lên Ngân hàng gen giới c (Genbank): 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 Kết luận 65 Kiến nghị 66 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC c MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, áp lực tăng dân số tốc độ phát triển kinh tế diễn nhanh, thảm thực vật rừng tự nhiên, nơi chứa đựng đa dạng sinh học cao nước ta bị phân cắt suy giảm mạnh Các mảnh rừng cịn sót lại hậu trình phân cắt thường bị giới hạn kích thước Những quần thể thực vật rừng thường dễ bị tổn thương có khả thích nghi mơi trường sống bị thay đổi, đặc biệt chịu áp lực biến đổi khí hậu Các họ Dầu loài rừng chiếm ưu thế, đóng vai trị quan trọng cân sinh thái kinh tế Hiện có 45 loài biết đến từ chi Việt Nam, chủ yếu địa đặc hữu Do có giá trị thương mại cao nhu cầu sử dụng gỗ địa phương mà họ Dầu bị khai thác cách mạnh mẽ Hơn nữa, nhiều năm, áp lực tăng trưởng kinh tế dẫn đến suy giảm lớn khu vực rừng tăng mức độ phân mảnh khu rừng cịn sót lại Những xu hướng thay đổi dẫn đến ảnh hưởng trực tiếp mang tính bất lợi đến môi trường sống đe dọa nghiêm trọng tồn họ Dầu Hiện nay, 33 loài họ Dầu bị đe dọa mức độ toàn cầu Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb ex G.Don) sử dụng rộng rãi cho lĩnh vực làm đồ nội thất xây dựng Bên cạnh đó, chúng cịn sử dụng nguồn cho tinh dầu có giá trị sử dụng phổ biến thương mại Loài Dầu phân bố khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp Ở Việt Nam, giảm môi trường sống khai thác mức, loài liệt kê bị đe dọa Cho đến nay, thiếu thông tin quan trọng đa dạng di truyền cấp độ quần thể loài, đặc biệt tác động có hại từ hoạt động người đến loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Nghiên cứu góp phần giải vấn đề có liên quan cung cấp thêm thơng tin cho ngành kiểm lâm để nhấn mạnh cần thiết việc bảo tồn sử dụng loài cộng đồng địa phương Để nâng cao hiểu biết sinh học bảo tồn, luận văn tiến c hành xác định thông số di truyền học quần thể phát triển lồi, q trình chia cắt nơi sống có liên quan đến hoạt động người Mục tiêu nghiên cứu - Mục tiêu chung: Đóng góp cho cơng tác bảo tồn phục hồi hữu hiệu loài quý bị đe doạ Việt Nam Giúp nhà quản lý hiểu biết sâu mức độ tiến hoá, quan hệ di truyền loài họ Dầu Các yếu tố tác động người làm xói mịn cấu trúc di truyền quần thể loài Mục tiêu giúp cộng đồng nhà khoa học hiểu biết rõ trình tuyệt chủng mức độ tiến hố lồi khơng cho lồi họ Dầu mà cịn áp dụng cho lồi khác có lịch sử sống tương tự nâng cao đời sống cộng đồng địa phương - Mục tiêu cụ thể: Xác định mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) có phân bố Việt Nam Xác định nguyên nhân làm tính đa dạng di truyền quần thể, đưa giải pháp phục hồi sử dụng bền vững loài Dầu nước Xác định mối quan hệ di truyền số loài họ Dầu phân bố Việt Nam Nội dung nghiên cứu Khảo sát, điều tra trạng phân bố, cấu trúc quần thể loài Dầu nước phân bố tỉnh miền Đông Nam Bộ Việt Nam gồm: Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, tỉnh Nam Trung Bộ: Phú Yên tỉnh Tây Nguyên: Đắk Lắk Xác định thông số di truyền phân tích ảnh hưởng biến động mơi trường sống có liên quan đến tác động người đến quần thể loài Dầu nước tỉnh miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ Tây Nguyên Việt Nam phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats) c Xác định mối quan hệ di truyền loài thuộc họ Dầu Việt Nam sở phân tích trình tự gen matK Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn: Luận văn cho phép nhà khoa học hiểu biết rõ mức độ suy giảm đa dạng di truyền mức độ quần thể lồi lồi Dầu nước (Dipterocarpus alatus) mà cịn áp dụng cho loài Dầu khác bị đe doạ xác định vị trí phân loại sở phân tích trình tự vùng gen matK cho số loài Dầu Việt Nam Luận văn cung cấp sở khoa học cho nhà quản lý cập nhật thông tin giá trị bảo tồn nâng cao hiểu biết người dân sống gần rừng tuyệt chủng loài cần bảo vệ Kết luận văn đóng góp cho cơng tác bảo tồn quản lý hữu hiệu nguồn gen loài thực vật quý có nguy tuyệt chủng, nâng cao hiểu biết rõ phương thức sinh sản mức độ đa dạng di truyền quần thể Dầu, thu thập thông tin ảnh hưởng người dân địa phương đến tính đa dạng di truyền loài c CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan họ Dầu Họ Dầu cịn gọi Họ Hai cánh có danh pháp khoa học Dipterocarpaceae gồm có 17 chi khoảng 580-680 loài thân gỗ chủ yếu phân bố rừng mưa nhiệt đới vùng đất thấp với hai cánh Tên gọi khoa học họ xuất phát từ chi điển hình Dipterocarpus, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (di = hai, pteron = cánh karpos = quả, nghĩa có hai cánh) Các chi lớn Shorea (196-360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) Vatica (60-65 loài) Nhiều loài chiếm ưu cánh rừng nhiệt đới núi thấp (dưới 500m so với mặt nước biển), thông thường cao tới 40– 70m, đơi 80m (Dryobalanops, Hopea Shorea) Chúng phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới, từ miền bắc Nam Mỹ tới Châu Phi, Seychelles, Ấn Độ, Đông Dương Malaysia, với đa dạng phổ biến miền tây Malaysia Theo Nguyễn Hồng Nghĩa (2005) [4], Việt Nam có 42 loài Dầu thuộc chi: Anisoptera (1 loài), Dipterocarpus (12 loài), Hopea (11 loài), Parashorea (2 loài), Shorea (8 loài) Vatica (8 loài) Phần lớn loài tìm thấy rừng nhiệt đới thường xanh rừng khộp hỗn giao độ cao khoảng 500m Các họ Dầu đóng vai trị quan trọng sinh thái kinh tế hệ sinh thái rừng núi thấp Gỗ thường sử dụng để đóng tàu, thuyền Nhựa sử dụng cho việc sơn làm đồ mỹ nghệ 1.2 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Cây Dầu nước (Dipterocarpus alatus Roxb ex G.Don) phân bố rừng nhiệt đới ẩm núi thấp Việt Nam, Lào, Campuchia Thái Lan Ở Việt Nam, loài phân bố rộng từ Nam Trung Bộ đến Đông Nam Bộ Phú Quốc Dầu nước gỗ lớn, chiều cao thơng thường 30-35m, có đạt tới 40-45m, đường kính ngang ngực đạt tới 250cm Dầu nước thường chiếm tầng cao, ưu rừng Thân tròn đều, dáng thẳng đẹp Gỗ màu nâu đỏ nhạt, thớ thô, bền Cây trước tuổi trưởng thành có tán hình chóp trưởng c thành, có tán hình lọng Vỏ mỏng có màu xám trắng nhẵn Lá đơn mọc cách, hình bầu dục trái xoan, dài 10-20cm, rộng 5-15cm; đầu nhọn; gốc hình nêm hay hình trịn Phiến có màu xanh thẫm mặt trên, màu xanh nhạt có lớp lông mịn phủ mặt dưới, gân bên 11-18 đơi Lá kèm có lơng màu vàng xám nhạt Quả gần hình cầu, có cạnh rõ, đường kính 11,5cm Quả có cánh đài nhẵn; hai cánh to, cánh dài từ 10-14cm, rộng 1,5-2cm, xếp song song, có màu đỏ tươi non chuyển thành màu vàng chín già; cánh nhỏ có kích thước 1,2-1,4cm Mỗi có hạt Mùa chín tháng 3-4 hàng năm, thường tập trung vào cuối tháng đầu tháng 1.3 Một số khái niệm quần thể thực vật phân cắt nơi sống 1.3.1 Quần thể thực vật Quần thể định nghĩa tập hợp nhóm cá thể loài nơi sống cụ thể vậy, chúng độc lập với quần thể khác quan hệ sinh sản Về mặt di truyền, quần thể liên quan mức độ cá thể, chúng truyền từ hệ sang hệ khác, bị ảnh hưởng yếu tố kích thước quần thể, sức sinh sản, khả sống sót, phương thức sinh sản, trao đổi đột biến di truyền Kích thước quần thể kết tương tác phức tạp liên quan đến điều kiện môi trường sống đặc tính quần thể lồi Kích thước quần thể đóng vai trị quan trọng liên quan đến phương thức sinh sản, di truyền tiến hoá Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế hệ tiếp theo) quần thể lồi Thụ phấn chéo từ cá thể dịng với cá thể dịng khác sản sinh cá thể lai đa dạng Cấu trúc di truyền cá thể có nhiều hội đóng góp vào tính đa dạng quần thể trì khả thích nghi cao hồn cảnh mơi trường sống Tác động người đến môi trường sống thường dẫn đến phá vỡ cấu trúc quần thể thiết lập quần thể nhỏ, cô lập cuối làm suy giảm khả thích nghi quần thể với môi trường sống chúng Ở hệ sản sinh thụ phấn cận noãn dẫn đến hậu nghiêm trọng: c khác di truyền quần thể bị thu hẹp, tính đa dạng di truyền tăng tần số gen đồng hợp tử quần thể nhỏ 1.3.2 Nơi sống phân cắt Nơi sống lồi thiết lập q trình hình thành loài Phân cắt xảy nơi sống bị chia nhỏ cô lập với ma trận cảnh quan khác không giống ban đầu khơng phù hợp cho tồn lồi Như vậy, phân cắt tạo nên phá vỡ nơi sống Tác nhân gây phân cắt bao gồm: mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, xây dựng khu dân cư, cơng trình phát triển kinh tế khai thác khoáng sản Phân cắt đe dọa đến tính thống sinh thái vùng rộng lớn hình thành lịch sử phát triển loài nguyên nhân gây tuyệt chủng (Schonewald-Cox et al., 1983) [49] Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hưởng đến kích thước quần thể phân mảnh nơi sống cịn sót lại ảnh hưởng đến phát tán lồi Hậu q trình phân cắt thường làm suy giảm chức hệ sinh thái cuối nơi sống Các quần thể nhỏ bị lập mảnh nơi sống cịn sót lại dễ bị tổn thương có khả thích nghi điều kiện môi trường sống chúng bị thay đổi (Keller Waller, 2002) [29] Tất nhiên, hậu dẫn đến tính đa dạng di truyền hai mức độ quần thể loài cuối nhiều loài bị đe doạ tuyệt chủng Các mảnh rừng tự nhiên cịn sót lại hậu phân cắt thường bị giới hạn kích thước suy giảm chất lượng Các mảnh rừng chứa đựng quần thể nhỏ bị cô lập khoảng cách lớn Đây bước trình suy giảm nơi sống, dẫn đến chức hệ sinh thái cuối nơi sống Quần thể nhỏ cô lập thường dễ bị tổn thương có khả thích nghi mơi trường sống bị thay đổi cấu trúc hữu hiệu thiết lập q trình hình thành lồi quần thể bị phá vỡ Phân cắt nơi sống có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sinh sản loài gây biến đổi bất lợi mơi trường, kích thước cấu trúc di truyền quần thể c Bảng 3.7 Khoảng cách di truyền cặp loài họ Dầu nghiên cứu Mức độ sai khác thấp tìm thấy cặp lồi Dầu cát (Dipterocarpus condorensis) Dầu lông (D intricatus), Dầu baud (D baudii), Dầu nước (D alatus) với tỷ lệ 0,1% Sự khác lớn loài chi ghi nhận lồi có vùng phân bố địa lý xa nhau, chẳng hạn khoảng cách di truyền Chị nâu (D retusus) lồi có phân bố rải rác số tỉnh phía Bắc Việt Nam với Dầu mít (Dipterocarpus costatus), Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) có phân bố tỉnh phía Nam Việt Nam là: 0,7%; 0,8% 0,9% Tỷ lệ sai khác trung bình loài chi Dipterocarpus 0,3%, tỷ lệ sai khác trung bình So chai (H recopei) Tàu trắng (Vatica odorata) với loài chi Dipterocarpus 2,5%; 3,9% Khơng có sai khác tìm thấy số cặp lồi chi Dipterocarpus Dầu cát Dầu mít, Dầu lơng Dầu đồng Dầu trà beng Nguyên nhân lồi chi Dipterocarpus có sai khác nhỏ, vùng gen matK lựa chọn chưa thực phù hợp cho nghiên cứu phân loại cấp độ loài loài họ Dầu nói chung với chi Diterocarpus nói riêng Nhiều nghiên cứu trước cho thấy họ Dầu (Dipterocarpaceae) họ phức tạp chưa có kết thống c vị trí phân loại loài chi họ Dầu Năm 1999, Yamazaki T cộng dựa giải trình tự gen matK, trnL – trnF xác định mối quan hệ di truyền họ Dầu Đông Nam Á, kết cho thấy chi Hopea chi gần gũi với Neobalanocarpus heimii nhóm lớn Shorea (Yamazaki T et al., 1999) [62] Tuy nhiên, năm 2006, Gamage xác định lại sơ đồ hình (Neighbor joining) mối quan hệ di truyền loài họ Dầu dựa giải trình tự vùng gen trnL – trnF, gen matK gen trnL loài họ Dipterocarpaceae (Gamage T Det al., 2006) [19], kết cho thấy Hopea chi gần gũi với Neobalanocarpus heimii độc lập với chi Shorea Ngoài Yamazaki, 1998 Koichi Kamiya, 2005 phân tích mức độ sai khác di truyền loài chi họ Dầu cho kết sai khác nhỏ, cụ thể, tỷ lệ sai khác di truyền loài chi Dipterocarpus 0,00533; loài chi Hopea 0,00959 (0,0025 (Koichi Kamiya et al., 2005) [30]), hay loài chi Shorea 0,01079 (Yamazaki T et al., 1999) [62]; Hopea Kress 2007 nghiên cứu họ Dầu gợi ý sử dụng lô cút bao gồm: rbcL gene, rpoB2 gene, rpoC1 gene, ITS1 gene trnH-psbA spacer [32] Nhóm nghiên cứu thực vật (CBOL, 2009) đánh giá bảy lô cút bao gồm atpFatpH spacer, matK gene, rbcL gene, rpoB gene, rpoC1 gene, psbK-psbI spacer, and trnH-psbA spacer cho ba nhóm lồi thực vật cạn khác nhau, kết cho thấy kết hợp hai thị rbcL matK cho kết tốt tổng số 550 loài nghiên cứu [14] Do vậy, với lồi có sai khác di truyền nhỏ thị matK chưa đủ để phân biệt cấp độ lồi Việc cần có nghiên cứu dựa kết hợp vùng gen khác matK, rbcL, trnH-psbA, cần thiết cho việc nghiên cứu xác mối quan hệ lồi họ Dầu (Dipterocarpaceae) Trên sở liệu trình tự gen matK 11 loài Dầu nghiên cứu, sơ đồ hình mối quan hệ di truyền 11 loài họ Dầu Việt Nam xác định theo phương pháp NJ (Neighbor-Joining) (Hình 3.4) Các lồi thuộc chi dầu Dipterocarpus có quan hệ mật thiết với nhau, với giá trị bootstrap lớn 60% c D baudii D dyeri Lồi Chị nâu (D retusus) xác định lồi chị em lồi cịn lại chi Dầu Dipterocarpus Hình 3.8 Mối quan hệ di truyền 11 lồi Dầu theo phương pháp NJ Phân tích sở phương pháp thông tin di truyền tuyệt đối (Maximum parsimony-MP) tìm thấy 130 parsimony với kích thước 61 Kết phân tích số CI (consistency Index), RI (Retention Index) tương ứng 0,9672 0,8888 Cây thứ trình bày Hình 3.5 Kết mối quan hệ theo phương pháp tương tự phương pháp NJ D condorensis D costatus D tuberculatus D baudii D alatus D dyeri D intricatus D obtusifolius D retusus H recopei Vatica odorata c Hình 3.9 Mối quan hệ di truyền 11 loài Dầu theo phương pháp MP Kết sơ đồ hình mối quan hệ di truyền 11 loài họ dầu Việt Nam xác định theo phương pháp: NJ (Neighbor-Joining) Maximum parsimony-MP) khẳng định lại kết thu phân tích hệ số khác cặp lồi nghiên cứu xác Tóm lại, nghiên cứu giải mã đặc điểm đoạn gen matK với chiều dài 1200bp cho 11 loài họ Dầu phân bố Việt Nam Kết mức độ sai khác thấp cặp lồi chi Dầu (Dipterocarpus) có khác lớn loài chi vùng phân bố địa lý xa Trong nghiên cứu này, loài Chị nâu (D retusus) có quan hệ gần gũi xác định loài chị em với loài chi Dầu (Dipterocarpus) Tuy nhiên, họ Dầu (Dipterocarpaceae) họ phức tạp chưa có kết thống vị trí phân loại loài chi họ Dầu, kết phân tích vùng gen matK lựa chọn chưa thực đầy đủ cho việc phân loại cấp độ lồi lồi họ Dầu nói chung với chi Diterocarpus nói riêng Cần có nghiên cứu dựa kết hợp vùng gen khác matK, rbcL, trnH-psbA Danh sách trình tự công bố lên Ngân hàng gen giới (Genbank): STT Loài Mã số GenBank Dipterocarpus alatus KC568463 Dipterocarpus costatus KC708341 Dipterocarpus condorensis KC765142 Dipterocarpus dyeri KC765145 c Dipterocarpus tuberculatus KC848888 Dipterocarpus intricatus KC765148 Dipterocarpus obtusifolius KC765153 Hopea recopei KC765150 Vatica odorata KF021567 10 Dipterocarpus retusus KF021568 11 Dipterocarpus baudii KF021566 c KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tìm thấy quần thể Dầu nước tự nhiên sáu tỉnh miền Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ Tây Nguyên Việt Nam, bao gồm: Vườn quốc gia Yok Đôn (Đắk Lắk), Vườn quốc gia Cát Tiên, rừng Vĩnh Cửu Khu Bảo tồn Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai thuộc tỉnh Đồng Nai, Khu Bảo tồn thiên nhiên Krông Trai (Phú Yên), Vườn quốc gia Bù Gia Mập (Bình Phước), Vườn quốc gia Lị Gị – Xa Mát (Tây Ninh) Khu Bảo tồn Bình Châu Phước Bửu, Vườn quốc gia Côn Đảo (Bà Rịa – Vũng Tàu) Kích thước quần thể lồi Dầu nước tự nhiên tìm thấy sáu tỉnh nhỏ, số lượng cá thể trung bình