BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP PHAN THỊ THU TRANG NHÂN GIỐNG CÂY TỤC ĐOẠN (Dipsacus japonicus Miq) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SIN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP PHAN THỊ THU TRANG NHÂN GIỐNG CÂY TỤC ĐOẠN (Dipsacus japonicus Miq) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học1: Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: PGS.TS BÙI VĂN THẮNG TS KHUẤT THỊ HẢI NINH Hà Nội, 2018 HÀ NỘI, 2018 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đề tài nghiên cứu “Nhân giống Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” tơi nhóm nghiên cứu thực hiện, chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Nếu nội dung nghiên cứu tơi trùng lặp với công nghiên cứu cơng bố, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn Hội đồng khoa học Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2018 Ngƣời cam đoan Phan Thị Thu Trang ii LỜI CÁM ƠN Đề tài nghiên cứu đƣợc thực Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện tạo điều kiện để công việc chuyên môn đề tài đƣợc tiến hành thuận lợi Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng TS Khuất Thị Hải Ninh tận tình hƣớng dẫn tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn góp ý, dẫn, chia sẻ kinh nghiệm cán nghiên cứu Viện Công nghiệp sinh học lâm nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình thực đề tài Đồng thời, tơi nhận đƣợc động viên, quan tâm giúp đỡ nhiệt tình bạn bè đồng nghiệp nơi công tác Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ngƣời thân ln bên tôi, động lực để vƣợt qua khó khăn để hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Phan Thị Thu Trang iii MỤC LỤC TRANG LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.1 Đặc điểm sinh vật học, phân bố giá trị kinh tế Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.2 Tình hình bảo tồn, khai thác phát triển Tục Đoạn 1.1.3 Các phương pháp nhân giống Tục Đoạn (D japonicus Miq) 10 1.2 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn (D japonicus Miq) 12 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn giới 12 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Tục Đoạn Việt Nam 13 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro số loài dƣợc liệu Việt Nam 14 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm thu thập số liệu 21 2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Tạo mẫu Tục Đoạn (D japonicus Miq) 27 iv 3.1.1 Tạo mẫu từ hạt 27 3.1.2 Tạo mẫu từ chồi 29 3.2 Ảnh hƣởng chất điều hồ sinh trƣởng, mơi trƣờng dinh dƣỡng hàm lƣợng đƣờng đến khả tạo cụm chồi 31 3.2.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo cụm chồi 31 3.2.2 Ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến khả tạo cụm chồi 35 3.2.3 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tạo cụm chồi 37 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả rễ chồi 41 3.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc in vitro giai đoạn vƣờn ƣơm 44 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến khả sống non 44 3.4 Ảnh hưởng loại giá thể đến khả sống sinh trưởng in vitro vườn ươm 45 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ BAP Benzyl aninopurine CTTN Cơng thức thí nghiệm ĐC Đối chứng CS Cộng ĐHST Điều hòa sinh trƣởng IBA Indole butiric acid LSD Khoảng sai dị tối thiểu (Least significant difference) MS MS* 10 NAA Naphtyl acetic acid 11 STT Số thứ tự 12 Sig Mức ý nghĩa (Significant) 13 TB Trung bình 14 TDZ Thidiazuron 15 WPM Woody plant medium Murashige and Skoog, 1962 (một loại môi trƣờng nuôi cấy mô) Murashige and Skoog, 1962 (một loại môi trƣờng nuôi cấy mô) vi DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian loại hóa chất khử trùng đến khả tạo mẫu Tục Đoạn, sau tuần nuôi cấy 27 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu chồi b ng HgCl2 0,1 đến khả tạo mẫu Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy 29 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng loại môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn in vitro 35 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng hàm lƣợng loại đƣờng đến khả tạo cụm chồi Tục Đoạn in vitro 38 Bảng 3.6 Khả rễ chồi in vitro Tục Đoạn môi trƣờng 42 MS bổ sung NAA, IBA 42 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian huấn luyện đến khả sống 45 mô Tục Đoạn 45 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng loại giá thể đến khả sống sinh trƣởng in vitro Tục Đoạn 46 vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ ( ) mẫu hạt Tục Đoạn nảy chồi khử trùng b ng HgCl2 0,1% NaClO với thời gian khác 28 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ mẫu Tục Đoạn nảy chồi khử trùng b ng HgCl2 0,1 với thời gian khác 30 Biều đồ 3.3 Tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng nồng độ khác nhau………………………… .31 Biều đồ 3.4 Số chồi TB/cụm Tục Đoạn mơi trƣờng MS bổ sung chất điều hồ sinh trƣởng nồng độ khác 33 Biều đồ 3.5 Chiều cao TB chồi Tục Đoạn môi trƣờng MS bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng nồng độ khác 33 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng MS, MS*, WPM sau tuần nuôi cấy………………………………………………… …… 34 Biểu đồ 3.7 Số chồi TB/cụm môi trƣờng MS, MS*, WPM 36 sau tuần nuôi cấy 36 Biểu đồ 3.8 Chiều cao trung bình chồi môi trƣờng MS, MS*, WPM 36 sau tuần nuôi cấy 36 Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ ( ) mẫu tạo cụm chồi môi trƣờng bổ sung 38 Biểu đồ 3.10 Số chồi TB/cụm môi trƣờng bổ sung loại đƣờng khác (sau tuần nuôi cấy) 39 Biểu đồ 3.11 Chiều cao trung bình chồi môi trƣờng bổ sung loại đƣờng khác (sau tuần nuôi cấy) 39 Biểu đồ 3.12 Số lƣợng trung bình rễ/chồi (sau tuần cấy) 43 Biểu đồ 3.13 Số lƣợng chiều dài trung bình rễ /chồi (sau tuần cấy) 43 Biểu đồ 3.14 Tỉ lệ sống sót giá thể khác 47 Biểu đồ 3.15 Chiều cao trung bình giá thể khác 47 viii DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 1.1 Cây Tục Đoạn Hình 2.1 Mẫu Tục Đoạn làm vật liệu nuôi cấy 22 Hình 3.1 Mẫu hạt Tục Đoạn nảy mầm in vitro sau tuần nuôi cấy 29 Hình 3.2 Mẫu Tục Đoạn nảy chồi sau tuần nuôi cấy 31 Hình 3.3 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần cấy chuyển sang mơi trƣờng nhân chồi 34 Hình 3.4 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy loại môi trƣờng: A: WPM, B: MS* C: MS 37 Hình 3.5 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy môi trƣờng hàm lƣợng đƣờng khác nhau: A: công thức D4; B: công thức D1; 40 Hình 3.6 Cụm chồi Tục Đoạn sau tuần nuôi cấy môi trƣờng hàm lƣợng đƣờng khác 41 Hình 3.7 Cây Tục Đoạn hồn chỉnh mơi trƣờng MS + 0,4 mg/l NAA 44 Hình 3.8 Cây mơ Tục Đoạn giá thể GT2 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Việt Nam quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng giới, với 5.117 loài dƣới loài, thuộc 1.823 chi, 360 họ ngành Thực vật bậc cao có mạch, với số taxon thuộc nhóm Rêu, Tảo Nấm lớn, có cơng dụng làm thuốc (Danh lục thuốc Việt Nam, 2016) Theo Tổ chức Y tế Thế giới, 80 dân số nƣớc phát triển có nhu cầu sử dụng y học cổ truyền thuốc từ thảo dƣợc để chăm sóc bảo vệ sức khỏe Trong vài thập niên gần đây, nhiều nƣớc đẩy mạnh việc nghiên cứu, bào chế sản xuất dƣợc phẩm có nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ, phòng ngừa điều trị nhiều loại bệnh Theo thống kê ngành Y tế, nhu cầu sử dụng dƣợc liệu Việt Nam vào khoảng 60.000 - 80.000 dƣợc liệu/năm Lĩnh vực sản xuất kinh doanh dƣợc liệu cho sản xuất thuốc, thực phẩm chức mang lại nguồn lợi lớn cho kinh tế Tuy nhiên, phần lớn khối lƣợng dƣợc liệu phải nhập khẩu, Việt Nam lại quốc gia có tiềm nguồn tài nguyên dƣợc liệu phong phú Năm 2013, theo Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 Thủ tƣớng Chính phủ “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dƣợc liệu đến năm 2020 định hƣớng đến năm 2030” định số 206/QĐ-BYT, ngày 22/1/2015 Bộ trƣởng Y tế việc ban hành danh mục dƣợc liệu ƣu tiên phát triển giai đoạn 2015 – 2020, nh m bảo tồn khai thác dƣợc liệu tự nhiên Việt Nam quy hoạch vùng dƣợc liệu trọng điểm để lựa chọn sản xuất khai thác hợp lý Trong đó, triển khai sản xuất 28 loài dƣợc liệu địa phục vụ cho sản xuất Tục Đoạn lồi dƣợc liệu đƣợc qui hoạch trồng vùng núi cao vùng núi trung bình có khí hậu Á nhiệt đới 2 Hiện nay, nhu cầu nƣớc Tục Đoạn lớn, việc khai thác mọc hoang tự nhiên không đủ nhu cầu Trong điều kiện tự nhiên Tục Đoạn sinh sản b ng hạt sinh dƣỡng (Đỗ Huy Bích, 2006) Tuy nhiên, tốc độ đẻ nhánh từ mẹ điều kiện tự nhiên chậm Mặt khác, theo dân gian công dụng Tục Đoạn phận rễ, khai thác tự nhiên ngƣời dân nhổ cây, đào rễ Tục Đoạn sống vùng núi cao, thời gian thu hoạch hạt vào mùa đông tháng 11,12 giá rét, nên thu hoạch hạt để nhân giống điều kiện tự nhiên gặp khó khăn (Đỗ Huy Bích, 2006; Xu li, 2002) Vì vậy, sử dụng phƣơng pháp nhân giống tiên tiến để tiến hành nhân nhanh Tục Đoạn gây trồng khu phân bố chúng cần thiết Nhân giống Tục Đoạn b ng phƣơng pháp in vitro giúp tạo số lƣợng lớn giống tốt thời gian ngắn, quy hoạch thành vùng sản xuất dƣợc liệu, nâng cao thu nhập cho ngƣời dân tránh nguy cạn kiệt tự nhiên Để chủ động nguồn giống chọn lọc giống Tục Đoạn cần đƣợc tiến hành để nâng cao suất chất lƣợng giống cho việc gây trồng Tục Đoạn góp phần cung cấp nguồn dƣợc liệu ổn định cho thị trƣờng thực đề tài “Nhân giống Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống Tục Đoạn b ng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Mục tiêu cụ thể: - Xác định đƣợc phƣơng pháp tạo mẫu thích hợp; - Xác định đƣợc công thức môi trƣờng phù hợp để nhân nhanh chồi; - Xác định đƣợc công thức môi trƣờng phù hợp để tạo hoàn chỉnh; - Xác định đƣợc thành phần giá thể kỹ thuật chăm sóc mơ giai đoạn vƣờn ƣơm + Xác định đƣợc ảnh hƣởng thời gian huấn luyện đến khả sống mô; + Xác định đƣợc ảnh hƣởng loại giá thể đến khả sống sinh trƣởng mô vƣờn ƣơm Đối tƣợng, vật liệu phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Loài Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) - Vật liệu nghiên cứu: Chồi hạt Tục Đoạn Trung tâm Nghiên cứu Giống trồng Đạo Đức – Hà Giang cung cấp - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học lâm nghiệp Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp sở khoa học kỹ thuật nhân giống in vitro Tục Đoạn dẫn liệu khoa học ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển Tục Đoạn Việc nhân nhanh thành công Tục Đoạn b ng phƣơng pháp ni cấy in vitro góp phần vào cơng tác bảo tồn hữu hiệu loài quý 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Áp dụng quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro Tục Đoạn tạo số lƣợng lớn giống tốt phục vụ sản xuất cho vùng chuyên canh dƣợc liệu đáp ứng mục tiêu bảo tồn phát triển loài dƣợc liệu quý 4 Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.1 Đặc điểm sinh vật học, phân bố giá trị kinh tế Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học Cây Tục Đoạn gọi Sâm nam, Đầu vù, Rễ Thái, Sơn cân thái, Oa thài, có tên khoa học Dipsacus japonicus Miq, thuộc họ Tục Đoạn (Dipsacaceae) Tục nối, đọan đứt ngƣời xƣa cho r ng vị thuốc có tác dụng nối đƣợc gân xƣơng đứt Theo đơng y, Tục Đoạn có vị đắng cay, tính ơn, có tác dụng bổ can ích thận, nối liền gân cốt, thông huyết mạch, cầm máu, giảm đau Chủ trị can thận hƣ, lƣng đau, chân yếu, gẫy xƣơng, bong gân, dọa sảy thai, an thai, huyết chữa băng lậu đới hạ (Bùi Thị B ng, 2010; Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001) Tục Đoạn thuốc quý Việt Nam Hàng năm, ngƣời dân thƣờng xuyên khai thác loại dƣợc liệu để cung cấp cho nhu cầu sử dụng nƣớc Việc khai thác liên tục nhiều năm bị tàn phá nạn cháy rừng, đốt nƣơng làm rẫy làm cho nguồn thuốc mau cạn kiệt Tục Đoạn đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam để lƣu ý bảo vệ (Đỗ Huy Bích, 2006; Sách đỏ Việt Nam, 2007) Cây Tục Đoạn loài thực vật có hoa họ Tục đoạn Lồi đƣợc Miq mô tả năm 1868, cao 1,5 – m, thân có cạnh, cạnh có hàng gai thƣa, lên mau dần, gai quặp trở xuống, mọc đối, khơng có cuống, bẹ ơm lấy cành thân Lá non có cƣa dài, phiến nhỏ, thuôn dài, đầu nhọn Gân cách, đƣờng gân mặt dƣới có hàng gai nhỏ cứng, lên đầu lá, mềm dần Lá già có phiến xẻ sâu, cƣa mau non, phiến xẻ cách từ - thuỳ, gân có gai nhỏ nhƣ non Cũng có ngun, cụm hoa hình trứng hay hình cầu, cành mang hoa dài 10 - 20 cm, cạnh có lơng cứng, lên mau dần Hoa màu trắng có bắc dài 1- cm Quả bế có cạnh, màu xám trắng cịn đài sót lại, dài - mm (Danh mục thuốc Việt Nam, 2016; Đỗ Tất Lợi, 2004) Hình 1.1 Cây Tục Đoạn (Nguồn: Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.1.1.2 Phân bố Chi Dipsacus gồm số loài, phân bố chủ yếu vùng ôn đới ấm cận nhiệt đới thuộc châu Âu, châu Á Bắc Phi Ở Việt Nam, chi có lồi D.japonicus Miq D asper Wallich ex Candolle, gọi chung Tục Đoạn Trên giới, loài thấy phân bố vùng Đông Á, bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản phần Bắc Việt Nam (Đỗ Huy Bích, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004; Hồng Văn Vinh, 2001; Van Dan Nguyen, 1999; Shizhen Li, 1990) Ở Việt Nam, Tục Đoạn thấy phân bố số vùng núi cao, thuộc tỉnh Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Bắc Hà, Mƣờng Khƣơng, Than Uyên), Lai Châu (Sìn Hổ, Phong Thổ; Tủa Chùa) Hà Giang (Đồng Văn, Mèo Vạc Quản Bạ), nhiều Sapa, Bình Lƣ (Lào Cai), Hà Giang, Tuyên Quang (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Van Dan Nguyen, 1999) Tục Đoạn bắt đầu đƣợc khai thác vào khoảng từ năm 1935 Mùa thu hoạch vào tháng – 10 Đào lấy rễ già rửa đất cát cắt bỏ phần cổ rễ rễ con, phơi râm hay sấy nhẹ cho khô để làm dƣợc liệu (Đỗ Huy Bích, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001) Cây Tục Đoạn phân bố độ cao từ 1350 đến 1600 m (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Narayan Das Prajapati, 2003) Nhìn chung, lồi Tục Đoạn thuộc loại ƣa sáng, mọc rải rác, tạo thành đám nƣơng rẫy bỏ hoang, trảng cỏ hay ven rừng núi đá vôi Hàng năm, vào mùa đông phần mặt đất thƣờng tàn lụi Cây sinh trƣởng tốt điều kiện khí hậu ẩm mát vùng nhiệt đới núi cao; nhiệt độ trung bình năm 13 - 15°C; lƣợng mƣa dao động từ 1600 đến 3000 mm/năm, độ ẩm khơng khí trung bình 85 (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001; Narayan Das Prajapati, 2003) Tục Đoạn mọc loại đất tơi xốp, dễ nƣớc có hàm lƣợng mùn tƣơng đối cao, mọc nơi đất chặt, lẫn trảng cỏ, thƣờng sinh trƣởng kém, rễ củ nhỏ nhiều xơ Cây hoa hàng năm; có túm lơng, nên thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió Cây mọc từ hạt thấy vào cuối mùa xuân hay đầu mùa hè (Đỗ Huy Bích, 2006) Ở Trung Quốc, Tục Đoạn chủ yếu mọc vùng Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Tạng Cây hoa vào tháng - 9, có tháng - 10 (Hoàng Văn Vinh, 2001) 1.1.1.3 Thành phần hoá học Tục Đoạn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu thành phần hóa học Kết nghiên cứu cịn chƣa thống Có tài liệu nói rễ Tục Đoạn chứa alkaloid , tinh dầu, chất màu (Hoàng Văn Vinh, 2001) Sơ nghiên cứu Tục Đoạn Việt Nam cho thấy: Dịch chiết tục đoạn có vị ngọt, sau se lƣỡi, có phản ứng axit với giấy quỳ, cho phản ứng dƣơng tính với thuốc thử chung alkaloid, phản ứng tanin rõ rệt, có đƣờng có saponin (Đỗ Tất Lợi, 2004; Xu li, 2002) 7 Thành phần có Tục Đoạn bao gồm: alkaloid, dầu dễ bay hơi, trierpene saponin, gentianine, B – sitosterol, daucosterol vitamin E (Lê Thị Thảo, 2013; Miao, 2000; Wei, 1998) Theo Trung dƣợc từ hải III (1997) rễ lồi Tục Đoạn D japonicus có saponin japondipsaponin E1 japondipsanonin E2 E1 gồm có rhamnose -> glucose -> rhamnose -> arabinose -> hederagenin E2 : rhamnose -> glucose -> rhamnose -> arabinose -> acid oleanolic (Đỗ Tất Lợi, 2004) Dịch chiết Tục Đoạn xác định đƣợc saponin triterpenoid chứa năm loại đƣờng đƣợc phân lập từ chiết xuất gốc etanol D japonicus cấu trúc đƣợc thiết lập 3-O- [β-D-glucopyranosyl (1 → 4)] [α-Lrhamnopyranosyl (1 → 3)] -β-D-glucopyranosyl (1 → 3) -α-L -rhamnopyranosyl (1 → 2) -α-L-arabinopyranosyloleanoic axit (Miao, 2000) Rễ Tục Đoạn chứa chất sucrose, daucosterol, β - sitosterol, akebia saponin D, - O - (4 - acetyl) - α - L - arabinopyranosyl - hederagenin - 28 O - β - O - glucopyranosyl - (1 -> 6) - β - D - glucopyranosid 3-O-α-L arabinopyranosyl - oleanolic acid - 28 - o - β - D glucopyranosyl - (1 -> 6) - β - D glucopyranosid (Đỗ Tất Lợi, 2004) Ngoài ra, rễ cịn có - O - β - D glucopyranosyl (1 -> 3) - α - L rhamnopyranosyl (1 -> 2) - α - L arabinopyranosyl hederagenin 28 - O - β D glucopyranosyl (1 -> 6) - β - O - glucopyranosyl (1 -> 6) - β - D glucopyranosyl-ester - O - α - L rhamnopyranosyl (1 -> 3) - β - D glucopyranosyl (1 -> 3) - α - L rhamnopyranosyl (1 -> 2) - α - L arabinopyranosyl - hederagenin -28-O-β-D- glucopyranosyl (l->6)-β-D glucopyranosyl ester (Đỗ Tất Lợi, 2004) Rễ chứa triterpen glycosid (I), triterpen glycosid khác akebia saponin D iridoid glycosid swerosid, loganin cantleyosid (Trịnh Thị Thủy, 1999) Iri- doid bis-iridoid glycosides, Tri- terpene glycosides (Trịnh Thị Thủy, 2002) Dịch chiết lá, thân Tục Đoạn cho thấy: Thành phần hóa học chủ yếu dịch chiết từ Tục Đoạn gồm chủ yếu alkaloid, glycoside, saponin hợp chất polyphenol có chứa nhiều tannin flavonoid (Lê Thị Thảo, 2013) Tinh dầu chƣng cất nƣớc từ phận quang hợp Tục Đoạn giai đoạn hoa đƣợc phân tích b ng phép sắc ký khí khối phổ (GC-MS) bao gồm 46 hợp chất, chiếm 96,76 tổng lƣợng dầu, đƣợc xác định hợp chất tinh dầu linalool (11,78 ), trans-geraniol (8,58%), 1,8cineole(7,91 ), β-caryophyllene (5,58 ), α-terpineol (5,32 ), β-selinene (5,15%) spathulenol (5,04%) (Zhi Long Liu, 2013) 1.1.1.4 Công dụng Tục Đoạn thƣờng dƣợc dùng làm thuốc bổ toàn thân, thuốc dịu đau, chữa đau đớn bị ngã, bị thƣơng, cịn có tác dụng lợi sữa, an thai, cầm máu Liều đùng: Ngày uống – 18 g dƣới dạng thuốc sắc hay ngâm rƣợu (Bùi Thị B ng, 2010; Đỗ Tất Lợi, 2004; Xu li, 2002) Theo dân gian nhiều thuốc dùng rễ Tục Đoạn có cơng năng, chủ trị: bổ can, thận, nối gân xƣơng, thông huyết mạch, lợi quan tiết, hết đau, an thai, dùng chữa đau lƣng, động thai, di tinh, gân cốt đứt đau giảm đâu, chống viêm, chữa viêm đa khớp dạng thấp (Bùi Thị B ng, 2010; Đỗ Tất Lợi, 2004; Xu li, 2002) Hiện nay, với phát triển khoa học kĩ thuật có số cơng trình nghiên cứu tác dụng Tục Đoạn khơng sử dụng phận rễ mà sử dụng phận khác Với nghiên cứu bƣớc đầu dịch chiết loài chi Dipsacus ( Li Dahui, 2012) cho thấy dùng điều trị nhiều bệnh cho ngƣời nhƣ viêm đa khớp (Hyo Won Jung, 2012), bệnh tiểu đƣờng, béo phì (Dong Chil Koo, 2013), cầm máu (Cong, 2013), chống ơxi hóa, điều hịa miễn dịch hỗ trợ phản ứng phụ ghép nội tạng (Kam Ming Ko, 2007) hay có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chống lại bệnh viêm, truyền nhiễm (Choi NH, 2017;; Li Dahui, 2012; T Liebold , 2011; Jing Jing Liu, 2011; Shaw, 2011; YiTao, 2017) Điều cho thấy vai trò quan trọng Theo Zhi Long Liu cộng sự, (2012), dịch chiết phận quang hợp thời kì hoa Tục Đoạn có tác dụng chống lại lồi trùng Sitophilus zeamais Tribolium castaneum 1.1.2 Tình hình bảo tồn, khai thác phát triển Tục Đoạn Tục Đoạn thuốc quý Việt Nam Cây Tục Đoạn phân bố Lào Cai, Sơn La, Hà Giang đỉnh núi cao (Đỗ Tất Lợi, 2004; Hoàng Văn Vinh, 2001) Nguồn tri thức địa ngƣời dân việc khai thác, sử dụng cỏ làm thuốc trị bệnh chăm sóc sức khoẻ cộng đồng đa dạng phong phú Hàng năm, địa phƣơng kể trên, ngƣời ta thƣờng xuyên khai thác loại dƣợc liệu để cung cấp cho nhu cầu sử dụng nƣớc Việc khai thác liên tục nhiều năm bị tàn phá nạn cháy rừng, đốt nƣơng làm rẫy làm cho nguồn thuốc mau cạn kiệt Tục Đoạn đƣợc đƣa vào Sách Đỏ Việt Nam để lƣu ý bảo vệ (Sách đỏ Việt Nam, 2007) Tuy nhiên, tình trạng khai thác, bn bán thuốc tự phát diễn phổ biến, thƣơng lái ngồi nƣớc lợi dụng thiếu thơng tin bà vùng sâu để thu mua với giá rẻ mạt Hoạt động không làm suy giảm nguồn tài nguyên, tính đa dạng sinh học mà cịn làm cạn kiệt, chí biến nhiều loại thuốc quý hiếm, gây thiệt hại lớn mơi trƣờng sinh thái lợi ích kinh tế ngƣời dân Theo số nghiên cứu nhà khoa học, việc khai thác không đảm bảo tái sinh, vấn đề du canh phát triển công nghiệp, việc 10 phát triển công trình thuỷ điện, suy thối tầng gỗ rừng tự nhiên, v.v nguyên nhân gây suy kiệt nguồn tài nguyên dƣợc liệu quý Bên cạnh đó, việc sản xuất, thu hoạch, công nghệ chế biến tiêu thụ sản phẩm dƣợc liệu nhiều vấn đề hạn chế (Hội nghị trực tuyến tồn quốc Chính phủ phát triển dƣợc liệu Việt Nam, 2017) Hiện nay, Tục Đoạn đƣợc ngƣời dân chủ yếu khai thác điều kiện tự nhiên, chƣa có vùng quy hoạch trồng Tục Đoạn nguồn cung cấp nhân giống cịn ít, hiểu biết kiến thức chăm sóc trồng Tục Đoạn hạn chế Các nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ vào sản xuất, chế biến dƣợc liệu nói chung Tục Đoạn nói riêng chƣa đƣợc trọng; cơng tác bảo tồn, phát triển nguồn gen gặp nhiều khó khăn Để chủ động có dƣợc liệu bán thị trƣờng, ngƣời dân xung quanh thị trấn Sa Pa trồng Tục Đoạn vƣờn nhà nƣơng rẫy Việc làm góp phần làm giảm nguy bị tuyệt chủng loài (Đỗ Huy Bích, 2006) Thực trạng cho thấy cần phải có chế sách mang tính tổng thể, đồng bảo tồn, phát triển, khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên dƣợc liệu, phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng tạo thu nhập bền vững cho ngƣời dân địa 1.1.3 Các phương pháp nhân giống Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.3.1 Phương pháp gieo hạt Tục Đoạn mọc loại đất tơi xốp, dễ nƣớc có hàm lƣợng mùn tƣơng đối cao, mọc nơi đất chặt, lẫn trảng cỏ, thƣờng sinh trƣởng kém, rễ củ nhỏ nhiều xơ Cây hoa hàng năm; có túm lơng, nên thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió Cây mọc từ hạt thấy vào cuối mùa xuân hay đầu mùa hè 11 Cây Tục Đoạn nhân giống b ng hạt có ƣu điểm hạt có tỉ lệ nảy mầm cao, nhân giống nhanh, thích nghi tốt, rễ khỏe Tuy nhiên, thu hoạch hạt khó, số lƣợng do: Cây giá trị dƣợc liệu rễ nên khai thác thƣờng nhổ cây, lúc chƣa hoa số lƣợng tự nhiên giảm, có nguy tuyệt chủng Hơn nữa, sống nơi có độ cao so với mực nƣớc biển lớn, mùa thu hoạch hạt vào mùa đông nhiều vùng bị băng giá, nên gặp khó khăn Cách trồng: Tục Đoạn ƣa khí hậu cận nhiệt đới, nhiệt độ trung bình năm khoảng 20°C, đƣợc trồng Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hồ Bình, Đà Lạt Cây ƣa đất nhẹ, cát pha, tầng canh tác dày, cao ráo, thoát nƣớc, giữ ẩm (Đỗ Huy Bích, 2006) Có thể gieo thẳng gieo vƣờn ƣơm, có - thật, mang trồng Thời vụ gieo hạt vào tháng - trồng vào tháng - Đất trồng Tục Đoạn cần cày bừa kỹ, vơ cỏ, lên thành luống cao 25 - 30 cm, rộng 70 - 90 cm để trồng hàng đôi hay hàng ba, lệch nanh sấu Khoảng cách trồng 35 x 30 cm 30 x 30 cm Cây cần bón phân đầy đủ, trung bình 20 - 27 phân chuồng, 300 - 500 kg phân lân, 150 - 200 kg kali cho Phân đƣợc trộn với đất theo hốc trồng Trong trình sinh trƣởng, cần xới xáo, làm cỏ, bón thúc - lẩn b ng đạm urê, lần 100-120 kg cho Ngồi ra, bón thêm tro, nƣớc phân chuồng, nƣớc giải pha loãng phân xanh ủ mục Ở trạng thái hoang dại, Tục Đoạn có sâu bệnh Nhƣng trồng, thƣờng bị sâu xám, sâu xanh, bệnh thối củ gây hại nên cần có biện pháp phịng trừ sâu bệnh (Đỗ Huy Bích, 2006) Tục Đoạn trồng đƣợc năm cho thu hoạch Nếu để - năm, củ bị thối, lại củ nhánh Củ thu vào tháng 11 -12, rửa sạch, phơi khô (Đỗ Huy Bích, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2004) ... ? ?Nhân giống Tục Đoạn (Dipsacus japonicus Miq) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro? ?? Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Xây dựng đƣợc kỹ thuật nhân giống Tục Đoạn b ng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Mục... CỨU 1.1 Giới thiệu chung Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.1 Đặc điểm sinh vật học, phân bố giá trị kinh tế Tục Đoạn (D japonicus Miq) 1.1.1.1 Đặc điểm sinh học Cây Tục Đoạn gọi Sâm nam, Đầu vù,... 1.1 Cây Tục Đoạn Hình 2.1 Mẫu Tục Đoạn làm vật liệu nuôi cấy 22 Hình 3.1 Mẫu hạt Tục Đoạn nảy mầm in vitro sau tuần nuôi cấy 29 Hình 3.2 Mẫu Tục Đoạn nảy chồi sau tuần nuôi