Untitled 57 KH&CN nước ngoài Số 3 năm 2020 Mở đầu Những tiến bộ nhanh chóng của kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen (genome editing GE) đã tạo ra một cuộc cách mạng thực sự trong nghiên cứu chức năng gen và cả[.]
KH&CN nước thành tựu kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen cải thiện di truyền lúa gạo (oryza sativa ) Chu Đức Hà1, Phùng Thị Thu Hương1, Phạm Bích Ngọc2, Lê Thị Ngọc Quỳnh3, Lê Hùng Lĩnh1, Phạm Xuân Hội1, Lê Tiến Dũng4 Viện Di truyền Nông nghiệp, VAAS Viện Công nghệ Sinh học, VAST Khoa Hóa và Mơi trường, Trường Đại học Thủy lợi Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Hệ thống CRISPR/Cas trở thành công cụ đắc lực nhằm cải thiện tính trạng trồng Về chất, hệ thống CRISPR/Cas cho phép can thiệp vào gen vị trí có định hướng Cho đến nay, khoảng 24 lồi trồng, với 193 gen chỉnh sửa thành cơng với mục đích cải thiện đặc tính liên quan đến q trình trao đổi chất, khả chống chịu bất lợi yếu tố cấu thành suất Ở lúa gạo (Oryza sativa), nỗ lực nhà khoa học ghi nhận việc cải biến gen kháng thuốc diệt cỏ, asen (ALS, ARM1) quy định suất (AAP3, GS3, DEP1, GW2, PYL1, PYL4, PYL6, Gn1a) Bài viết tổng hợp thành tựu chỉnh sửa hệ gen lúa gạo, từ đưa thảo luận số ý kiến nhằm xây dựng chiến lược nghiên cứu dài hạn cho chỉnh sửa hệ gen lúa gạo nói riêng, trồng nói chung Mở đầu Những tiến nhanh chóng kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen (genome editing - GE) tạo cách mạng thực nghiên cứu chức gen cải thiện di truyền thực vật Trong thập niên trước, tốn can thiệp vào tính di truyền thực vật thực cách rộng rãi thông qua phương pháp lý hóa sử dụng tia gamma hóa chất (ethyl methanesulfonate) phương pháp sinh học (T-DNA, transpose) để tạo đột biến ngẫu nhiên hệ gen Giờ đây, với đời kỹ thuật GE, phổ biến hệ thống CRISPR/Cas cho phép cải biến phân tử ADN mục tiêu cách xác có chủ đích Đến nay, trồng chỉnh sửa CRISPR/Cas9 cho vượt qua nhiều rào cản xếp loại trồng biến đổi gen [1] Gần thập kỷ qua, hàng ngàn ấn phẩm chủ đề GE thực vật đăng tải, số báo ứng dụng công bố tăng lên ngày Về mặt lý thuyết, GE lợi dụng hệ thống sửa chữa ADN tế bào để tạo thay đổi nhỏ trình tự ADN đích, thông qua việc sử dụng enzyme nuclease tổng hợp để tạo đứt gãy ADN sợi đôi (DSB) vị trí định hướng hệ gen Các đứt gãy tế bào sửa chữa thông qua chế sửa chữa ghép nối không tương đồng (non-homologous end-joining - NHEJ) chèn thêm trình tự ADN vào vị trí đứt gãy theo chế sửa chữa tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination - HR) NHEJ chế sửa chữa DSB phổ biến tế bào thực vật, chế hoạt động hiệu dễ xảy lỗi (sửa chữa không xác), chế HR hiệu có độ xác cao Kết q trình sửa chữa DSB sửa chữa xác xuất đột biến thêm bớt (thay thế, chèn gen), tùy vào đường sử dụng HR hay NHEJ Mega-nuclease ZFNs (Meganuclease, zinc finger nucleases), TALENs (transcription activator-like effector nucleases) công cụ kỹ thuật GE, sử dụng thành công để chỉnh sửa hệ gen nhiều đối tượng thực vật, bao gồm ngô, đậu tương thuốc Công nghệ GE thực bùng nổ từ năm 2012 phức hợp CRISPR/ Cas ứng dụng để tạo DSB hệ gen Hệ thống CRISPR/Cas trở thành cách tiếp cận thay công cụ GE trước kia, cho phép chỉnh sửa hệ gen sinh vật nhân chuẩn cách xác, linh hoạt mang lại hiệu kinh tế Đến nay, 24 đối tượng trồng, với 193 gen, chỉnh sửa hệ thống CRISPR/Cas [2] Các nhà khoa học tập trung chủ yếu vào lương thực, lúa gạo, lúa mì, cỏ kê, ngô, lúa mạch; số loại rau, cà chua, khoai tây, dưa chuột; ăn táo, nho, bưởi, cam; họ đậu (đậu tương) cơng nghiệp bơng, lanh Những tiến lớn đạt lúa gạo (34 gen), cà chua (14 gen), lúa mì (7 gen), cải dầu (5 gen), loại trồng lại chỉ có gen Số năm 2020 57 KH&CN nước ngồi hình Số gen trồng chỉnh sửa hệ thống CriSPr/Cas9 với mục đích cải tiến di truyền (giai đoạn từ tháng 8/2013-8/2018) [2] chỉnh sửa (cam, bưởi, táo, lanh, sợi) hai gen (ngơ, lúa mạch, đậu tương, dưa chuột, nho) (hình 1) Trong đó, phần lớn trồng chỉnh sửa gen với mục đích cải thiện khả chống chịu (kháng thuốc diệt cỏ, kháng asen) suất, chất lượng thành công chỉnh sửa hệ gen lúa gạo Lúa gạo xem mơ hình mầm quan trọng cho nghiên cứu chức gen, đặc biệt hướng đánh giá tính hiệu cơng cụ GE Cơng trình tiếp cận với công cụ GE lúa gạo báo cáo vào năm 2012 với việc sử dụng TALENs nhằm mục tiêu chỉnh sửa gen Os11N3 (OsSWEET14) - gen “nhiễm” quan trọng mã hóa cho protein vận chuyển đường tham gia thúc đẩy trình xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh bạc lúa để tạo dòng lúa kháng bệnh bạc [3] 58 Tháng 8/2013, lần hệ gen lúa gạo chỉnh sửa CRISPR/ Cas [4], kể từ nhiều nghiên cứu tương tự thực [5] Theo số liệu từ Scopus, gần năm trở lại đây, lúa gạo đối tượng chỉnh sửa gen nhiều nhất, với tổng số 109 gen, chủ yếu gen liên quan đến đặc tính suất (AAP3, GS3, DEP1, GW2, PYL1, PYL4, PYL6 Gn1a) chống chịu (như ALS ARM1) Enzyme acetolactate synthase (ALS) xúc tác bước trình sinh tổng hợp amino acid chuỗi nhánh Leucine, Isoleucine Valine ALS enzyme đích nhóm thuốc diệt cỏ có cấu trúc riêng biệt (sulfonylureas, imidazolinones, triazolopyrimidine sulfonamides pyrimidinyl carboxy) Butt cộng gây đột biến sửa chữa ALS công cụ GE thông qua trung gian cgRNA để tạo lúa kháng thuốc diệt cỏ bispyribac natri (BS) Locus Số năm 2020 ALS Oryza sativa L ssp japonicacv Nipponbare (LOC_Os02g30630) chỉnh sửa hệ thống cgRNA/ Cas9 thơng qua đường HDR Q trình chỉnh sửa tạo thay đổi từ Tryptophan (TGG) thành Leucine (TTG) amino acid 548 (W548L) thay đổi từ Serine (AGT) thành Isoleucine (ATT) amino acid 627 (S627I), với tỷ lệ sửa chữa cao (16,88% HDR) Nghiên cứu chỉ rằng, chỉ cần đột biến đơn W548L đủ để dẫn đến tính kháng thuốc diệt cỏ BS [6] Việc tạo dòng lúa kháng thuốc diệt cỏ nhanh chóng hiệu nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng hệ thống cgRNA/Cas9 chỉnh sửa gen loài trồng khác Ngoài ra, phương pháp Target-AID sử dụng phức hợp CRISPR/Cas9-cytidine deaminase áp dụng thành cơng để tạo tính kháng thuốc diệt cỏ Imazamox (IMZ) lúa (trong điều kiện nuôi cấy mô) thông qua tạo đột biến A96V ALS [7] Thành công khác gen ARM1 (ARSENITE-RESPONSIVE MYB 1) - gen thiết yếu việc điều chỉnh hấp thu chuyển dịch asen (As) từ rễ lên chồi lúa chỉnh sửa để tạo đột biến bất hoạt gen (knock out) OsARM1 (OsARM1-KO) thông qua CRISPR/ Cas9, giúp cải thiện đáng kể khả chống chịu As(III) lúa O sativa Nipponbare (NPB), Dongjing (DJ) SSBM [8] Asen xuất nhiều loại khoáng vật, tìm thấy hai dạng vơ cơ: arsenite [As(III)] arsenate [As(V)] Cả hai dạng asen gây bất lợi tế bào thực vật, As(III) liên kết với nhóm sulfhydryl protein ngăn chặn hoạt động chúng, As(V) hoạt động chất tương tự phosphate làm ảnh hưởng đến số trình sinh học thiết yếu, bao gồm tổng hợp ATP phosphoryl hóa Asen chất gây ung thư nhóm I chất độc mạn tính, độc tính cao người, gây tổn thương da, gây bệnh tiểu đường… Tích lũy asen gạo KH&CN nước làm tăng tiếp xúc người với yếu tố gây ung thư độc hại Do vậy, giảm tích lũy asen trồng nói chung lúa nói riêng điều cần thiết để tăng suất trồng bảo vệ người khỏi bị ngộ độc Đối với gen liên quan đến đặc tính suất (gen quy định tính trạng mùi hương hạt, hoa sớm, kiểu hình hạt), dạng đột biến thường gặp gây bất hoạt đơn đa gen thông qua chế NHEJ Ví dụ, việc loại bỏ gen Waxy lúa Xiushui 134 Wuyunjing tạo dòng lúa (khơng mang gen chuyển) có hàm lượng amylose thấp bình thường Thơng thường, gạo thương mại phân loại thành nhóm dựa vào hàm lượng amylose: nếp (0-5%), thấp (gạo dẻo) (5-12%), thấp (hơi dẻo) (12-20%), trung bình (20-25%) cao (25-33%) Hàm lượng amylose thấp tức hàm lượng amylopectin thành phần tinh bột hạt gạo cao gạo dẻo Từ đó, người ta phân biệt gạo nếp gạo tẻ Gạo nếp (0-5% amylose) có độ dính cao sau nấu chín, ngược lại amylose cao (25-33%) làm cơm khơ, mềm [9] Dòng lúa thu nghiên cứu Zhang cộng có tiềm ngành công nghiệp thực phẩm Trong số trường hợp khác, đột biến thay (amino acid alen) tạo thông qua chế HR hệ thống cgRNA/Cas9 Cụ thể, nghiên cứu gần nhà khoa học Trung Quốc, alen NRT1.1B giống lúa thương mại thay xác alen ưu việt với mục tiêu nâng cao hiệu sử dụng đạm lúa Không cần tạo thêm áp lực chọn lọc bổ sung, alen NRT1.1B giống lúa Japonica thay alen từ giống lúa Indica chỉ hệ với hiệu suất chỉnh sửa đạt 6,72% Cơng trình cho thấy tính khả thi việc thay gen alen ưu việt hệ, giúp tăng khả cải thiện đặc điểm nông học quan trọng Bên cạnh Cas9 nuclease, Cpf1 nuclease sử dụng Cpf1 endonuclease thuộc hệ thống enzyme CRISPR nucleases loại V, bao gồm hoạt tính endoribonuclease endodeoxyribonuclease Do Cpf1 nhận biết trình tự bảo thủ protospacer (PAM) 5-TTTN-3’ nên sử dụng để nhắm mục tiêu giàu AT hệ gen Hơn nữa, Cpf1 nucleases chứng minh có tỷ lệ chỉnh sửa ngồi mục tiêu thấp so với Cas9 nuclease Vì thế, việc GE trồng Cpf1 nucleases cho có tiềm tạo nên tác động tích cực thay lời kết Công nghệ GE phát triển với tốc độ chóng mặt, đặc biệt hệ thống CRISPR/Cas tiến nhanh Kể từ xuất hiện, CRISPR/ Cas nhanh chóng chiếm lĩnh vị hàng đầu lĩnh vực khoa học thực vật, ứng dụng hầu hết đối tượng trồng Ngoài hướng nghiên cứu bản, CRISPR/ Cas ứng dụng để cải thiện số đặc điểm định hướng thương mại, bao gồm đặc tính nơng học nhằm nâng cao chất lượng nơng sản, tăng cường khả chống chịu stress, hay khả kháng thuốc diệt cỏ Cây trồng chỉnh sửa CRISPR/Cas9 cho vượt qua nhiều rào cản xếp loại trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) Hoa Kỳ, nước thuộc vùng Scandinavi khu vực châu Âu Thực phẩm biến đổi gen chủ đề gây tranh cãi phạm vi toàn cầu Châu Âu vốn thận trọng việc cấp phép cho sản xuất đại trà GMC lưu hành sản phẩm có nguồn gốc từ GMC thị trường Đồng thời, số nước số bắt đầu cập nhật giải thích pháp lý trồng GE Tuy nhiên, thực tế nhà khoa học thừa nhận, GE trở thành công cụ đắc lực phục vụ chọn tạo giống trồng nông nghiệp xác, góp phần đảm bảo an ninh lương thực bền vững cho nước Để trồng GE chấp nhận nghiên cứu GE trồng tiếp tục phát triển hiệu quả, thống quốc tế quy định định nghĩa thực vật GE cần thiết, qua thu hẹp khoảng cách rủi ro tiềm thực vật GE ? tài LiỆu thaM Khảo [1] A Scheben, D Edwards (2018), “Bottlenecks for genome-edited crops on the road from lab to farm”, Genome Biol., 19(1), p.178 [2] A.M Korotkova, et al (2019), “Current achievements in modifying crop genes using CRISPR/Cas system”, Vavilov J Genet iBreed., 631(527), pp.224-234 [3] T Li, et al (2012), “High-efficiency TALEN-based gene editing produces diseaseresistant rice”, Nat Biotech., 30, p.390 [4] Q Shan, et al (2013), “Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system”, Nat Biotechnol., 31, p.686 [5] R Mishra, R.K Joshi, K Zhao (2018), “Genome editing in rice: Recent advances, challenges, and future implications”, Front Plant Sci., 9(1361), pp.1-12 [6] H Butt, et al (2017), “Efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing using a chimeric single-guide RNA molecule”, Front Plant Sci., 8, p.1441 [7] Z Shimatani, et al (2018), “Herbicide tolerance-assisted multiplex targeted nucleotide substitution in rice”, Data Brief, 20, pp.1325-1331 [8] F.Z Wang, et al (2017), “OsARM1, an R2R3 MYB transcription factor, is involved in regulation of the response to arsenic stress in rice”, Front Plant Sci., 8(1868), pp.1-16 [9] J Zhang, et al (2018), “Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy gene in elite rice varieties”, J Integr Plant Biol., 60(5), pp.369375 Số năm 2020 59 ... nho) (hình 1) Trong đó, phần lớn trồng chỉnh sửa gen với mục đích cải thiện khả chống chịu (kháng thuốc di? ??t cỏ, kháng asen) suất, chất lượng thành công chỉnh sửa hệ gen lúa gạo Lúa gạo xem... khả kháng thuốc di? ??t cỏ Cây trồng chỉnh sửa CRISPR/Cas9 cho vượt qua nhiều rào cản xếp loại trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) Hoa Kỳ, nước thuộc vùng Scandinavi khu vực châu... tham gia thúc đẩy trình xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh bạc lúa để tạo dòng lúa kháng bệnh bạc [3] 58 Tháng 8/2013, lần hệ gen lúa gạo chỉnh sửa CRISPR/ Cas [4], kể từ nhiều nghiên cứu tương