PHẦN I: LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1.1. Lý do chọn đề tài: Qua các phương tiện thông tin đại chúng, chúng em nhận thấy trong nguồn nước chảy cung cấp cho thành phố Hà Nội có nhiễm chất độc microcystins (MCs) của tảo Mycrocystis aeuroginosa chưa được xử lý, có ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng. Từ những quan sát thực tế trong chuyến tham quan hồ Hoàn Kiếm, một địa danh nổi tiếng ở thủ đô Hà Nội, chúng em nhận thấy hồ đang chịu tác động lớn từ việc sinh sản nhanh của tảo độc do tình trạng ô nhiễm nặng nề bởi rác thải hữu cơ, gây hiện tượng “phú dưỡng” trong hồ. Sự nhân nhanh của nhóm tảo độc M.aeruginosa làm cho lượng độc tố MCs do chúng tạo ra cũng tăng lên, đây là độc tố có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống của các sinh vật thủy sinh trong hồ. Trong chương trình sinh học THPT chúng em được biết, tảo lam bị cạnh tranh bởi nhiều vi sinh vật khác cùng sống trong môi trường nước hồ Hoàn Kiếm, chúng có khả năng phân giải độc tố MCs của tảo lam, đảm bảo sự cân bằng sinh thái trong môi trường nước hồ, đồng thời không tạo ra các loại độc tố khác ảnh hưởng đến môi trường hồ. Điển hình trong nhóm này là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Do đó chúng em liên hệ giữa đối tượng chúng em quan tâm là loài tảo độc M. aeruginosa ở nguồn nước cung cấp cho Hà Nội ở đây là dòng nước ở sông Đà. Việc xử lý độc tố ở ngay tại địa điểm Hồ Hoàn Kiếm sẽ thuận tiện hơn. Từ đó chúng em có thể áp dụng xử lý với đối tượng là nguồn nước sông Đà. Từ những lý do trên chúng em tiến hành thực hiện đề tài: “Góp phần làm sạch nước sinh hoạt thủ đô thông qua việc xử lý độc tố tảo lam ở hồ Hoàn Kiếm bằng biện pháp sinh học.”
SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI TRƯỜNG THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ - HÀ ĐÔNG ************** ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015) Tên đề tài: GÓP PHẦN LÀM SẠCH NGUỒN NƯỚC SINH HOẠT THỦ ĐÔ QUA VIỆC NGHIÊN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG XỬ LÝ ĐỘC TỐ TẢO LAM Ở HỒ HOÀN KIẾM BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC Lĩnh vực: Sinh học môi trường NGƯỜI HƯỚNG DẪN - TS Nguyễn Thị Hồi Hà - Đơn vị cơng tác: Viện Vi sinh Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà Nội TÁC GIẢ: Nguyễn Hữu Hải Trung, Lớp: 11 Sinh, Trường: THPT Chuyên Nguyễn Huệ Huỳnh Đức Anh, Lớp: 11 Sinh, Trường: THPT Chuyên Nguyễn Huệ - ThS.Trịnh Việt Văn - Đơn vị công tác: Trường THPT Chuyên Nguyễn Huệ Hà Nội, tháng 12 năm 2014 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn PHẦN I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan nghiên cứu 2.2 Điểm tính sáng tạo đề tài 2.3 Lợi ích đề tài PHẦN III Q TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 Nghiên cứu lý thuyết 3.2 Phương pháp nghiên cứu 14 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Sàng lọc vi tảo lam thuộc chi Microcystis mẫu tự nhiên : 17 4.2 Phân loại VKDD Pseudomonas SP8 19 4.3 Mơ hình xử lý độc tố microcystin phịng thí nghiệm 22 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 LỜI CẢM ƠN Nhóm khoa học thuộc đề tài: GÓP PHẦN LÀM SẠCH NƯỚC SINH HOẠT THỦ ĐÔ THÔNG QUA VIỆC XỬ LÝ ĐỘC TỐ TẢO LAM Ở HỒ HOÀN KIẾM BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH trường THPT CHUYÊN NGUYỄN HUỆ tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng em thời gian thực đề tài Chúng em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo thuộc Viện Vi sinh vật công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đưa lời khuyên giúp nhóm thực đề tài Nhóm chúng em xin cảm ơn cố vấn khoa học TS Nguyễn Thị Hoài Hà, ThS Phạm Thị Bích Đào - Trường đại học Khoa học Tự nhiên thầy giáo - ThS Trịnh Việt Văn, trường THPT Chuyên Nguyễn Huệ hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện để nhóm tác giả hồn thành tốt đề tài Cuối nhóm tác giả xin gửi lòng biết ơn đến cha mẹ, anh chị, gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên nhóm suốt thời gian thực đề tài NHÓM TÁC GIẢ PHẦN I: LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1.1 Lý chọn đề tài: - Qua phương tiện thông tin đại chúng, chúng em nhận thấy nguồn nước chảy cung cấp cho thành phố Hà Nội có nhiễm chất độc microcystins (MCs) tảo Mycrocystis aeuroginosa chưa xử lý, có ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng - Từ quan sát thực tế chuyến tham quan hồ Hoàn Kiếm, địa danh tiếng thủ đô Hà Nội, chúng em nhận thấy hồ chịu tác động lớn từ việc sinh sản nhanh tảo độc tình trạng nhiễm nặng nề rác thải hữu cơ, gây tượng “phú dưỡng” hồ - Sự nhân nhanh nhóm tảo độc M.aeruginosa làm cho lượng độc tố MCs chúng tạo tăng lên, độc tố có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống sinh vật thủy sinh hồ - Trong chương trình sinh học THPT chúng em biết, tảo lam bị cạnh tranh nhiều vi sinh vật khác sống mơi trường nước hồ Hồn Kiếm, chúng có khả phân giải độc tố MCs tảo lam, đảm bảo cân sinh thái môi trường nước hồ, đồng thời không tạo loại độc tố khác ảnh hưởng đến mơi trường hồ Điển hình nhóm vi khuẩn Pseudomonas fluorescens - Do chúng em liên hệ đối tượng chúng em quan tâm loài tảo độc M aeruginosa nguồn nước cung cấp cho Hà Nội dòng nước sông Đà Việc xử lý độc tố địa điểm Hồ Hoàn Kiếm thuận tiện Từ chúng em áp dụng xử lý với đối tượng nguồn nước sông Đà Từ lý chúng em tiến hành thực đề tài: “Góp phần làm nước sinh hoạt thủ thông qua việc xử lý độc tố tảo lam hồ Hoàn Kiếm biện pháp sinh học.” 1.2 Mục tiêu đề tài: - Xác nhận tính hiệu loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens việc xử lý độc tố MCs môi trường nguồn nước sinh hoạt cung cấp cho thành phố Hà Nội; - Đề xuất hướng xử lý độc tố MCs nguồn nước hồ nguồn nước sinh hoạt cung cấp cho thành phố Hà Nội phương pháp sinh học - Nâng cao hiệu xử lí MCs vi khuẩn Pseudomonas fluorescens; PHẦN II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan nghiên cứu: 2.1.1 Sự ô nhiễm M.aeruginosa hồ Hoàn Kiếm: - Tại hội thảo hồ Gươm, nhiều ý kiến nhà khoa học khẳng định môi trường nước hồ Gươm bị ô nhiễm nặng, chất lượng nước hồ ngày suy giảm, số 51 lồi vi tảo có gần 90% tảo lam độc hại - Đáng ý, xuất thường xuyên dày đặc loại tảo mà chủ yếu tảo lam độc thuộc chi Mycrocystis tạo nên đặc điểm bật hồ Gươm: độ pH mức cao 9,4 - 10,5 (số liệu quan trắc 2009-2010), hồ bị phì dưỡng cao, hàm lượng chất dinh dưỡng (NH4, TN, TP, COD) chất hữu bùn cao 2.1.2 Về ô nhiễm M.aeruginosa sông Đà: - Theo tài liệu nghiên cứu năm 2012, tình trạng nhiễm M.aeruginosa mơi trường nước khu vực tỉnh Hịa Bình đạt mức nhẹ [30] Tuy nhiên độc tố MCs có tính tích lũy nên ảnh hưởng tới sức khỏe người không xử lý tồn nước cung cấp sinh hoạt cho dân cư - Hơn thời điểm 2012 cách năm Có thể mơi trường thay đổi tạo điều kiện cho loài tảo độc phát triển Do nguy độc tố có nguồn nước ảnh hưởng sức khỏe người cịn chí tăng cao - Một số báo cho biết, khả sông Hồng nhiễm tảo độc không tránh khỏi bơi đoạn sơng Đà đổ vào đập thủy điện Hịa Bình có nhiều tảo độc Khi đóng đập tảo bị ứ lại, phát triển nhanh Bên cạnh có dấu hiệu cho tượng phát triển nhanh loài tảo độc chuyển màu xanh nước sông vốn đỏ màu phù sa [3] 2.1.3 Các công trình nghiên cứu MCs trước đây: Các MCs hợp chất có cấu trúc mạch vịng, có tính chất vật lý hóa học bền vững yếu tố pH, nhiệt độ chiếu xạ Những hợp chất tồn vài nước đun sơi, cịn điều kiện tự nhiên, khơng khí khơ nhiệt độ phịng, chúng tồn nhiều năm mà không bị phân hủy Tuy nhiên, ozon số tác nhân oxi hóa mạnh phá hủy cấu trúc MCs, ánh sáng chứa tia cực tím cường độ cao MCs bị phân hủy chậm điều kiện đủ ánh sáng mặt trời, đặc biệt có mặt sắc tố hịa tan nước Đây lý có nhiều phương pháp xử lý độc tố như: phương pháp vật lý (lắng lọc), phương pháp hóa học (kết tủa, keo tụ clo hóa ) ứng dụng xạ điện từ (sử dụng tia cực tím ) Mặc dù vậy, MCs nội độc tố tế bào vi khuẩn lam khỏe mạnh, thải vào môi trường tế bào bị ly giải chết bên cạnh hiệu xử lý phương pháp khơng cao việc sử dụng phương pháp làm giết chết tế bào đồng loạt làm tế bào bị phân hủy với số lượng lớn gây ô nhiễm môi trường, phương pháp khơng cịn khuyến cáo sử dụng [6; 21] Các độc tố vào hệ thống xử lý nước hợp chất hịa tan nước thơ tế bào tảo lam Vì vậy, hệ thống xử lý nước phải loại bỏ tế bào tảo lam sống mà không làm phá hủy tế bào loại bỏ độc tố chúng từ nước thơ Do đó, phương pháp sử dụng quần thể vi sinh vật có sẵn tự nhiên để phân hủy độc tố MCs có hiệu bền vững phương pháp nghiên cứu đầy hứa hẹn cho việc loại bỏ độc tố MCs mà không ảnh hưởng môi trường Bằng cách sử dụng độc tố MCs nguồn N C cho sinh trưởng có nhiều báo cáo cơng bố việc tìm chủng vi khuẩn có khả phân hủy độc tố MCs, chủng thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas, Sphingosinicella, Sphingopyxis, Paucibacter Burkholderia Trong đó, chủng thuộc chi Pseudomonas Sphingomonas chứng minh chứa phức hệ đa enzyme có khả mở vịng độc tố MCs chúng có tiềm ứng dụng lớn việc phân hủy độc tố MCs [2; 14] 2.2 Lợi ích đề tài: - Góp phần nâng cao chất lượng nguồn nước sinh hoạt cung cấp cho dân cư Hà Nội, bảo vệ sức khỏe người thông qua phương pháp sinh học làm độc tố MCs nước - Bảo vệ môi trường cảnh quan hồ thủy vực Hà Nội bị nhiễm M.aeuroginosa - Áp dụng xử lý với đối tượng bị nhiễm MCs M.aeruginosa 2.3 Điểm tính sáng tạo đề tài: - Đây đề tài sử dụng đối tượng vi khuẩn Pseudomonas flourescens việc xử lý độc tố MCs M.aeruginosa gây nước hồ Hoàn Kiếm - Đề xuất tạo màng sinh học từ P.fluorescens để xử lý độc tố MCs, hiệu cao tiết kiệm thời gian, công sức việc xử lý độc tố MCs - Lần đề xuất biện pháp làm nguồn nước sinh hoạt thông qua việc áp dụng việc sử dụng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens vào việc xử lý độc tố tảo lam MCs - Từ cơng trình nghiên cứu áp dụng khu vực có điều kiện tương tự, đặc biệt xử lý giảm thiểu lượng độc tố MCs nguồn nước sinh hoạt từ sông Đà cung cấp cho thủ đô Hà Nội PHẦN III QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT: 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 3.1.1.1 Vi tảo lam Microcystis aeruginosa độc tố microcystins: a) Vi tảo lam gây độc Vi tảo lam thể nhân sơ (procaryot), có khả quang hợp hiếu khí (quang tự dưỡng vơ cơ) dùng H 2O làm chất cho điện tử trình quang hợp Vi tảo lam chứa chlorophyll a phycocyanin- phycobiliprotein Một số lồi có sắc tố đỏ phycoerythrin.Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu nâu.Màng liên kết với phycobilisom Đơn bào đa bào dạng sợi Không di động di động cách trườn (gliding), số lồi có khơng bào khí (gas vesicles) Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) có khả cố định nitơ Vi tảo lam có mặt khắp nơi, đất, đá, suối nước nóng, nước nước mặn Chúng có lực chống chịu cao so với thực vật điều kiện bất lợi nhiệt độ cao, pH thấp Các hóa thạch có niên đại cổ cho thấy dấu hiệu vi tảo lam [3] Vi tảo lam có khả hình thành loạt chất chuyển hóa thứ cấp, nhiều chất có hoạt tính sinh học sinh hóa số xác định chất độc mạnh (cyanotoxins) Các độc tố tảo lam phân loại dựa vào đích tác động chúng đến thể là: độc tố gan, chất độc thần kinh, cytotoxins, dermatotoxins độc tố kích thích Dựa theo cấu trúc hóa học họ, cyanotoxins rơi vào số nhóm chính: peptide, hợp chất dị vịng (alkaloid) hợp chất lipit [11] b) Vi tảo lam Microcystis Thuộc Chroococcales với đặc điểm tế bào nhỏ, màu xanh lam sống thành tập đồn gồm hàng nghìn tế bào kích thước 2-3µm tế bào có chứa khơng bào khí giúp chúng mặt nước để thu nhận ánh sáng tốt trình quang hợp Microcystis phân bố khắp nơi, gây tượng “nở hoa” sinh độc tố MCs Trong loại vi tảo lam sinh độc tố Microcystis xuất thường xuyên phổ biến nhất, chúng dễ “nở hoa” mơi trường có đầy đủ yếu tố: dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, tốc độ gió (gió nhẹ khơng có gió) số yếu tố khác, tổ hợp yếu tố dễ tồn hồ thủy điện Hịa Bình, điều kiện Hồn Kiếm vào thời điểm đầu mùa hè (tháng 3,4,5), nên thời điểm hồ xảy “nở hoa” tảo lam dội Microcystis “nở hoa” không sinh độc tố có hại mà ảnh hưởng từ tượng “nở hoa” lớn như: làm giảm đa dạng lồi (trong hồ Hồn Kiếm có nhiều loài vi tảo quý hiếm); tăng độ đục; tỷ lệ bồi lắng tăng gây giảm tuổi thọ hồ làm giảm lượng oxy hòa tan nước hồ nguồn nước bị nhiễm Mycrocystis Hình 3.1.1.a Microcystis nhìn kính hiển vi (x400) [2] Hình 3.1.1.b Tế bào Microcystis kính hiển vi điện tử [2] c) Độc tố microcystins Độc tố MCs thuộc nhóm độc tố gan (hepatotoxin), phân lập từ nhiều chi vi khuẩn lam, bao gồm Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Planktothrix, Chroococcus Nostoc Trong phổ biến lồi tảo lam Microcystis aeruginosa chúng có khả phân bố rộng phát triển tốt triên nhiều kiểu khí hậu khác nhau, chúng trở thành mối đe dọa tồn cầu cho sức khỏe người [11] Tên gọi microcystins (MCs) xuất phát từ việc hợp chất tách lần từ loài tảo lam Microcystis aeruginosa Cấu trúc phân tử Microcystin peptide đơn vòng nhỏ với khối lượng phân tử khoảng 1000 Daltons, bao gồm amino acid cấu trúc Cấu trúc hóa học vịng (-D-Ala1X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-Glu6-Mdha7) X Z L-amino acid, DMeAsp axit D-erytho-β-methylaspartic Mdha N-methyldehydroalanin Adda axit (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic, cấu trúc có nhóm độc tố peptide dạng vòng tảo lam quan trọng việc biểu hoạt tính sinh học MCS [18] Hình 3.1.1.2 Cấu trúc phân tử độc tố MC-LR [7] D - Alanine Leucine (X - thay amino acid) D - Methyl aspartic acid Arginine (Z - thay amino acid) Adda D - Glutamic acid N- Methyl-dehydro-alanine Các độc tố MCs khác tạo thành thường thay đổi gốc amino acid vị trí 2; 3; hình Trong vị trí số D-erythro-βmethylaspartic acid (D-MeAsp) số N-methyldehydroalanine (Mdha) thay đổi thường có hay khơng methyl hóa, cịn thay L-acid amin vị trí 2(X) 4(Z) thay đổi thường tạo biến thể độc tố MCS phổ biến bảng 3.1 [12] Và dựa vào thành phần amino acid cấu thành nên độc tố MCS chúng chia thành hai loại kỵ nước vào không kỵ nước, độc tố MCs kỵ nước dạng thường Cho đến có 90 biến thể khác MCs biết đến Bảng 3.1 Các amino acid xuất cấu trúc microcystin Tên Microcystin LA Microcystin YR Microcystin RR Microcystin LR Amino acid vị trí X Leucine (L) Amino acid vị trí Z Alanine (A) Khối lượng phân tử 910.06 Tyrosine (Y) Arginine (R) 1045.19 Arginine (R) Leucine (L) Arginine (R) Arginine (R) 1038.2 995.17 Độc tính microcystins: Ở cấp độ phân tử độc tố MCs chứng minh có khả ức chế protein photphatase nhóm 2A (PP1 PP2A) Protein photphatase enzyme xúc tác cho việc loại gốc photphoryl serine threonine, ức chế protein phosphate dẫn tới phosphoryl hóa mức vi sợi, vi ống, sợi liên bào, dẫn đến làm phân hủy khung tế bào phá hủy cấu trúc siêu vi gan Sự co rút tế bào gan so với tế bào liền kề mao mạch dẫn đến chảy máu mô gan Điều dẫn đến kết cuối tổn thương cục bộ, chức quan xuất huyết [15;16;18] Hình 3.1.1.3 Quá trình ức chế photphatases P1 2A [18] Sự tiếp xúc lâu dài với nồng độ MCs thấp nước uống nhân tố gây ung thư gan người Các nghiên cứu chế động học tế bào cho biết microcystin ảnh hưởng lớn đến cấu trúc tế bào trình nguyên phân, điều giúp giải thích khả kích thích gây ung thư chúng Các độc tố gây ảnh hưởng xấu đến hai loại enzyme serin - photphatase threonin - photphatase liên quan tới điều hòa phát triển tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển hoạt động tế bào động thực vật trình phân chia, sinh trưởng, trao đổi chất, chép ADN 10 Hình 3.1.2.2 Con đường phân hủy MC-LR vi khuẩn di dưỡng Pseudomonas 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phân lập vi khuẩn dị dưỡng từ nước hồ nở hoa: Các mẫu nuôi thực phịng thí nghiệm: nước mẫu từ hồ Hoàn Kiếm thu vùng “nở hoa” vi tảo lam Microcystis lọc qua lưới 20µm, sau tiếp tục lọc qua phin lọc Tiến trình lọc nhằm loại bỏ phần lớn động vật nguyên sinh Lấy 1ml nước hồ pha loãng nồng độ pha lỗng thích hợp Nhỏ 1ml dịch pha lỗng mơi trường dịch thể NA có bổ sung 10g/l microcystins Sau 24 nhỏ 100µl dịch cấy trang mặt thạch Sau 20-24giờ, quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Tách khuẩn lạc, trình lặp lại nhiều lần thu khuẩn lạc khiết Nuôi giữ chủng VKDD môi trường thạch nghiêng, bảo quản nhiệt độ 4°C dùng cho nghiên cứu 3.2.2 Đếm số lượng tế bào (số khuẩn lạc đĩa thạch): Tế bào vi sinh vật sống tế bào có khả sinh trưởng để tạo thành quần thể Trên bề mặt mơi trường đặc, quần thể tạo đám có hình dạng, màu sắc riêng biệt gọi khuẩn lạc Từ số khuẩn lạc mọc đĩa thạch suy số tế bào sống có mẫu cấy mặt thạch Cách tiến hành: Để tách rời tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch pha loãng Cấy trải dịch pha loãng đĩa thạch LB Sau đem ni cấy nhiệt 14 độ 28oC 24 - 48 đếm số khuẩn lạc mọc đĩa Chú ý cần phân biệt khuẩn lạc lạ hình thành tạp nhiễm khơng tính chúng Số lượng tế bào tính theo cơng thức: Số lượng tế bào tính theo công thức: 1 Số l ợng tế bào=a∗ ∗ k v a: số khuẩn lạc trung bình xuất đĩa cấy có độ pha lỗng v: thể tích dịch pha lỗng cấy mặt đĩa thạch k: độ pha loãng dịch cấy Ở đơn vị tính CFU/ml CFU/g, nghĩa số đơn vị hình thành khuẩn lạc ml đơn vị thể tích gam chế phẩm 3.2.3 Phân tích giải trình tự 16S rADN: Ở cơng đoạn này, chúng em liên hệ với phịng thí nghiệm “First base of Singapore” để nhờ phân tích giải trình tự 16S rADN vi khuẩn, từ xác định xác lồi vi khuẩn sử dụng Pseudomonas flourescens Tách chiết ADN [55] Nhân đoạn gen phản ứng PCR [36] Xác định trình tự gen máy tự động (ABI Prism 3100 Avant) Xây dựng phát sinh loài: loài nghiên cứu với lồi tương ứng c ơng bố ngân hàng genbank NCBI, chương trình ClustalW Mega 5.10 3.2.4 Nghiên cứu xây dựng mơ hình phân hủy độc tố microcystin Mục đích thí nghiệm: Xác định tốc độ phân hủy độc tố microcystin VKDD chế phẩm bể chứa vi khuẩn dạng tự bể có gắn màng sinh học 3.2.4.1 Xử lý trực tiếp (vi khuẩn dạng tự do): Nguồn nước sử dụng nghiên cứu: nước hồ Hoàn Kiếm Bể nghiên cứu nhựa kích thước: dài × rộng × cao = 60 × 20 ×20 cm Lấy 20 lít nước, bổ sung microcystin để điều kiện nghiên cứu 20µg/l Bổ sung dịch thể chế phẩm sinh học hoạt hóa để nồng độ 108 FCU/ml Theo dõi hàm lượng microcystin bể vào thời gian: 0; 1; 3; ngày thí nghiệm Nhiệt độ thí nghiệm: 30 oC Sử dụng chế độ sục khí tạo đồng suốt thời gian thí nghiệm 3.2.4.2 Xử lý bể có gắn màng sinh học: Sự hình thành màng sinh học vật liệu dính bám 15 Để lựa chọn vật liệu tốt cho xử lý bể gắn màng sinh học, bề mặt phi sinh vật sử dụng từ vật liệu PS (polystyrene), PVC thủy tinh (nhóm chọn PS vật liệu dễ tạo màng an tồn PVC) cho xác định hình thành màng sinh học Tấm nhựa PS cắt thành có kích thước × cm Bản nhựa PS làm ethanol 70%, sau rửa lại nước cất vô trùng Đặt vào đĩa Petri vô trùng sấy 40°C khô Dịch nuôi VKDD bổ sung vào các đĩa, nuôi cấy tĩnh 28-30oC, 24, 48 72 Sự hình thành màng sinh học vật liệu kiểm tra cách sử dụng dung dịch tinh thể tím 1% Thu tế bào nhuộm màu bề mặt vật liệu đo quang phổ bước sóng 600nm Cách tính sau: A=Am − Ac Trong đó: Am giá trị OD600 mẫu vật liệu thu sau nhuộm Ac giá trị OD600 mẫu dịch VKDD đĩa Petri thời điểm ni cấy Khả hình thành màng sinh học phân lớp cách sử dụng tiêu chuẩn Stepanovic, Cirkovic, Ranin Svabic-Vlahovic (2004) [20] sau: A ≤ Ac - khơng hình thành màng sinh học Ac < A ≤ (2×Ac) - hình thành màng sinh học yếu (2×Ac) < A ≤ (4×Ac) - hình thành màng sinh học vừa phải (4×Ac) < A - hình thành màng sinh học mạnh Xử lý bể có gắn màng sinh học Nguồn nước sử dụng nghiên cứu: nước hồ Hoàn Kiếm Bể nghiên cứu nhựa kích thước: dài × rộng × cao = 60 × 20 ×20 cm Lấy 20 lít nước, bổ sung microcystin để điều kiện nghiên cứu 20µg/l Màng sinh học cố định vật liệu dính bám loại sợi polystyrene (PS) Theo dõi hàm lượng microcystin bể theo thời gian: 0; 1; 3; ngày thí nghiệm Nhiệt độ thí nghiệm 30oC Sử dụng chế độ sục khí tạo đồng suốt thời gian thí nghiệm 16 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sàng lọc vi tảo lam thuộc chi Microcystis mẫu tự nhiên Trong nghiên cứu chúng em dựa đặc điểm đặc trưng M aeruginosa có khơng bào khí (gas vacuoles) nên chúng thường bề mặt Do vậy, chúng em tiến hành thu thập mẫu từ tự nhiên, ly tâm 9.000 vịng/15 phút Sau mẫu quan sát kính Zeiss độ phóng đại 400 lần Kết thể hình 4.1.1a 4.1.1b: Hình 4.1.1a Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp Dạng tập đồn, tế bào hình cầu màu xanh lam với nhiều khơng bào khí, đường kính tế bào - 6μm, bao nhầy dày khơng màu Hình 4.1.1b Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp Tập đồn với tế bào hình cầu, tế bào có màu xanh nhạt, đường kính tế bào 37μm, tập hợp thành tập đồn nhỏ có bao nhầy rõ rệt Ở hình 4.1.1a 4.1.1b chúng em nhận thấy đặc điểm hình thái mẫu thu thập có nhiều điểm tương đồng với lý thuyết mơ tả chúng, tế bào dạng hình cầu, tập đồn với bao nhầy rõ rệt, tế bào hình cầu với đường kính - 5μm, với nhiều khơng bào khí bên trong, đường kính tế bào - 7µm Miêu tả chúng em phù hợp với miêu tả Watanabe [13] Các mẫu chúng em ký hiệu MC01 MC02 Tiếp theo, để định danh mẫu thu có phải M.aeruginosa khơng Chúng em tiến hành phân tích kết giải trình tự 16S rADN Nghiên cứu thu nhận sinh khối quy trình đơng khơ sinh khối vi tảo lam độc M.aeruginosa từ hồ Hoàn Kiếm với lượng lớn: Trong nghiên cứu này, chúng em nhằm mục đích, thu thập lượng lớn sinh khối từ tự nhiên, đồng nghĩa cung cấp lượng lớn hỗn hợp MCS tự nhiên có mặt sinh khối Chúng em tiến hành bước nghiên cứu sau: 17 Mẫu vi tảo lam thu vào ngày nắng, nóng mùa hè năm Hình 4.1.2 Thu thập mẫu Hồ Hồn Kiếm Quy trình đơng khơ Dựa quy trình đơng khơ sinh khối xây dựng hình 3.22 Trong tháng tháng thu lượng lớn 200 gam sinh khối khô vi tảo lam Microcystis aeruginosa Lượng sinh khối chúng em dùng làm chất cho tất nghiên cứu Thu mẫu lưới No 75 (1) Ly tâm (7000/20 phút) (2) Thu sinh khối vi tảo lam (Microcystis aeruginosa chiếm >90%) (3) Kiểm tra hình thái vật kính (×40) kính hiển vi phản pha Zeiss (4) Sơ xác định vi tảo lam Microcystis aeruginosa (5) Rửa sinh khối (muối sinh lý 1‰) (6) Đông khô chân không sinh khối vi tảo lam -83oC tới khô (7) Bảo quản túi nilon (8) [ơ 18 Hình 4.1.3 Sinh khối vi tảo lam Microcystis aeruginosa đông khô 4.2 Phân loại VKDD Pseudomonas SP8 4.2.1 Đặc điểm hình thái học: Trong nghiên cứu này, chúng em quan sát hình thái khuẩn lạc đĩa thạch, có bổ sung MCs thơ, nhuộm Gram Mơ tả hình dạng tế bào quan sát kính hiển vi điện điện tử qt độ phóng đại 1500 lần Chúng em nhận thấy VKDD SP8 Gramâm, có tiên mao, có khả tiết sắc tố ngồi mơi trường ni phát quang tia cực tím Hình 4.2.1b Tế bào VKDD SP8 quan sát kính hiển vi điện tử qt (SEM) Ở hình 4.2.1b chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 15000 lần cho thấy VKDD SP8 có tế bào hình trụ, kích thước khoảng 1-2 µm, tế bào nằm lớp màng nhày Do vậy, khó quan sát tiên mao Hình 4.2.1a Hình thái khuẩn lạc VKDD SP8 (24h nuôi cấy) 19 Kết luận: Dựa đặc điểm hình thái đồng thời dựa vào khóa phân loại khác chúng em sơ phân loại VKDD SP8 thuộc chi Pseudomonas ký hiệu Pseudomonas SP8 Kết chưa đủ thông tin để định danh xác chủng VKDD SP8 thuộc lồi chi Pseudomonas Thí nghiệm chúng em cán hướng dẫn tiến hành phân tích giải trình tự 16S rADN 4.2.2 Phân tích giải trình tự 16S rADN: Nhờ giúp đỡ phịng thí nghiệm “First base of Singapore” việc phân tích ADN, chúng em nhận kết giải trình tự 16S rADN VKDD SP8 VKDD Pseudomonas SP8 có mối quan hệ gần gũi, có độ tương đồng đến 99% với trình tự gen lồi Pseudomonas fluorescens KC773765 14 loài khác đăng ký ngân hàng gen quốc tế Hình 4.2.2 Sản phẩm PCR VKDD Pseudomonas SP8 Khoảng cách tiến hóa tính tốn để thiết lập sở liệu bao gồm trình tự VKDD Pseudomonas SP8 trình tự khác nhóm Pseudomonas, thuộc phân lớp gamma Proteobacteria Cây phả hệ xây dựng lại sở số liệu ma trận khoảng cách thu hình 3.4, neighbour joining thước đo = 0,0005 Knor trình tự nucleotid Các giá trị hiển thị nhánh kết phân tích boostrap với độ lặp lại 1000 lần Giá trị bootstrap cao nhánh VKDD Pseudomonas fluorescens KC773765 (96%) dùng hỗ trợ đánh giá cao mối quan hệ gần gũi chúng Kết luận: chúng em dựa vào kết hình thái học phân tích giải trình tự rADN 16S đồng dựa vào khóa phân loại khác Định danh VKDD SP8 thuộc lồi Pseudomonas fluorescens, với vị trí phân loại khoa học sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Loài: Pseudomonas fluorescens 20 ... nước sinh hoạt thủ đô thông qua việc xử lý độc tố tảo lam hồ Hoàn Kiếm biện pháp sinh học.” 1.2 Mục tiêu đề tài: - Xác nhận tính hiệu loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens việc xử lý độc tố MCs... flourescens việc xử lý độc tố MCs M.aeruginosa gây nước hồ Hoàn Kiếm - Đề xuất tạo màng sinh học từ P.fluorescens để xử lý độc tố MCs, hiệu cao tiết kiệm thời gian, công sức việc xử lý độc tố MCs - Lần... sống sinh vật thủy sinh hồ - Trong chương trình sinh học THPT chúng em biết, tảo lam bị cạnh tranh nhiều vi sinh vật khác sống mơi trường nước hồ Hồn Kiếm, chúng có khả phân giải độc tố MCs tảo lam,