Báo cáo thi khoa học kĩ thuật dành cho học sinh, đề tài môn sinh học, khảo sát tế bào gây ung thư

A PHẦN CHUNG I LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Xu hướng ngày việc sử dụng dược liệu từ thiên nhiên đặc biệt dược liệu từ thực vật người ưa chuộng Hiện ung thư bệnh quái ác, đe dọa đến tính mạng sức khỏe người Do đó, việc điều chế loại thuốc điều trị khống chế bệnh ung thư vấn đề cấp bách xã hội Được bảo trợ PGS TS Mai Đình Trị hướng dẫn Thầy Nguyễn Trung Duẩn, mong muốn tìm chất có ích việc chữa bệnh cho người nhằm gìn giữ bảo tồn loài dược liệu quý này, chúng em chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan, vú, tử cung phân đoạn cao hexane trơm Sterculia foetida Linn (Sterculiaceae)” II MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Việt Nam chưa có tác giả nghiên cứu thành phần hóa học trơm dược tính Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học dược tính trơm (Sterculia foetida Linn.) cần thiết III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng Lá trôm thu hái huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận định danh TS Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp HCM Mẫu tiêu (VH/TRI-0118) lưu giữ Phịng chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung khảo sát thành phần hóa học thử hoạt tính cao hexane trôm thuộc phân đoạn III Nơi thực hiện: Phịng cơng nghệ hóa học hoạt tính sinh học - Viên Cơng Nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Tp HCM IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ∗ ∗ Trích ngâm dầm bột etanol Chiết lỏng – lỏng với dung môi hexane ∗ ∗ ∗ Chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform Chiết lỏng – lỏng với dung môi etyl axetat Sử dụng sắc ký lớp mỏng sắc ký cột pha thường để tách tinh chế chất ∗ Sử dụng phương pháp phổ nghiệm để giải đoán cấu trúc hợp chất tinh khiết: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phổ khối lượng phun mù điện phân giải cao (HR-ESI-MS) V NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Có nội dung sau: - Lá trôm thu hái, lặt bỏ vàng úa, sâu bệnh, rửa phơi khơ, sau đem xay thành bột - Điều chế cao etanol thô từ bột khô phương pháp ngâm dầm - Từ cao etanol thơ điều chế cao có độ phân cực tăng dần từ hexane, chloroform, ethyl axetat phương pháp chiết lỏng – lỏng - Sắc ký cột cao hexane thành phân đoạn nhỏ - Sàng lọc hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư phân đoạn cao hexane - Cô lập tinh chế hợp chất phân đoạn có hoạt tính cao - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết cô lập từ trôm phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phổ khối lượng phun mù điện phân giải cao (HR-ESI-MS) - Thử hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư hợp chất lập VI NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI Lá trơm Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu khoa học thành phần hóa học hợp chất dược tính chúng Đặc biệt đề tài phân lập hợp chất mà Thế giới chưa nhà nghiên cứa tìm VII Ý NGHĨA Đề tài có ý nghĩa góp phần việc tìm hiểu thành phần hóa học nhằm nâng cao giá trị sử dụng trôm việc chữa trị số bệnh ung thư B BÁO CÁO NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I TỔNG QUAN VỀ CÂY TRÔM Giới thiệu chung * Nơi phân bố: Huyện Đức Linh - Tỉnh Bình Thuận * Tên gọi:  Tên khoa học: Sterculia foetida Linn (Sterculiaceae)  Tên khác: Trôm * Hệ thống phân loại khoa học: Theo tài liệu Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam tác giả Võ Văn Chi[3] chi Sterculia thuộc: − Ngành : Ngọc lan (Magnoliophyta) - Lớp Ngọc lan : (Magnoliopsida) - Phân lớp : Hành (Liliidae) - Bộ: Cẩm Q (Malvales) − Họ: Trơm (Sterculiaceae) Hình ảnh mơ tả thực vật Cây trơm Lá trơm Quả trơm chín hạt trơm Quả trơm xanh Hoa trơm Mủ trơm tươi Hình 1: Hình ảnh trơm (Sterculia foetida Linn.) Hoạt tính sinh học trôm Cao methanol trôm với hàm lượng 200mg/kg 400mg/kg trọng lượng thể vật chủ thí nghiệm thể hoạt tính chống đái tháo đường hạ huyết áp.[6] Cao ethanol nồng độ 95% trơm có hoạt tính kháng khuẩn (Escherichia coli, Staphylococcus aureus), kháng nấm, khử độc tế bào.[7] Cao hexane từ hạt trôm chứa hợp chất (2n-octylcycloprop- 1-enyl)-octanoic acid với liều lượng 0,2mg/cm2 có hoạt tính chống muỗi vectơ nồng độ 25 đến 65 mg / L kháng tế bào ung thư HeLa Ấn Độ [22] II THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất - Silicagel hạt cỡ 0,04 – 0,06 mm pha thường - Sắc kí lớp mỏng tiến hành lớp mỏng tráng sẵn TLC Silica gel F254 hiệu Merck pha thường - Dung môi sử dụng: metanol, etanol, etyl axetat, clorofom, hexane - Thuốc thử giúp vệt chất hữu lớp mỏng: 10% H2SO4 etanol Dụng cụ thiết bị Tủ sấy dùng sấy khô dụng cụ thủy tinh làm khơ ngun liệu Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, phểu chiết, bếp điện, cân điện tử, ống mao quản, cột sắc ký … Máy cô quay chân khơng Máy soi UV (bước sóng 366 nm 254 nm) để soi mỏng Phương pháp thực - Điều chế cao etanol thô từ mẫu phương pháp ngâm dầm - Điều chế cao hexane, chloroform, etyl axetat phương pháp chiết lỏnglỏng - Cô lập hợp chất phương pháp: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột pha thường - Cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết lập từ trôm xác định phương pháp phổ NMR phổ HR-ESI-MS Tiến trình thực 1HPhổ 4.1 Thu hái xử lý mẫu Lá trơm thu hái huyện Đức Linh, tỉnh Bình Thuận vào tháng 01 năm NMR 2018 Lá tươi (30 kg), sau thu hái, rửa sạch, phơi khơ tự nhiên - Phổ 13Ctrong khơng khí nhiệt độ phịng (khoảng 20oC-30oC), khơng tiếp xúc với ánh NMR nắng trực tiếp khoảng thời gian 14 ngày, thu 12 kg khô 4.2 Điều chế loại cao Cô Từ cao hexane ( 450.5 g) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường quay với hệ dung môi giải ly H:Ea 100%-0, 20-1, 10-1, 5-1, 1-1, 1-5, 0-100% hứng cao phần dịch vào bình 500 mL, cô quay đuổi dung môi, tiến hành SKLM chia tổng thành 07 phân đoạn: SFH-I (140 g), SFH-II (45 g), SFH-III (30 g), SFH-IV (75 g), SFH-V (30 g), SFH-VI (55 g), SFH-VII (30 g) Bảng 2.1 Kết sắc kí cột silica gel cao hexane (450.5 g) S K L M Cao hexan 450.5 g Hệ dung môi Tỉ lệ Phân đoạn H:Ea 100%: SFH-I (140 g) H:Ea 20:1 H:Ea 10:1 H:Ea 5:1 H:Ea 1:1 H:Ea Sắc ký lớp mỏng Có nhiều vết sát nhau, chưa khảo sát Có vết trịn đậm, chọn khảo SFH-II (45 g) sát Có vết trịn đậm, chọn khảo SFH-III (30 g) sát Có vết trịn đậm, chọn khảo SFH-IV (75 g) sát Có vết trịn đậm, chọn khảo SFH-V (30 g) sát SFH-VI (55 g) Kéo vệt, chưa khảo sát 1:5 0:100 H:Ea SFH-VII (30 g) Kéo vệt, chưa khảo sát % 4.3 Cô lập hợp chất Sử dụng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng phân đoạn cao hexane để phân lập hợp chất * Quá trình chuẩn bị sắc kí cột Chọn cột phù hợp với cao, tiếp nhỏ metanol từ thành cột xuống nhằm rửa cột, sấy khô cột Dùng kẹp sắt lắp cột vào giá sắt cho cột thẳng đứng song song với trục giá Chọn pha hệ dung môi chạy cột, cân silicagel cần dùng sau lấy khoảng lượng dung mơi pha hồ với lượng silicagel cân vào cốc thủy tinh Sau đó, lấy bơng gịn đặt đáy cột để silicagel khơng chảy ngồi, cho dung mơi chạy cộ vào cột rót nhẹ silicagel dung mơi vào cột Tiếp theo xả cột để cố định silicagel rót thêm dung mơi vào cột để ổn định hệ Mẫu cà nhuyễn với silcagel tạo thành hỗn hợp khô cho hết vào cột phễu.Tiếp theo, rót dung mơi chạy cột vào từ từ cách dùng ống hút dung môi nhỏ vào dùng phểu rót vào Hồn thành xong việc nạp mẫu Hình 3: Sắc ký cột * Qúa trình phân lập hợp chất Các phân đoạn đem thử sàng lọc hoạt tính gây độc ba dịng tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư gan HepG2 ung thư cổ tử cung HeLa nồng độ 100 µg/mL Trong đó, phân đoạn SFH-III có hoạt tính tốt với phần trăm gây độc tế bào ≈ 62%, 48% 59% nồng độ 100 µg/mL với ba dòng MCF-7, HepG2, HeLa Ở phân đoạn SFH-III (30 g), tiến hành SKC với hệ dung môi H:Ea (10:1), dựa vào SKLM tách thành phân đoạn từ SFH-III.1 (2.7 g), SFH-III.2 (2.8 g), SFH-III.3 (7.2 g), SFH-III.4 (3.5 g) SFH-III.5 (4.8 g) Phân đoạn Bảng 1: Kết khảo sát phân đoạn SFH-III.3 Hệ dung môi Khối lượng Kết SKBM chạy cột SFH-III.1 H-Ea (20-1) 0.8 g Nhiều vết SFH-III.2 H-Ea (15-1) 2.8g Nhiều vết SFH-III.3 H-Ea (10-1) 7.2 g vết tím rõ SFH-III.4 H-Ea (5-1) 3.5 g Nhiều vết SFH-III.5 H-Ea(1:1) 4.8 g Nhiều vết Ghi Không khảo sát Không khảo sát LT02 (15 mg) LT03 (18 mg) LT06 (12mg) Không khảo sát Không khảo sát Ở phân đoạn SFH-III (7.2 g) có vết to đậm màu tím, tiến hành SKC với hệ dung môi H:Ea (10:1), dựa vào SKLM tách thành phân đoạn từ SFHIII.3.1 (0.6 g), SFH-III.3.2 (1.5 g), SFH-III.3.3 (2.8 g), SFH-III.3.4 (0.4 g) Phân đoạn SFH-III 3.2 (2.8 g) có vết to đậm màu tím, tách xa nên tiến hành chạy SKC silica gel nhiều lần phân đoạn SFH-III.3.2 với dung môi H:Ea(10:1) Kết thu 02 chất rắn màu trắng, hịa tan mẫu metanol chấm SKLM dung mơi H:Ea (7:1), cho vết với Rf = 0,45, không hấp thu UV Chất LT02 (15 mg) chấm SKLM dung môi H:Ea (5:1), cho vết với Rf = 0,4, có hấp thu UV Chất LT03 (18 mg) Tiến hành chạy SKC silica gel lần phân đoạn SFH-III.3.2 với dung môi H:Ea (5:1) Kết thu 01 chất rắn màu trắng, hịa tan mẫu metanol chấm SKLM dung mơi H:Ea(3:1), cho vết với Rf = 0,48, không hấp thu UV Chất LT06 (12 mg) Kết khảo sát thành phần hóa học phân đoạn SFH-III.3 lập 03 hợp chất kí hiệu LT02, LT03 LT06 Ba hợp chất gửi đo phổ Phần biện luận công thức hai hợp chất trình bày cụ thể phần III KẾT QUẢ Xác định cấu trúc LT03 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm) kết hợp với DEPT cho thấy LT03 có 30 carbon, có diện carbon methyl bậc ba với carbon olefin δC 144,5 121,9 đặc trưng cho carbon olefin C-13, C-12 khung olean-12-en[26] Ngoài ra, LT03 cịn có carbon ceton δC 212,4 (C-1); carbon oxymethin δC 74,0 (C-2) 85,2 (C-3), cho thấy LT03 triterpenoid khung olean-12-en mang nhóm hydroxyl nhóm oxo Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, δ ppm) LT03 cho tín hiệu: proton olefin δH 5,21 (1H, t-like, J = 3,5 Hz, H-12); proton oxymethin δH 4,55 (1H, dd, J = 6,0 10,0 Hz, H-2) 2,97 (1H, dd, J = 2,0 10,0 Hz, H-3); proton nhóm methyl bậc ba δH 0,83-1,36, khẳng định lại LT03 có khung olean-12-en mang nhóm hydroxyl[1] Phổ HMBC LT03 cho thấy tương tác proton methin δH 2,35 (1H, dd, J = 6,0 11,0 Hz, H-9) proton methyl δH 1,36 (3H, s, H-25) với carbon ceton δC 212,4 (C-1); giúp xác định nhóm oxo gắn vào khung sườn vị trí C-1 Ngồi ra, oxymethin δH 2,97 (1H, dd, J = 2,0 10,0 Hz, H-3) với carbon methyl δC 17,1 (C-24), 28,7 (C-23) carbon oxymethin δC 74,0 (C2); giúp xác định nhóm hydroxyl gắn vào khung sườn vị trí C-2 C-3 Hơn nữa, phổ COSY LT03 giúp khẳng định lại vị trí nối nhóm hydroxyl thơng qua tương quan proton oxymethin δH 4,55 (1H, dd, J = 6,0 10,0 Hz, H-2) 2,97 (1H, dd, J = 2,0,5 10,0 Hz, H-3) Mặt khác, phổ NOESY LT03 cho thấy tương quan proton methyl δH 1,36 (3H, s, H-25) 1,10 (3H, s, H-24) có định hướng β với proton oxymethin δH 4,55 (1H, dd, J = 6,0 10,0 Hz, H-2); khi, proton methyl δH 1,09 (3H, s, H-23) proton methin δH 0,94 (1H, dd, J = 2,5 11,5 Hz, H-5) có định hướng α lại tương quan với proton oxymethin δH 2,97 (1H, dd, J = 2,0 10,0 Hz, H-3); giúp xác nhận proton H-2, H-3 có định hướng β α, suy nhóm hydroxyl C-2 C-3 có định hướng α β Từ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC NOESY; khẳng định LT03 2α,3β-dihydroxyolean-12ene-1-on, hợp chất đặt tên Stercufoetin A (tra cứu sở liệu phần mềm Scifinder Australia) Hình 1: Các tương tác COSY, HMBC NOESY hợp chất LT03 - Stercufoetin A (1): Phổ ACPI – MS LT03 cho đỉnh ion phân tử giả m/z: 457.42[M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C30H48O3: 456,29), giúp xác định CTPT TL03 C30H48O3 H-NMR (CDCl3, 500 MHz, J in Hz): 4.55 (1H, dd, J = 6.0 and 10.0 Hz, H-2), 3.55 (1H, d, J = 6.0 Hz, OH-2), 2.97 (1H, dd, J = 2.0 and 10.0 Hz, H-3), 2.60 (1H, d, J = 2.5 Hz, OH-3), 0.94 (1H, dd, J = 2.5 and 11.5, H-5), 1.65 (1H, m, H-6a), 1.62 (1H, m, H-6b), 1.47 (1H, m, H-7a), 1.40 (1H, td-like, J = 4.0 and 6.0, H-7b), 2.36 (1H, dd, J = 6.0 and 11.0, H-9), 2.31 (1H, ddd, J = 5.0, 5.5 and 18.0, H-11a), 1.85 (1H, ddd, J = 2.5, 11.0 and 17.5, H-11b), 5.21 (1H, t-like, J = 3.5, H-12), 1.78 (1H, td-like, J = 9.0 and 13.5, H-15a), 0.97 (1H, m, H-15b), 2.00 (1H, td-like, J = 4.0 and 13.5, H-16a), 0.80 (1H, m, H-16b), 1.96 (1H, dd, J = 4.0 and 12.5, H-18), 1.31 (1H, dd, J = 4.0 and 12.5, H-19a), 1.12 (1H, dd, J = 3.0 and 4.0, H-19b), 1.68 (1H, m, H-21a), 1.07 (1H, m, H-21b), 1.44 (1H, m, H22a), 1.21 (1H, td-like, J = 3.0 and 13.5, H-22b), 1.09 (3H, s, H-23), 1.10 (3H, s, H-24), 1.36 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-26), 1.17 (3H, s, H-27), 0.83 (3H, s, H28), 0.89 (3H, s, H-29), 0.88 (3H, s, H-30) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 212.4 (C-1), 74.0 (C-2), 85.2 (C-3), 38.7 (C-4), 54.8 (C-5), 17.6 (C-6), 32.5 (C-7), 42.0 (C-8), 39.4 (C-9), 51.8 (C-10), 25.2 (C-11), 121.9 (C-12), 144.5 (C-13), 39.7 (C-14), 26.1 (C-15), 26.9 (C-16), 32.6 (C-17), 47.4 (C-18), 34.8 (C-19), 31.1 (C-20), 46.5 (C-21), 37.1 (C-22), 28.7 (C-23), 17.1 (C-24), 15.3 (C-25), 17.6 (C-26), 25.9 (C-27), 28.4 (C-28), 33.4 (C-29), 23.7 (C-30) Xác định cấu trúc LT06 Hợp chất LT 06 (15 mg) thu từ phân đoạn SFH-III.3, chất bột vơ định hình màu trắng Sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi giải ly H: Ea (5:1), màu dung dịch H2SO4 20%, nung nóng mỏng nhiệt độ cao cho vết màu tím có Rf = 0.45 - Phổ 1H-NMR (CDCl3 - d1, 500 MHz) (phụ lục 3.6) Phổ 13C-NMR (CDCl3 - d1, 125 MHz) (phụ lục 3.7) Phổ DEPT (CDCl3 - d1) (phụ lục 3.8) Phụ lục 2.6: Phổ HMBC LT06 Taraxerol Phụ lục 3.1: Phổ HR-ESI-MS LT02 Phụ lục 3.2: Phổ 1H-NMR LT02 Phụ lục 2.3: phổ 13C-NMR LT02 Phụ lục 3.3: Phổ 13C-NMR LT02 Phụ lục 3.4: phổ DEPT LT02 Phụ lục 2.5: phổ COSY LT02 Phụ lục 2.6: phổ HSQC LT02 Phụ lục 2.7: phổ HMBC LT02 Phụ lục 2.5: Phổ HSQC LT02 Phụ lục 2.6: Phổ HMBC LT02 Phụ lục 2.5: Phổ HSQC LT02 Phụ lục 3.5: Phổ HSQC LT02 Phụ lục 3.6: Phổ HMBC LT02 Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dòng tế bào MCF-7 Hep G2 Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dịng tế bào Hela Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC * Hình ảnh nhóm thực hiện: Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dòng tế bào MCF-7 Hep G2 Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dòng tế bào Hela Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC * Hình ảnh nhóm thực hiện: Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dòng tế bào MCF-7 Hep G2 Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dịng tế bào Hela Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC * Hình ảnh nhóm thực hiện: ... tính cho thấy TL06 có dược tính độc tế bào ung thư với IC50 = 68,32 ± 1,69µg/mL 54,68 ± 2,36µg/mL, hai dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ung thư gan HepG2 Cịn TL02 có dược tính kháng tế bào ung thư. .. 1,69µg/mL dịng tế bào Hela Đây lần giới cô lập hai hợp chất lồi oleanolic acid, taraxerol thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 ung thư gan Hep G2 kháng tế bào ung thư dịng tế bào Hela từ... tế bào LT06 dòng tế bào ung thư Dòng tế bào Hela Nồng độ (µg/mL) 100 80 60 40 20 Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC * Hình ảnh nhóm thực hiện: Phụ lục 4: Phần trăm gây độc tế bào