TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT PROTEIN VÀ GEN HER2 BẰNG KỸ THUẬT HĨA MƠ MIỄN DỊCH (IHC) VÀ LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG (FISH) TRONG UNG THƯ DẠ DÀY Ngành : Công nghệ sinh học SVTH : BÙI THỊ NGỌC HIẾU Niên khóa : 2008 - 2012 TP HỒ CHÍ MINH, 2013 TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG -oOo - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT PROTEIN VÀ GEN HER2 BẰNG KỸ THUẬT HĨA MƠ MIỄN DỊCH (IHC) VÀ LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG (FISH) TRONG UNG THƯ DẠ DÀY Giảng viên hướng dẫn: ThS BS THÁI ANH TÚ Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ NGỌC HIẾU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01/2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Ứng Dụng Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất thầy cô truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập trường Thạc sĩ, Bác sĩ Thái Anh Tú hết lòng hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi trình nghiên cứu giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Công nghệ Sinh học Trần Thị Ngọc Mỹ, Cao Ngọc Tuyết Nga tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài Tập thể lớp 08SH1D động viên suốt thời gian qua Sinh viên thực Bùi Thị Ngọc Hiếu MỤC LỤC Danh mục ký hiệu chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vẽ vii Danh mục biểu đồ ix Tóm tắt x Chương 1: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Đặc điểm hình thái giải phẫu - sinh lý dày 2.2 Bệnh ung thư dày 2.3 Nguyên nhân bệnh ung thư dày 2.4 Giới thiệu prôtêin gen HER 2.4.1 Cấu trúc thụ thể HER 10 2.4.2 Các kết nối HER 10 2.4.3 Tác động ligand 11 2.4.4 Sự bắt cặp 12 2.4.5 Tác động thụ thể 14 2.4.6 Sự tạo thành prôtêin HER2 16 2.5 Phương pháp nhuộm HE (Hematoxylin-Eosin) 18 2.5.1 Nguyên tắc 18 2.5.2 Mục đích 19 2.6 Khảo sát prôtêin gen HER2 19 2.6.1 Khảo sát prơtêin gen HER2 hóa mơ miễn dịch (IHC) 19 2.6.2 Khảo sát prôtêin gen HER2 lai chỗ huỳnh quang (FISH) 22 2.7 Nghiên cứu điều trị ung thư dày với Trastuzumab 24 Chương 3: Vật liệu phương pháp 28 3.1 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 28 3.2 Vật liệu 28 3.2.1 Đối tượng 28 3.2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 29 3.2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 31 3.3 Phương pháp nghiên cứu 32 3.3.1 Phương pháp nhuộm HE 32 3.3.2 Phương pháp khảo sát prơtêin HER2 kỹ thuật hóa mơ miễn dịch 36 3.3.3 Phương pháp khảo sát gen HER2 kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang 38 Chương 4: Kết bàn luận 42 4.1 Kết phân loại mô học nhờ phương pháp nhuộm HE 42 4.2 Kết khảo sát prơtêin HER2 nhờ phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch (IHC) 43 4.3 Kết khảo sát gen HER2 kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang 48 4.4 Tương quan hóa mơ miễn dịch lai chỗ phát huỳnh quang 50 Chương 5: Kết luận kiến nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 54 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Các từ viết tắt tiếng Việt HMMD Hóa mơ miễn dịch KN Kháng nguyên KT Kháng thể LTC Lai chỗ STT Số thứ tự Các từ viết tắt tiếng Anh CDC Centers for Disease Control and Prevention EGFR Epithelial Growth Factor Receptor FDA Food and Drug Administration FISH Flourescent in situ hybridization HE Hematoxyline Eosin HER Human Epidermal Growth Factor Receptor IARC International Agency for Research on Cancer IHC Immunohistochemistry MAPK Mitogen-activated protein kinase OS Overall-Survival PI3K Phosphoinositide-3-kinase TMA Tissue Micro Array TNM Tumor-Node-Metastasis ToGA Trastuzumab for Gastric Cancer DANH MỤC CÁC BẢNG Số TT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Nguyên liệu dùng phương pháp nhuộm HE 29 Bảng 3.2 Nguyên liệu dùng khảo sát prôtêin HER2 30 Bảng 3.3 Nguyên liệu dùng khảo sát gen HER2 30 Bảng 3.4 Quy trình tiến hành hóa mơ miễn dịch 36 Bảng 3.5 Kết khảo sát prôtêin HER2 nhờ IHC 37 Bảng 3.6 Cách đánh giá khuếch đại gen HER2 FISH 41 Bảng 4.1 Phân bố kết mô học phương pháp nhuộm HE 42 Bảng 4.2 Kết khảo sát prơtêin HER2 hóa mơ miễn dịch 44 Bảng 4.3 Tương quan loại mô học với HMMD 47 Bảng 4.4 Kết khảo sát gen HER2 FISH 48 Bảng 4.5 Tương quan loại mô học với FISH 50 Bảng 4.6 Tương quan HMMD FISH 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số TT Tên hình Trang Hình 2.1 Cấu tạo dày Hình 2.2 Dạ dày bình thường dày bị ung thư Hình 2.3 Phân bố ung thư dày theo vị trí Hình 2.4 Vi khuẩn Helicobacter pylori Hình 2.5 Cơ chế sinh ung xoắn khuẩn H.pylori Hình 2.6 Cấu trúc miền HER 10 Hình 2.7 Cấu trúc thụ thể HER 11 Hình 2.8 Các cặp đơi HER 13 Hình 2.9 Các đường truyền tín hiệu miền tyrosine kinase 15 Hình 2.10 Biểu độ HER2 tế bào ung thư 16 Hình 2.11 Nhiễm sắc thể 17 17 Hình 2.12 Cơ chế hematoxylin oxi hóa tạo thành hematein 18 Hình 2.13 Các kỹ thuật hóa mơ miễn dịch 20 Hình 2.14 Sản phẩm Trastuzumab 25 Hình 2.15 Cơ chế tác dụng Trastuzumab 25 Hình 2.16 Trastuzumab giúp kéo dài thời gian sống toàn lên 16 27 tháng bệnh nhân ung thư dày di có HER2 dương tính Hình 3.1 A Đúc khối nến TMA; B Khối nến TMA; C Lam kính TMA nhuộm HE; D Quan sát kính hiển vi quang học mẫu mơ lam kính TMA 28 Số TT Tên hình Trang Hình 3.2 Sơ đồ tiến hành nhuộm HE 32 Hình 3.3 Mẫu mơ đúc nến cassette 33 Hình 3.4 Kết mẫu mơ sau nhuộm HE 35 Hình 3.5 B Kiểu ruột, C Kiểu lan tỏa 35 Hình 3.6 Sơ đồ tiến hành lai chỗ phát huỳnh quang 38 Hình 3.7 Kết FISH âm tính 41 Hình 3.8 Kết FISH dương tính 41 Hình 4.1 Biểu khác biệt HER2 ung thư vú ung thư dày 45 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Số TT Tên biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1 Biểu đồ phân bố mô học phương pháp nhuộm HE 42 Biểu đồ 4.2 Biểu đồ khảo sát prơtêin HER2 nhờ hóa mơ miễn dịch 44 Biểu đồ 4.3 Tương quan loại mô học với hóa mơ miễn dịch (IHC) 47 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ khảo sát gen HER2 FISH 49 Biểu đồ 4.5 Tương quan loại mô học với FISH 50 Biểu đồ 4.6 Tương quan kết HMMD FISH (tỉ lệ 51 HER2/CEP 17) Phân bố xét nghiệm HER2 qua kỹ thuật FISH ung thư dày 12% FISH FISH + 88% Biểu đồ 4.4 Biểu đồ khảo sát gen HER2 FISH Tiêu chuẩn đánh giá HER2 FISH ung thư dày không khác biệt nhiều so với ung thư vú, đếm tín hiệu (HER2 CEP-17) 20 nhân tế bào bướu rời Trong kết ghi nhận FISH số trường hợp có khuyếch đại gen HER2 12% Nghiên cứu phân tích từ số liệu nhiều tác giả (tỉ lệ 743%) cho tỉ lệ chung 19,2% [12] Từ thực tế đánh giá HER2 FISH ung thư vú, áp dụng ung thư dày có số khác biệt như, (1) ung thư dày đa dạng cấu trúc, xếp hình thức xâm nhiễm, (2) nhân tế bào nằm kề sát nhau, nhiều chồng chất, khó đếm tín hiệu (3) kích thước nhân tế bào nhỏ (so với nhân tế bào ung thư vú), đặc biệt dạng lan tỏa, nhân tế bào nhỏ, xâm nhiễm xen lẫn nhân tế bào mô đệm Kết tương quan loại mô học với FISH trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Tương quan loại mô học với FISH Loại mô học FISH 2n(%) Âm tính Dương tính Dạng ruột 34(71%) 14(29%) Lan tỏa 57(100%) 0(0%) Khác 57(90%) 6(10%) p< 0,0001 Mô học dạng ruột có 29% FISH dương tính Trong dạng mô lan tỏa không ghi nhận trường hợp FISH dương tính khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.0001) Phân bố mô học ung thư dày HER2FISH âm tính Phân bố mơ học ung thư dày HER2FISH dương tính 23% 30% 39% 0% 70% 38% Biểu đồ 4.5 Tương quan loại mô học với FISH 4.4 Tương quan hóa mơ miễn dịch lai chỗ phát huỳnh quang Kết đánh giá tương quan kết hóa mô miễn dịch FISH bảng 4.6 Bảng 4.6 Tương quan HMMD FISH Tương quan HMMD HMMD FISH FISH 1+ 2+ 92 (100%) 32(94%) 22(79%) Âm tính Dương tính 2(6%) 6(21%) 3+ 2(14%) 12(86%) p< 0,0001 Tương quan HMMD FISH mẫu TMA: - HMMD (0) cho 100% FISH âm tính - HMMD (1+) cho 6% FISH dương tính - HMMD (2+) cho 21% FISH dương tính - HMMD (3+) cho 86% FISH dương tính Tương hợp HMMD âm tính (0/1+) HMMD dương tính (3+) với FISH (-) FISH (+), tỉ lệ tương hợp 97% Mối tương quan có ý nghĩa thống kê với p