T ng quan v MRSA

c đi m vi th và đ c tính chi Staphylococcus

S aureus l n đ u tiên đ c phân l p t m ng i vào n m 1880 b i Scotland Alexander Ogston [18] Chi Staphylococcus có h n 40 loài khác nhau, trong đó có 3 loài t c u gây b nh đ c chú ý trong y h c: S aureus (T c u vàng), S epidermidis (T c u da), và S saprophyticus S aureus là nh ng vi khu n hình c u, không di đ ng, gram d ng, đ ng kớnh 0,5-1,5 àm, t bào x p thành hỡnh chựm nho S aureus là nh ng vi khu n hi u khớ hay k khí không b t bu c, có th phát tri n trong môi tr ng không có oxi nh enzyme catalase ho c s d ng m t ch t nh n đi n t Ngoài ra, chúng còn cho ph n ng DNase, phosphatase d ng tính, có kh n ng lên men và sinh acid t manitol, trehalose, sucrose

Staphylococcus aureus là một loại vi khuẩn gây hại, thường tấn công vào những người có sức đề kháng yếu Vi khuẩn này thường ký sinh trên mũi, họng và da của con người, cũng như trên các động vật.

C ch kháng thu c c a MRSA

Trong Chiến tranh thế giới thứ hai, penicillin được đưa vào sử dụng lâm sàng, nhưng chỉ sau vài năm, đã phát hiện ra các chủng S aureus kháng penicillin Hiện nay, tỷ lệ S aureus kháng penicillin (PRSA) chiếm khoảng 90%, trong khi tỷ lệ MRSA dao động từ 30-50% trong tổng số các chủng S aureus được phân lập.

Methicillin là một loại penicillin bán tổng hợp, và MRSA kháng methicillin chủ yếu thông qua hai cơ chế kháng phổ biến: một là siêu enzyme β-lactamases, hai là sự thay đổi cấu trúc của các protein gắn với penicillin (PBPs) Biểu hiện enzyme β-lactamase được kiểm soát bởi operon bla, trong đó blaZ là vùng gen mã hóa cho β-lactamase, và hai protein điều hòa là blaI (nhân tố ức chế) và blaR1 (nhân tố hoạt hóa) BlaI ức chế biểu hiện của blaZ thông qua việc gắn với promoter BlaR1 là protein xuyên màng; khi vùng bên ngoài tế bào gắn với β-lactam, vùng bên trong tế bào sẽ được giải phóng và phân giải BlaI, cho phép biểu hiện blaZ Cơ chế kháng này làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn trước các loại kháng sinh.

Protein PBP2a được mã hóa bởi gen mecA nằm trên vùng Operon mec, với hai nhân điều hòa là mecI và mecR1 MecI là nhân điều chỉnh chính, trong khi mecR1 hoạt động như một nhân điều hòa xuyên màng Cả mecI và mecR1 có mối liên hệ với blaI và blaR1, cho phép điều chỉnh phản ứng với -lactam Vùng mecR1 bên trong tế bào giải phóng mecI, từ đó cho phép phiên mã mecA Sự hiện diện của protein PBP2a là chỉ dấu cuối cùng trong việc xác định các chủng lâm sàng.

A Khu n l c màu vàng C a Staphylococcus aureus trên môi tr ng th ch Trypton Soy (Http://www.Bacteriainphotos.Com/S.Html)

B Staphylococcus aureus d i kính hi n vi đi n t (Centers For Disease Control And Prevention)

S aureus có 4 ti n ch t PBPs thông th ng trên màng t bào ch t tham gia vào quá trình liên k t chéo peptidoglycan c a vách t bào Nh ng PBPs này có ho t đ ng t ng t v i serine c a protease và có ái l c cao v i nh ng ch t -lactam Khi x y ra vi c g n, nh ng PBPs không có ch c n ng hình thành ph c h p vách t bào, d n đ n vi khu n ch t PBP2a là protein có tr ng l ng phân t 76kDa, đ c bi u hi n trong các ch ng MRSA PBP2a có ái l c th p v i nhóm kháng sinh -lactam Nên dù có s hi n di n c a kháng sinh, PBP2a v n có ch c n ng sinh t ng h p vách nh PBPs thông th ng, b ng cách này t bào s tránh đ c s ly gi i PBP2a đ c bi u hi n t gene mecA không hi n di n trong các ch ng S.aureus nh y kháng sinh [22].

c đi m sinh lý c a MRSA

Nhu c u dinh d ng cho s phát tri n c a S aureus thay đ i tùy thu c vào t ng dòng

S aureus có kh n ng phát tri n trong kho ng nhi t đ r t r ng, t 7 ºC - 48ºC, nhi t đ sinh tr ng t i u là 30 ºC - 34 ºC; pH 4,2 - 9,3, pH t i u là 7,0 - 7,5; và phát tri n t t

Trong môi trường chứa NaCl 15%, S aureus có khả năng phát triển từ 33% đến 60% Trong môi trường thích hợp như thạch máu, S aureus có khả năng làm tan huyết Sau 5-6 giờ trong môi trường TSB, S aureus sinh sản, và sau 24 giờ, có thể quan sát được sự phát triển bằng mắt thường Tế bào tạo thành vòng nhẫn bám vào môi trường, với khuẩn lạc có hình tròn, bề mặt láng, đặc mịn và có màu vàng hoặc trong suốt.

MRSA có nhiều cách khác nhau để thoát khỏi hệ miễn dịch của con người, bao gồm khả năng sống sót bên trong bạch cầu trung tính và việc tạo ra protein Map có khả năng trốn tránh sự tấn công của tế bào lympho T S aureus tiết ra một loại protein gọi là -fb (extracellular fibrinogen binding protein), có kích thước khoảng 19 kDa, có khả năng bám vào thành phần C3b, một yếu tố quan trọng trong quá trình hoạt hóa bổ sung Sự liên kết này giúp C3b bám lên các tế bào nhiễm MRSA, từ đó ngăn chặn sự hoạt hóa bổ sung theo con đường cổ điển và con đường nhánh, do đó làm giảm quá trình thực bào nhờ cơ chế opsonin hóa.

T ng quan m t s kháng sinh

Nhóm Glycopeptide

a) Vancomycin: là thu c u tiên hàng đ u trong đi u tr các b nh nhi m khu n có liên quan đ n MRSA

Hình 1 2 C u trúc kháng sinh vancomycin và ph c h p hình thành v i L-

Lysin-D-Ala-D-ala là ti n ch t t ng h p vách

Vancomycin có ái lực cao với D-ala-D-ala, thành phần chính của pentapeptide trong vách tế bào của MRSA, giúp ngăn chặn quá trình tổng hợp vách tế bào Một đặc điểm quan trọng của vancomycin là nó không có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, do đó, thuốc chỉ tác động vào mục tiêu sau khi đã được tích lũy bên trong tế bào.

MRSA kháng vancomycin do có s hi n di n c a operon ch a mRNA d ch mã cho enzyme t ng h p nh ng ti n ch t có ái l c th p v i vancomycin c bi t, đ u C c a

D-ala-D-ala đ c thay th b ng D-lactate ho c D-Serine do đó làm thay đ i v trí g n c a vancomycin, d n đ n phá hu ái l c cao c a ti n ch t v i vancomycin, cu i cùng xoá b đích thu c [27] b) Telavancin Telavancin là kháng sinh bán t ng h p t vancomycin, thu c nhóm lipoglycopeptide

C ch tác đ ng gi ng vancomycin, nh ng thêm kh n ng phá h y ch c n ng v n chuy n c a màng t bào, làm kh s phân c c c a màng [28] c) Teicoplanin

Teicoplanin là một glycopeptide hoạt động tương tự như vancomycin, được sử dụng để điều trị viêm phổi liên quan đến MRSA Liều lượng của Teicoplanin trong điều trị viêm phổi do MRSA vẫn chưa được xác định rõ, và chưa có bằng chứng lâm sàng chắc chắn cho thấy teicoplanin hiệu quả hơn hoặc kém hơn vancomycin trong điều trị viêm phổi MRSA.

Nhóm Oxazolidinone

Linezolid là một kháng sinh thuộc nhóm oxazolidinone, được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là trong các trường hợp kháng MRSA Kháng sinh này hoạt động bằng cách ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, không giống như các loại kháng sinh khác, và có tác dụng kéo dài trong quá trình này Linezolid liên kết với tiểu phần 23S của ribosome 50S, tại trung tâm hoạt động của enzyme peptidyl transferase, tương tự như vị trí của chloramphenicol Kháng sinh này được sản xuất dưới dạng sẵn có cho việc điều trị.

Vi khuẩn gram dương, đặc biệt là Staphylococci và Streptococci, có thể phát triển khả năng kháng linezolid thông qua đột biến G2576T, trong đó guanine được thay thế bằng thymine tại vị trí 2576 của vùng gen phiên mã 23S ribosomal RNA Linezolid có tác dụng mạnh mẽ đối với vi khuẩn gram dương và thường được sử dụng như liệu pháp đầu tiên trong điều trị nhiễm trùng do MRSA, đặc biệt ở bệnh nhân lớn tuổi trên 65 Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc này có nguy cơ cao dẫn đến kháng thuốc.

Cephalosporin

Ceftaroline và ceftobiprole là hai kháng sinh có khả năng chống lại MRSA in vitro, với ái lực cao đối với protein gắn penicillin (PBP2a) FDA đã phê duyệt ceftaroline để điều trị viêm phổi cộng đồng, nhiễm trùng da và mô mềm do S aureus Mặc dù thuốc này có bằng chứng lâm sàng hỗ trợ, nhưng đã ghi nhận sự kháng thuốc trong các nghiên cứu.

Cao chi t/phân đo n/tinh ch t kháng MRSA

Tóm l c các nghiên c u

Kháng sinh là m t nhóm thu c đ c bi t vì vi c s d ng kháng sinh không ch nh h ng đ n ng i b nh mà còn nh h ng đ n c ng đ ng V i nh ng n c đang phát tri n nh

Việt Nam là một quốc gia có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu bệnh lý nhiễm khuẩn, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn kháng thuốc gây ra Vancomycin, một loại kháng sinh cuối cùng, được sử dụng để điều trị các nhiễm trùng do S aureus kháng thuốc Tuy nhiên, MRSA kháng vancomycin đã được báo cáo lần đầu vào năm 2002 tại Hoa Kỳ Hiện nay, tình trạng S aureus kháng vancomycin cũng đã xuất hiện tại Việt Nam, gây ra những lo ngại về khả năng kiểm soát dịch bệnh.

Sự phát tán của các chủng kháng thuốc đang gia tăng, đòi hỏi không chỉ việc sử dụng kháng sinh hợp lý mà còn cần tìm kiếm các hoạt chất kháng khuẩn mới Các sản phẩm chiết xuất từ thiên nhiên đã được chứng minh có tiềm năng trong hoạt tính kháng khuẩn, mặc dù hoạt tính này thường thấp hơn so với kháng sinh truyền thống Tuy nhiên, các sản phẩm chiết xuất vẫn có khả năng kết hợp hiệu quả với kháng sinh, mở ra hướng đi mới trong việc chống lại sự kháng thuốc.

Vì v y, t ng quan các nhóm ho t ch t th c v t kháng MRSA v i giá tr MIC/MBC đã đ c tóm t t trong B ng 1.1

B ng 1 1 Cao chi t th c v t kháng MRSA ThƠnh ph n hóa h c MIC/MBC Th c v t Trích d n

Tannin 300 mg/mL Caryophyllus aromaticus,

Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry [37] Alkaloid

Alkaloid 16 g/mL Glycosmis cochinchinensis [39] Acid h u c , glycoside 2 mg/mL Artemisia princeps [40]

Polyphenol 12,5 mg/mL Matricaria pubescens [41]

Quinone, tannin 1 mg/mL Rhamnus californica [43]

D n xu t phenol 2 - 64 mg/L Plumula nelumbinis [44] Saponin và alkaloid chi m t l cao, tannin, flavonoid, glycoside, phenol và resin m c trung bình

Phenolic, alkaloid và saponin 31,25 - 250 mg/L Commiphora molmol Engl ex

Phenolic 3,5 mg/mL Walidda antidysenterica [46]

Phenolic và flavonoid alkaloid, saponin

Tannin, saponin, sterol/steroid và glycoside

Alkaloid, tannin, saponin, steroid, glycoside and flavonoid

Tannin, alkaloid flavonoid, saponin, steroid, đ ng và terpenoid

Chrysophyllum albidum có hoạt tính kháng MRSA, được nghiên cứu thông qua các hoạt chất chiết xuất từ thực vật Nồng độ hoạt chất từ 0,63 đến 10 mg/mL cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn này Các kết quả nghiên cứu được tóm tắt trong Bảng 1.2, cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế kháng và tiềm năng ứng dụng trong y học.

MRSA c a cao chi t/tinh ch t chi t t d c li u Các tinh ch t t th c v t có ho t tính kháng khu n thu c các nhóm khác nhau nh polyphenol, alkaloid, flavonoid, triterpenoid, anthraquinone, polyol

Nhiều chất kháng khuẩn khác nhau có khả năng ức chế vách tế bào, bao gồm các hợp chất như magnolol và epigallocatechin gallate thuộc nhóm polyphenol Ngoài ra, nhóm phá vỡ cấu trúc màng tế bào gồm acid nordihydroguaiaretic, oxyresveratrol (ORV), isobavachalcone, bakuchiol thuộc nhóm flavonoid, cùng với sanguinarine thuộc nhóm alkaloid Chất kháng MRSA còn liên quan đến các kênh bơm như reserpine, quinine, harmaline và piperine.

M t h ng đang đ c nghiên c u hi n nay là nhóm h p ch t th c v t t đ a y và t o c ng cho th y ti m n ng kháng khu n nh fucoidan t t o bi n, acid usnic, acid vulpinic t đ a y

Các tinh ch t tách chi t t th c v t có ho t tính kháng MRSA, nh ngho t tính th ng

Nghiên cứu cho thấy hydroxydihydrosanguinarine (hhS) có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn vancomycin, với MIC là 1,95 mg/L so với 2,34 mg/L của vancomycin Ngoài ra, azadirachtin (AZA) có MIC là 2,5 mg/L và cũng có khả năng ức chế sự hình thành biofilm.

B ng 1 2 Ho tch tth c v t kháng MRSA

Ho t ch t th c v t MIC/MBC Tên th c v t ích tác đ ng Trích d n

Magnolol (magnolol và honokiol h p l c oxacillin)

Magnolia officinalis Thành ph n t ng h p vách t bào

Phân đo n ch a acid Ellagic

Rubus ulmifolius c ch s hình thành màng sinh h c

Protein trên màng c a h th ng v n chuy n ABC

4 mg/L h p l c v i amino- glycosides lá cây Larrea Tridentata ích tác đ ng là màng t bào

125 mg/L Morus alba T ng tính th m c a màng t bào, c ch ATPase c ch s hình thành biofilm và phá h y biofilm đã hình thành

25 mg/L EGCg + kháng sinh beta- lactam

Kh c c màng t bào, c ch s hình thành biofilm

12 bakuisoflavone [63] bakuflavanone (2), 2 h p ch t m i. isobavachalcone (10) bakuchiol (12),

T ng tác v i các thành ph n c a màng t bào.

Scutellaria baicalensis Georgi c ch ho t đ ng c a enzyme pyruvate kinase (PK)

Màng t bào ch t, có s gi i phóng enzyme phân h y vách g n trên màng

Reserpine (phytoalkaloid) quinine, harmaline và piperine

50 mg/L Quinine trong v cây canh kin a

Nhân t c ch b m kháng thu c trên ch ng MRSA

Acid ursolic 64 mg/L Alstonia scholaris

Có tác d ng b o v t bào gan c ch s hình thành biofilms MRSA thông c ch quá trình trao đ i ch t aminoacid và bi u hi n dính ch t

Linoleic và acid oleic 32/64 mg/L

AZA (azadirachtin) 2,5 mg/L Azadirachta indica A

Juss c ch s hình thành biofilm

T o bi n Ch a xác đ nh đích thu c trên ch ng MRSA

Các nghiên cứu về hoạt tính kháng MRSA từ cao chiết thực vật vẫn còn hạn chế Cao chiết ethylacetate từ lá cây ổi (Psidium guajava L.) cho giá trị MIC là 1,5625 mg/mL Nghiên cứu của Thành và cộng sự xác định cao phân đoạn chloroform từ cây Blepharis maderspatensis (L.) Roth có giá trị MIC là 25 mg/mL, trong khi cao ethylacetate có giá trị MIC là 125 mg/mL Công Luân và cộng sự cũng đã khảo sát cây Phaeanthus vietnamensis Ban, phát hiện cao alkaloid toàn phần có hoạt tính với giá trị MIC 0,1953 mg/mL, cao chloroform và n-butanol đều có giá trị MIC 3,125 mg/mL Nghiên cứu của Trần Thành cho thấy berberin có tác dụng hiệp đồng với các kháng sinh -lactam như ampicillin, oxacillin và cefuroxim, với giá trị MIC của berberin trên MRSA là 128 µg/mL Berberin có tác dụng hiệp lực với ampicillin (FIC = 0,375), oxacillin (FIC = 0,5) và cefuroxim (FIC = 0,313), nhưng không có tác dụng hiệp đồng với cephalosporin thế hệ 3.

Nghiên cứu năm 2019 đã xác định được kháng ngừa phối hợp giữa acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran và một số kháng sinh như ampicillin, cefuroxim, ciprofloxacin, gentamicin và vancomycin Kết quả cho thấy kháng ngừa phối hợp hiệu quả nhất là giữa acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran và kháng sinh gentamicin, với chỉ số FICI là 0,375 và giá trị MIC tương ứng.

Nghiên cứu về hoạt tính kháng MRSA trong nước tiểu cho thấy không có sự tương tác nào hợp lệ giữa gentamicin và vancomycin Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào hoạt chất kháng khuẩn, trong khi thông tin về sự tương tác với các kháng sinh khác đối với MRSA vẫn còn hạn chế Hoạt tính hợp lệ của vancomycin đã được xác định trong một nghiên cứu của Phạm Ngọc Tuấn Anh và cộng sự.

(2019) v n ch a có k t qu , các d n xu t acid carboxylic c a 2-salicyloylbenzofuran ch h p l c v i gentamicin [87].

Các đích tác đ ng c a cao chi t/tinh ch t

T cao chi t đ n tinh ch t, các đích tác đ ng c a nhóm h p ch t trên ch ng MRSA đ c quan tâm bao g m a) Màng sinh h c

Màng sinh học là tập hợp các vi sinh vật liên kết chặt chẽ với nhau trên bề mặt vật chất, được bao bọc bởi lớp màng ngoài có thành phần chính là polysaccharide, protein và DNA Trong màng sinh học, tồn tại một số lượng lớn các loài vi khuẩn khác nhau.

Cấu trúc của màng sinh học hoàn chỉnh có tính phân lập và không đồng nhất, trong đó vùng lõi chứa các tế bào vi khuẩn chuyển sang trạng thái tiềm, không hoạt động (persister), chỉ chiếm khoảng 1% trong tổng số vi khuẩn cấu thành lớp màng sinh học Trong nhiều bệnh nhiễm trùng mạn tính, sự hình thành màng sinh học khiến vi khuẩn rất khó bị tiêu diệt bởi kháng sinh, bởi vì khi ngừng dùng thuốc, vi khuẩn trong trạng thái không hoạt động trong màng sinh học hồi phục và gây nhiễm trùng trở lại Do đặc tính polysaccharide bao bọc, vi khuẩn có khả năng bám dính, tồn tại lâu dài trên bề mặt, đồng thời kháng lại hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh.

S aureus giai đo n hình thành màng sinh h c thì các t bào vi khu n trong màng sinh h c bao g m nh ng vi khu n d ng t nh gi m nh y v i kháng sinh, trong đó có vancomycin, vi c phá h y t bào tr nên khó kh n h n [93] N u màng sinh h c đ c hình thành thì kh n ng kháng thu c kháng sinh t ngđ n 1000 l n [94] H n n a, đích tác đ ng này ch có t bào Prokaryote Chính vì v y, các h p ch t c ch s hình thành

15 màng sinh h c r t đáng đ c l u tâm đ i v i các m m b nh khó đi u tr nh MRSA

Pinostrobin được tìm thấy trong lá cây Trứng cá (Muntingia calabura) và có khả năng kháng khuẩn đáng kể Nồng độ pinostrobin từ 2-16 µg/ml có khả năng ức chế 60% sinh khối màng sinh học, trong khi nồng độ pinostrobin cao hơn 32 µg/ml có thể ức chế tới 80% sinh khối màng sinh học Hơn nữa, pinostrobin còn làm tăng tính thấm của màng trong thí nghiệm với propidium iodide (PI).

Gallic acid và các hợp chất quinolines halogen hóa có khả năng kháng khuẩn, đặc biệt đối với MRSA Nghiên cứu cho thấy, màng sinh học của MRSA bị phá hủy nhờ vào các liệu pháp kết hợp này Sự kết hợp của 5-iodoindole với các kháng sinh thông thường giúp ngăn chặn sự hình thành và phá hủy màng sinh học Ngoài ra, hệ thống tín hiệu Quorum sensing cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.

Hệ thống quorum sensing (QS) là một mục tiêu tác động tiềm năng trong việc hình thành màng sinh học, vì phân tử của QS được giải phóng giúp hình thành khuẩn lạc vi sinh và biểu hiện nhiều gene điều khiển sự trưởng thành của màng sinh học Do đó, hệ thống QS là cần thiết cho sự hình thành màng sinh học Trong màng sinh học, vi khuẩn có đặc điểm biểu hiện tính kháng kháng sinh Nhóm tác giả Amelia Muhs và cộng sự đã sử dụng các loài thực vật bản địa trong điều trị làm lành vết thương và các bệnh nhiễm khuẩn, nghiên cứu sử dụng cao chiết từ loài Schinus terebinthifolia (Brazilian Peppertree) như là nguồn chất chiết đặc tính Nhóm tác giả đã báo cáo hoạt tính của chất phân đoạn cao chiết giàu flavone 430D-F5 cho hoạt tính ức chế các gene điều hòa trên chủng S aureus.

Các nhân t c ch h th ng QS có th nh h ng đ n đ c t , gi m kh n ng hình thành màng sinh h c và t ng kh n ng nh y v i li u pháp thu c trên ch ng MRSA

Vì v y các nhân t c ch QS có th h u d ng là các ch t tr nên nó không c n có ho t tính c ch vi khu n hay di t khu n [103] c) Kênh b m thu c

MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) là một loại vi khuẩn kháng thuốc, có khả năng tồn tại bên ngoài tế bào Pinostrobin, một hợp chất có thể được tìm thấy trong nhiều nguồn thực vật khác nhau, đã được nhóm nghiên cứu của Lowrence Rene Christena tách chiết từ một loài ong Nghiên cứu này đã xác định hoạt tính ức chế và khả năng kháng sinh của pinostrobin trong việc hình thành màng sinh học.

Kênh NorA là một yếu tố quan trọng trong việc kháng thuốc của vi khuẩn S aureus Nhiều nhân tố kích hoạt kênh này không được sử dụng do liên quan đến độc tính của chúng Chẳng hạn, reserpine là một nhân tố kích hoạt kênh NorA nhưng lại gây ra sự thoái hóa thần kinh Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu về các nhân tố kích hoạt NorA để tìm ra những biện pháp làm giảm độc tính.

Nh ng nhân t c ch b m không có tính đ c th ng có th dùng nh nh ng ch t tr v i kháng sinh đ tái nh y trên ch ng MRSA

Pinostrobin có khả năng tăng cường hiệu quả của ciprofloxacin chống lại vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là trên MRSA, bằng cách giảm đáng kể MIC của ciprofloxacin Hoạt chất này tác động lên các kênh natri trong não người và có thể ảnh hưởng đến các bơm kháng thuốc khác như NorB, NorC và MdeA, thay vì chỉ bơm NorA của S aureus Kết quả này cho thấy pinostrobin có tiềm năng trở thành một phương pháp điều trị mới, mở ra hướng đi mới trong việc đối phó với vi khuẩn kháng thuốc.

S aureus có kh n ng phá h y t bào h ng c u b ng cách ti t ra các đ c t

Hemolysis là đặc trưng của S aureus, với các loại hemolysin (alpha, beta, gamma, delta) có khả năng gây tan máu Trong đó, beta-hemolysin là một trong những exotoxin được sản xuất bởi S aureus, có tác dụng khác nhau lên các tế bào miễn dịch Beta-hemolysin có khả năng thoái hóa sphingomyelin, gây ngộ độc cho nhiều tế bào khác nhau.

Acid teichoic c a vách t bào (WTA) là m t đích tác đ ng ti m n ng b i vì WTA liên

WTA (acid teichoic) có vai trò quan trọng trong cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn gram dương, đặc biệt là trong quá trình phân chia tế bào và kháng lại kháng sinh Cấu trúc WTA đa dạng giữa các loài vi khuẩn, và sự tương tác giữa WTA và peptidoglycan tạo ra các bước quan trọng trong quá trình tổng hợp WTA không chỉ hỗ trợ trong việc duy trì cấu trúc vách tế bào mà còn góp phần vào khả năng kháng lại các hợp chất kháng sinh, đặc biệt là nhóm -lactam ở Staphylococcus aureus Khi MRSA tái nhiễm với kháng sinh -lactam, nguyên nhân có thể xuất phát từ cơ chế tổng hợp WTA.

Hình 1 3 Con đ ng t ng h p vách t bào c a Staphylococcus aureus [111]

Vi c c ch TagO và kênh v n chuy n WTA TagGH s d n đ n kh n ng MRSA tái nh y v i kháng sinh -lactam [110, 112, 113]

Nhân t c ch WTA c ng có th khóa s xâm nh p c a MRSA vào t bào ch Zhao và c ng s đã ch ng minh kh n ng h p l c gi a ‐GCg và thu c kháng sinh nhóm

Lactam gắn kết với một vị trí peptidoglycan trên vách tế bào Nghiên cứu sử dụng phương pháp bàn c và RT-PCR để xác định sự biểu hiện của gen mecA, cùng với thử nghiệm Latex agglutination trên protein PBP2' Kết quả cho thấy

MRSA đã phát triển khả năng kháng lại các kháng sinh nhóm β-lactam như benzylpenicillin, oxacillin, methicillin, ampicillin và cephalexin, đặc biệt khi kết hợp với ‐GCg Nghiên cứu cho thấy ‐GCg có khả năng làm giảm sức đề kháng của MRSA và MSSA, đồng thời tăng cường hiệu quả chống lại vi khuẩn này thông qua tác động lên vách tế bào.

Nh v y, khi MRSA tái nh y v i kháng sinh nhóm -lactam thì vách t bào là đích tác đ ng và quá trình t ng h p WTA b c ch

T ng quan m t s d c li u thu hái t i Bình D ng

Ngành Ng nh Nam

H : H M ng C t (Clusiaceae) Chi: Lành Ng nh (Cratoxylum)

Chi phân b ông Nam Á bao gồm các loài thực vật thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian ở nhiều quốc gia Châu Á như Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam.

Cratoxylum cochinchinensis, còn được gọi là Ngành Ngành Nam hay Lành Ngành Nam B, là cây gỗ cao từ 10 đến 15 mét, có gai và phân bố rộng rãi Lá của cây có hình dạng xoan ngược, đầu nhọn, màu xanh, nâu vàng, với cuống dài từ 2 đến 5 mm Hoa thường mọc thành cụm từ 1 đến 4 bông, không lông, có cuống dài bằng cuống lá; cánh hoa hợp thành, dài khoảng 9 mm, không có lông tơ Quả nang dài bằng hai đài, khoảng 12 mm, có cánh và thường có màu nâu, đỏ, tím Nhánh cây có vỏ nhẵn, màu nâu, phân nhánh, và thường mọc ở vùng đất trống Nhiều tài liệu nghiên cứu đã chỉ ra rằng các bộ phận của cây Cratoxylum có nhiều công dụng truyền thống trong điều trị các bệnh như đau dạ dày, sốt, ho, lở loét, tiêu chảy, chảy máu trong, và ngứa.

Cratoxylum chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như flavonoid, xanthone, benzophenone, terpenoid, quinone, sterol và các hợp chất phenolic khác Các loài thảo dược thuộc chi Cratoxylum nổi bật với hoạt tính dược lý như chống viêm, kháng khuẩn, kháng oxy hóa và ức chế enzyme glucosidase Mặc dù Cratoxylum spp đã được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống, nhưng một số loài cần được nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính dược và thành phần hóa học của chúng.

Nghiên cứu của Rattanaburi (2007) đã chỉ ra rằng các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ cành non, qu, và rễ cây Ngành Ng nh Nam có khả năng kháng S.aureus ATCC 25923 và MRSA SK1 Cụ thể, chiết xuất acetone từ cành non đạt MIC cao nhất là 80 µg/ml, trong khi chiết xuất chloroform từ cành non có giá trị MIC là 160 µg/ml đối với S.aureus ATCC 25923 và 80 µg/ml đối với MRSA SK1.

Nguy n Ng c Chí và Nguy n Di u Liên Hoa (2016) đã phân l p đ c m t triterpenoid là (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3 -ol và b n xanthon là cochinchinon A, cratoxylumxanthon B, 9-hydroxycalabaxanthon và 1,5-dihydroxy-13-methyl-13- (4-

20 methylpent-3-enyl)-2H-pyrano[2,3-c]xanthen-9-on, t cao hexan c a v cây Thành

Ng nh Nam (Cratoxylum cochinchinense) C u trúc c a các h p ch t này đ c xác đ nh d a vào ph NMR [117]

Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ các loài thực vật thuộc Ngành Ngành có giá trị hơn 1 mg/mL, cho thấy tiềm năng trong nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn Tuy nhiên, vẫn còn thiếu các nghiên cứu trên chủng kháng kháng sinh như MRSA, cũng như các cơ chế kháng khuẩn cần được chứng minh trong ngành.

X ng Mã

X ng Mã, hay còn gọi là X ng Mã Ch, S ng Mã, có tên khoa học là Carallia brachiata, là một loại cây có chiều cao lên đến 33 m và đường kính 210 cm Cây thường được tìm thấy trong các đầm lầy rừng, từ Madagascar đến Úc, bao gồm cả Trung Quốc Thân cây có màu nâu và xám, trong khi phần bên trong có màu vàng nâu Hoa của cây có chiều dài khoảng 4 mm, với hoa ngoài dài 1 cm Quả của cây có hình tròn, màu đen và dài 4 mm Tại Campuchia, Lào và Việt Nam, cây được sử dụng trong y học cổ truyền Ở Malaysia, lá cây được pha trà và còn được dùng để điều trị nhiễm trùng máu.

Cây đ c bi t v dãy các h p ch t megastigman nh 3-hydroxy-5,6-epoxy- -ionol-3- O- -apiofuranosyl-(1 6)- -glucopyranoside, flavonoid, hygroline, và tannin [118]

Hình 1 5 Hoa, lá và toàn cơy X ng Mư

Các cao chi t, phân đo n và tinh ch t đ c tách chi t t X ng Mã đã đ c nghiên c u với các ho t tính sinh h c quan trọng Những ho t tính này bao gồm ch ng oxi hóa, ch ng viêm và khả năng làm lành v t th ng Vì vậy, việc nghiên c u ho t tính kháng khu n kháng kháng sinh và đích tác đ ng là rất c n thi t.

Trâm Tròn

Chi Trâm là một chi thực vật với hơn 1.200 loài phân bố rộng rãi trên toàn cầu Tại Việt Nam, chi Trâm được xác định có khoảng 50 loài, nhiều trong số đó là những dược liệu quý giá với giá trị điều trị cao, đặc biệt trong các lĩnh vực như bệnh nhịp tim, sốt, ung thư và tiểu đường Đặc biệt, hoạt tính kháng khuẩn của các loài thuộc chi Trâm đã được nghiên cứu và chú ý nhiều.

H : Myrtaceae Chi: Chi Trâm (Syzygium) Tên khoa h c: Syzygium glomerulatum G

Carotenoids, flavonoids, sterols, phenolics, anthocyanins, and terpenes are the main phytochemical components found in the leaves, fruits, seeds, and bark of the Jamun tree (Syzygium cumini) Notable bioactive compounds in S cumini include gallic acid, ellagic acid, oxalic acid, betulinic acid, myricetin, kaempferol, malic acid, oleanolic acid, malvidin, delphinidin, petunidin, quercetin, caffeic acid, and various anthocyanins such as delphinidin-3,5-O-diglucoside, petunidin-3,5-O-diglucoside, and malvidin-3,5-O-diglucoside.

Pinostrobin c ng đ c tìm th y trong cây Syzygium samarangense thu c chi Trâm

Nh ng hàm l ng pinostrobin cao nh t thu nh n đ c b ng 12 mg trong 1g b t lá khô Eucalyptus nitida thu c chi B ch àn ( Eucalyptus ) cùng h v i chi Trâm

The chemical constituents with biological activity found in the aquatic plant S polyanthum include quercetin, quercitrine, mirsetin, miritrine, carbohydrates, essential oils, lactones, tannins, triterpenoids, saponins, sesquiterpenes, and steroids.

Các thành phần hóa học trong một số loài thuộc chi Trâm ngoài S cumini, như Syzygium polyanthum và Syzygium samarangense, đã được báo cáo Tuy nhiên, thành phần hóa học trong cây Trâm Syzygium glomerulatum vẫn chưa được nghiên cứu.

Trâm Tròn có tên khoa h c là Syzygium glomerulatum [114] m c t i Vi t Nam ch a có nghiên c u thành ph n hóa h c c ng nh ho t tính sinh h c c a cao chi t t Trâm Tròn

Vi c t ng quan các nhóm h p ch t thu nh n t các loài thu c chi Trâm s góp ph n đ nh h ng cho vi c nghiên c u trên cây Trâm Tròn.

Hình 1 6 Hoa, lá và toàn cây Trâm Tròn

Suzita Ramli và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá Syzygium polyanthum L., cho thấy khả năng kháng lại các chủng gây bệnh và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Kết quả cho thấy vòng cản trở S.aureus đạt 9,33 ± 0,52 mm, với giá trị MIC là 0,63 mg/mL và MBC là 1,25 mg/mL.

Mueller và cộng sự (2015) đã xác định hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn và hoạt tính chống oxi hóa của dược liệu Thái Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ Syzygium cumini có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với S aureus và S epidermidis, với giá trị MBC lần lượt là 2 mg/mL và 1,5 mg/mL.

Imran và cộng sự (2017) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá Syzygium cumini đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng đa thuốc Kết quả cho thấy vòng kháng khuẩn lớn nhất thuộc về phân đoạn ete và ethanol, dao động từ 8-24 mm Giá trị MIC của cao chiết lá được xác định từ 1,56 đến 25 mg/mL trên các chủng vi khuẩn khảo sát, trong đó phân đoạn ethylacetate của cao chiết Syzygium cumini cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ.

S aureus kháng thu c có giá tr MIC th p nh t là 12,5 mg/mL Nghiên c uđ xu t s d ng cao chi t Syzygium cumini trong đi u tr các b nh nhi m khu n do ch ng S aureus và E coli kháng thu c [126].

Cò Ke

H : Malvaceae Chi: Chi Grewia Tên khoa h c: Grewia asiatica L

Cò Ke (Grewia asiatica) là m t loài th c v t đ c tìm th y ph bi n nhi u qu c gia Nam Á và ông Nam Á nh Pakistan, n , Campuchia Riêng Vi t Nam cây Cò

Ke phân b ch y u Qu ng Ninh, Ninh Bình, c L c, Lâm ng, ng Nai và Bình

D ng là loài thực vật có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng phổ biến trong ngành thực phẩm và y học nhờ vào hàm lượng chất dinh dưỡng phong phú Cò Ke chứa nhiều protein, acid amin, vitamin và khoáng chất, cùng với các hợp chất sinh học như anthocyanin, tannin, phenolic và flavonoid, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

Quả Cò Ke và các bộ phận khác của cây đều có nhiều hoạt tính dược lý như kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống ung thư Quả này đặc biệt được xác định có lợi cho các trường hợp mắc các chứng rối loạn về tim mạch, tiêu hóa và được sử dụng để điều trị viêm họng, lao phổi Ngoài ra, lá cây còn được sử dụng để giảm đau, kích ứng và phát ban do vật thể lạ Loài cây này đã được chứng minh có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả.

Cò Ke là m t loài cây b i cao t 4 –5 m Lá có kích th c vào kho ng 18 cm chi u dài

Cây có chiều cao từ 24 đến 50 cm, thường mọc thành từng chùm với những bông hoa riêng biệt có đường kính không quá 2 cm Lá cây có hình bầu dục hoặc hình tim, với nhiều lông trên bề mặt và mép lá có răng cưa Hoa có dạng hình tròn hoặc hình chóp, với cuống màu xanh bóng dài từ 1,0 đến 1,9 cm và đường kính từ 0,8 đến 1,6 cm Khi chín, quả chuyển từ màu xanh nhạt sang màu đậm và cuối cùng là màu đen, có vị chua ngọt và kích thước giống như quả nho Cây bắt đầu ra hoa và kết quả từ tháng 4 đến tháng 5.

Qu c a Cò Ke (G asiatica) ch a các thành ph n nh pelargonidin 3,5-diglucoside, naringenin-7-O- -D-glucoside, quercetin, quercetin 3-O- -D-glucoside, tannin, catechin, và cyanidin-3-glucoside Grewinol và d n xu t c a Grewinol ch a trong hoa

T ng t -sitosterol, quercetin, quercetin 3-O- - D-glucoside, naringenin, naringenin

The extraction of 7-O-D-glucoside and a-lactone 3,21,24-trimethyl-5,7-dihydroxy hentriacontanoic acid from the flowers has been achieved The plant contains various compounds such as betulin, lupeol, lupenone, friedelin, -amyrin, and -sitosterol extracted from the core of G asiatica Additionally, quercetin, kaempferol, and glycoside derivatives have been isolated from the leaf extracts Key components used for chemical characterization of the high-density extracts from G asiatica include citric acid trimethyl ester, -methyl-l-sorboside, stigmasterol, campesterol, and 9,12-octadecadienoic acid methyl ester.

Hình 1 7 Hoa, lá, và toàn cây Cò Ke

V t li u, hóa ch t thí nghi m

M u th c v t

Các mụ d c liu g m Ngành Ng nh Nam (Cratoxylum cochinchinensis L.), X ng Mã (Carallia brachiata L.), Trâm Tròn (Syzygium glomerulatum G.), và Cò Ke (Grewia asiatica L.) đã được thu m u t i ph ng nh Hòa, Thành Ph Th D u M t, T nh Bình Những loài cây này không chỉ có giá trị kinh tế mà còn góp phần bảo tồn hệ sinh thái địa phương Việc khai thác và sử dụng hợp lý các nguồn tài nguyên thực vật này là cần thiết để duy trì sự phát triển bền vững trong khu vực.

D ng ( đ nh v : 11º00’33.02’’ phía b c, 106º39’00.37’’ phía đông, đ cao 11m±3m)

Th i gian thu m uth c v t t tháng 2 đ n tháng 5 Các b ph n c a m u th c v t thu hái là lá và cành non đính lá

Hình 2 1 Hình nh th c t đ a đi m thu m u

Tên hóa ch t Hưng s n xu t

Môi tr ng l ng tryptone soy Himedia, n

Môi tr ng agar tryptone soy Himedia, n Môi tr ng Th ch máu Công ty Nam Khoa, Vi t Nam Môi tr ng Mannitol salt agar BD, Hoa K

Môi tr ng Muller-Hinton agar Difco, Hoa K

Ethanol, methanol Prolabo, Pháp n-Hexan Chemicals,Vi t Nam

Dung d ch đ m mu i phosphate (PBS) Gibco, Hoa K

Ch ng vi khu n Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC ® 33591, và ch ng vi khu n Staphylococcus aureus nh y methicillin (MSSA) ATCC ® 6538 đ c cung c p b i công ty Microbiologics c a M

Tên thi t b Hưng s n xu t a 96 gi ng có n p ti t trùng Biologix, Hoa K Phin l c vụ trựng 0,22àm Sartorius, c

N i h p ti t trùng DaiHan, Hàn Qu c

Máy ly tâm l nh Hermle, c

Máy ly tâm th ng Hettich, c

T nuôi vi sinh DaiHan, Hàn Qu c

T nuôi t bào Thermo Fisher Scientific, Hoa K

Máy cô quay chân không EYELA N1110, Nh t B n

Máy xay d c li u FY 130 Vi t Nam

Máy phá m u b ng sóng siêu âm Sonicator model: Q700

Máy Elisa t đ ng Dynex DS2, Hoa K

Thi t b ch p nh SEM, FESEM S4800 Hitachi, Nh t

Thi t b S c ký khí GC-2010 Plus, s d ng đ u dò MS

Thi t b phân tích NMR AVANCE III HD

2.2 N i dung vƠ ph ng pháp nghiên c u:

Thu nh n cao ethanol toƠn ph n b ng ph ng pháp cô quay, đ nh tính kh n ng kháng MRSA

-Thu th p các b ph n lá và cành non c a th c v t, ph i khô t nhiên, chi t ngâm d m trong dung môi ethanol (99,9 %) nhi t đ 50 ºC , l c 100rpm, trong th i gian

-Kh o sát s b th c v t: m, tro toàn ph n

- nh tính ho t tính kháng MRSA và kh n ng h p l c v i kháng sinh b ng ph ng pháp khu ch tán đ a.

- nh tính thành ph n hóa h c c a cao chi t cho ho t tính kháng MRSA cao nh t.

Các phơn đo n đ c thu nh n b ng ph ng pháp trích l ng-l ng, xác đ nh ho t tính kháng MRSA

-Xác đ nh ‑ICI c a phân đo n-phân đo n, ‑ICI c a phân đo n-kháng sinh (cefoxitin, vancomycin)

-Th nghi m th i gian di t khu n

-Xác đ nh đích tác đ ng nh biofilm, c ch tan huy t, PBP2a, kh n ng ch u mu i

• Thu tinh ch t chính t các phân đo n cho ho t ch t kháng MRSA cao nh t

• Xác đ nh đích tác đ ng nh biofilm, kh n ng ch u mu i, c ch tan huy t, PBP2a

1 - Sàng l c cao ethanol toàn ph n th c v t cho ho t tính kháng MRSA

2 – ánh giá tính an toàn c a cao chi t

- Xác đnh nhóm ho t ch t kháng MRSA

- Công th c h p l c c a phân đo n-kháng sinh, phân đo n-phân đo n

- Xác đnh c u trúc tinh ch t chính

- Công th c h p l c c a tinh ch t v i kháng sinh

Ch ng vi khu n

Ch ng vi khu n Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC ® 33591, và ch ng vi khu n Staphylococcus aureus nh y methicillin (MSSA) ATCC ® 6538 đ c cung c p b i công ty Microbiologics c a M

Thi t b thí nghi m

Tên thi t b Hưng s n xu t a 96 gi ng có n p ti t trùng Biologix, Hoa K Phin l c vụ trựng 0,22àm Sartorius, c

N i h p ti t trùng DaiHan, Hàn Qu c

Máy ly tâm l nh Hermle, c

Máy ly tâm th ng Hettich, c

T nuôi vi sinh DaiHan, Hàn Qu c

T nuôi t bào Thermo Fisher Scientific, Hoa K

Máy cô quay chân không EYELA N1110, Nh t B n

Máy xay d c li u FY 130 Vi t Nam

Máy phá m u b ng sóng siêu âm Sonicator model: Q700

Máy Elisa t đ ng Dynex DS2, Hoa K

Thi t b ch p nh SEM, FESEM S4800 Hitachi, Nh t

Thi t b S c ký khí GC-2010 Plus, s d ng đ u dò MS

Thi t b phân tích NMR AVANCE III HD

2.2 N i dung vƠ ph ng pháp nghiên c u:

Thu nh n cao ethanol toƠn ph n b ng ph ng pháp cô quay, đ nh tính kh n ng kháng MRSA

-Thu th p các b ph n lá và cành non c a th c v t, ph i khô t nhiên, chi t ngâm d m trong dung môi ethanol (99,9 %) nhi t đ 50 ºC , l c 100rpm, trong th i gian

-Kh o sát s b th c v t: m, tro toàn ph n

- nh tính ho t tính kháng MRSA và kh n ng h p l c v i kháng sinh b ng ph ng pháp khu ch tán đ a.

- nh tính thành ph n hóa h c c a cao chi t cho ho t tính kháng MRSA cao nh t.

Các phơn đo n đ c thu nh n b ng ph ng pháp trích l ng-l ng, xác đ nh ho t tính kháng MRSA

-Xác đ nh ‑ICI c a phân đo n-phân đo n, ‑ICI c a phân đo n-kháng sinh (cefoxitin, vancomycin)

-Th nghi m th i gian di t khu n

-Xác đ nh đích tác đ ng nh biofilm, c ch tan huy t, PBP2a, kh n ng ch u mu i

• Thu tinh ch t chính t các phân đo n cho ho t ch t kháng MRSA cao nh t

• Xác đ nh đích tác đ ng nh biofilm, kh n ng ch u mu i, c ch tan huy t, PBP2a

1 - Sàng l c cao ethanol toàn ph n th c v t cho ho t tính kháng MRSA

2 – ánh giá tính an toàn c a cao chi t

- Xác đnh nhóm ho t ch t kháng MRSA

- Công th c h p l c c a phân đo n-kháng sinh, phân đo n-phân đo n

- Xác đnh c u trúc tinh ch t chính

- Công th c h p l c c a tinh ch t v i kháng sinh

N i dung và ph ng pháp nghiên c u

Thu m u d c li u và kh o sát s b

B nloài th c v tđ c s d ng trong nghiên c u g m Ngành Ng nh Nam, Trâm Tròn,

X ng Mã và Cò Ke là các loài thực vật được thu hái tại Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương, với tọa độ 11º00’33.02’’ phía Bắc và 106º39’00.37’’ phía Đông, ở độ cao khoảng 11m ± 3m Thời gian thu hái từ tháng 2 đến tháng 5 Mẫu vật được phân loại và lưu trữ bởi bộ môn Sinh Thái và Tài Nguyên Môi Trường của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM, cùng với bộ môn Sinh học ngầm của Trường Đại học Thủ Dầu Một Các mẫu thực vật được thu thập chủ yếu gồm các bộ phận lá và cành non có đính lá.

Để xác định độ ẩm của dược liệu, cho vào chén cân đã được cân bì trước đó khoảng 5-10 g dược liệu Chén cân cần có kích thước phù hợp, đảm bảo dược liệu không dày quá 5 mm Sau đó, đặt chén chứa dược liệu vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ ở 105 độ C trong 1 giờ Khi nguội, chuyển chén vào bình hút ẩm để cân, lặp lại quá trình này nhiều lần cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không chênh lệch quá 0,5 mg Độ ẩm (%) của dược liệu được tính theo công thức: m1 là khối lượng dược liệu trước khi sấy (tính bằng gram); m2 là khối lượng dược liệu sau khi sấy (tính bằng gram).

Xác định tro toàn phần là quá trình xác định lượng chất rắn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn mẫu vật Để thực hiện, cần sử dụng chén nung bằng sứ có đường kính 35mm, đã được nung và cân bì Mẫu vật cần cân chính xác từ 1-5g và được cho vào chén nung Sau đó, tiến hành nung ở nhiệt độ cao để đảm bảo chất liệu cháy hết hoàn toàn.

Cho chén vào lò nung nhi t đ 300 ºC cho đ n khi thu đ c kh i l ng không đ i Sau khi d c li u đ c vô c hóa hoàn toàn, đ ngu i trong bình hút m và đem cân

Tro toàn ph nđ c tính theo công th c: X: t l tro toàn ph n, tính ra ph n tr m a: Kh i l ng chén có tro b: Kh i l ng chén không c: Kh i l ng d c li u dùng.

2.2.2 Thu nh n cao chi t , cao phân đo n a) Thu nh ncao chi t

Các mẫu thực vật được thu hái vào buổi sáng Sau khi thu hái, các mẫu được xử lý bằng cách rửa sạch và cắt nhỏ Tiếp theo, mẫu được sấy khô tự nhiên trong phòng thí nghiệm, với nhiệt độ phòng duy trì khoảng 30 ºC ± 2 ºC, và thường xuyên đo đạc để đảm bảo chất lượng.

1 l n/ngày M u th c v t sau khi khô (kh i l ng m u không đ i sau 2-3 ngày cân) đ c xay nhuy n b ng máy xay d c li u B t d c li u đ c chi t ngâm d m v i ethanol

Trong quá trình thu nhận cao ethanol, 10 ml ethanol được sử dụng ở nhiệt độ 50 ºC trong 24 giờ với tốc độ khuấy 100 rpm bằng máy lắc nhiệt Dịch chiết sau đó được thu bằng giấy lọc Whatman Dịch chiết này được cô quay ở 30 ºC để loại bỏ ethanol Sau khi cô quay, cao ethanol thu được được giữ ở nhiệt độ 50 ºC cho đến khi không còn dung môi Cuối cùng, cao này được bảo quản ở nhiệt độ 4 ºC cho đến khi sử dụng.

Cao toàn ph nethanol đ c hòa tan trong methanol và n c v i t l th tích (1:1), d ch chi t đ c hòa tan hoàn toàn b ng máy đ ng hóa m u (sonicator) trong vòng

Sau 3 phút, dung dịch được chiết tách bằng các dung môi n-hexane và ethyl acetate Đầu tiên, dung dịch cao toàn phần được phân tách bằng dung môi n-hexane theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để thu được pha n-hexan, sau đó làm khan bằng Na2SO4 Tiếp theo, dung dịch còn lại được chiết bằng dung môi ethyl acetate theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để thu được pha ethyl acetate, cũng được làm khan bằng Na2SO4 Hai phân đoạn n-hexan và ethyl acetate sau đó được thu nhận bằng phương pháp cô quay trong 30 phút để loại bỏ dung môi.

Cao phân đo n pha trong DMSO 100% là dung dịch gốc, được sử dụng để chuẩn bị mẫu cho các thí nghiệm Để kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn, các dung dịch này sẽ được pha loãng 5 lần (DMSO 20%) trước khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát.

Hi u su t chi t cao phân đo n đ c tính theo công th c:

H m phân đo n m cao toàn ph nx

Hi u su t c quá trình chi t đ c tính theo công th c:

Hquá trinh chi t (%) = H chi t cao phân đo n n-hexan + H chi t cao phân đo n ethylacetate

2.2.3 nh tính thành ph n hóa h c cao ethanol toàn ph n/cao phân đo n Trâm

Tròn; Thu tinh ch t chính trong cao ethanol toàn ph n Trâm Tròn nh tính thành ph n hóa h c cao ethanol toàn ph n/cao phân đo n [134] a) Nh n bi t flavonoid

Phân tích cyanidin có thể được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch chứa flavonoid và magnesium trong điều kiện có mặt của HCl/EtOH Đầu tiên, chuẩn bị hai ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 mL dung dịch chiết đã hòa tan Ống nghiệm thứ nhất sẽ được dùng làm chuẩn Trong ống nghiệm thứ hai, thêm vào 1 mL tert-butyl alcohol hoặc isoamyl alcohol, 0,5 mL HCl và từ 3 đến 5 hạt magnesium kim loại Sau đó, gia nhiệt trong 3 phút, sẽ quan sát thấy sự thay đổi màu sắc trong ống nghiệm.

Sau khi sử dụng ng nghi m 1 để so sánh, nếu dung dịch chứa các hợp chất như flavon, flavonon, flavonol, hoặc flavononol, thì dung dịch sẽ chuyển sang màu cam hoặc tím Ngược lại, nếu dung dịch chứa isoflavon, flavanol, auron mà không có màu hiển thị, phương pháp này sẽ không nhận biết được (kết quả âm tính).

Phản ứng với chì acetate trong môi trường trung tính hoặc kiềm được thực hiện bằng cách cho 1 mL dịch chiết vào 2 ống nghiệm, sau đó thêm 1 mL dung dịch chì acetate 10% và 1 mL dung dịch chì trung tính vào các ống nghiệm đó Phản ứng tạo ra kết tủa Chì acetate kiềm kết tủa với các phenol flavonoid, trong khi acetate trung tính kết tủa với các dẫn xuất ortho-dihydroxyphenol Bên cạnh đó, cần nhấn mạnh rằng polyphenol cũng có vai trò quan trọng trong các phản ứng này.

Phân tích carotenoid có thể thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch eCl3 5% Đầu tiên, hòa tan 2 mL mẫu trong 2 mL dung môi, sau đó thêm vài giọt eCl3 5% Màu sắc thu được sẽ phụ thuộc vào số lượng nhóm OH có trong phân tử, có thể là xanh lá, xanh dương hoặc nâu đỏ.

Thêm 1 đ m 2 gi t H2SO4 đ m đ c vào ng nghi m có ch a d ch chi t N u dung d ch có màu xanh, d ch chi t có ch a carotenoid. d) Nh n bi t alkaloid

32 nh n bi t s hi n di n c a alkaloid trong cây, th ng s d ng ph ng pháp Webb, bao g m 2 ph n:

Trong phần 1, cho 5 gam bột dược liệu vào dung dịch H2SO4 1% trong bình Erlen và đun sôi trong vòng 1 giờ Sau đó, sử dụng phần dung dịch thử nghiệm với thuốc thử Dragendorff Nếu xuất hiện kết tủa, điều này có nghĩa là dược liệu có tính kiềm với alkaloid Ngược lại, nếu không có kết tủa, kết quả vẫn cho thấy tính chất âm tính, và cần thực hiện theo phần 2.

Phương pháp 2: 5 gam bột dược liệu khô được ngâm trong dung dịch Prollius, bao gồm chloroform-EtOH 95-NH4OH theo tỷ lệ 8:8:1, trong môi trường có tính kiềm Ngâm nguyên liệu trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó lọc và thu được dịch chiết Dịch chiết được đuổi dung môi cho đến khi còn lại cặn Cặn này hòa tan trong dung dịch HCl 1% và đun nóng cho tan hoàn toàn Cuối cùng, lấy dịch lỏng để thực hiện thí nghiệm với thuốc thử Dragendorff.

Phun lên b nm ng: Trong m t bình phun, cho l n l t theo th t 20 mL n c; 5 mL

HCl 6N, 2 mL dung d ch thu c th Dragendoff và 5 mL NaOH 6N, dung d ch này đ c phun lên b n m ng N u có alkaloid s cho v t màu cam-đ e) Nh n bi t steroid

Các steroid có th đ c ki m tra b ng s c ký b n m ng ho c s d ng ng nghi m, (tham chi u v i m u tr ng ch ch á n c c t và thu c th ) S d ng ph n ng Rosenthaler đ nh n bi t streroid

Sử dụng 1 mL dung dịch chứa cao chiết hòa tan trong methanol-nước (1:1), thêm 2 giọt vanillin 1% trong ethanol và 1 giọt HCl để điều chỉnh độ pH Phản ứng sẽ tạo ra màu xanh lá cây hoặc màu tím với dung dịch.

Dùng b n m ng: hòa tan 1 g vanillin trong 100 mL ortho-phosphoric acid 50 % đ phun lên l p b n m ng, làm khô 110 trong 10 đ n 20 phút cho đ n khi có màu vàng. f) Nh n bi t tannin

33 ng nghi m ch a cao ethanol toàn ph n hòa tan đ cthêm vào gelatin 1% có ch a 10

% NaCl, d ch chi t s xu t hi n k t t a, k t lu n trong cao ethanol toàn ph n có ch a tannin

Cao ethanol toàn ph nTrâm Tròn đ c l a ch n đ thu nh n tinh ch t

Cao phân đoạn Tràm Tròn được tiến hành sắc ký cột silica gel, sử dụng sắc ký bản mỏng (TLC: silicagel 60 ‑254) để xác định vị trí của hợp chất trong mỗi phân đoạn, với thuốc thử vanillin (1g vanillin pha trong 500ml dung dịch 99,5/7ml H2SO4) Tiến hành định tính trên TLC phân đoạn cho thấy sự hiện diện của các chất chính, do đó tiến hành TLC giúp xác định dung môi cho sắc ký cột phân lập tinh chất.

Cao phân đo n n-hexan (0,2 g) v i h dung môi n-hexan-EtOAc (100 %-0 %) v i t l dung môi gi i ly t ng 5 % EtOAc trong n-hexan C t silica gel có chi u cao là 9cm, r ng

3,2cm và t c đ dòng 0,2 mL/phút K t qu thu đ c 20 phân đo n chính đ t tên là Hex

Kh o sát ho t tính kháng MRSA c a cao chi t/phân đo n/tinh ch t 35 2.2.5 C ch kháng khu n c a cao phân đo n/tinh ch t trên ch ng MRSA47 2.2.6 Xác đ nh đ c tính t bào c a các cao th c v t

a) Xác đ nh ho t tính kháng MRSA b ng ph ng pháp khu ch tán đ a

Cao ethanol toàn phần được hòa tan trong DMSO 100% và sau đó lọc qua màng lọc 0,22 μm để tạo dung dịch gốc Dung dịch này được pha loãng 5 lần, với dung dịch sau khi pha loãng chứa 20% DMSO, sẽ được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng MRSA Môi trường được chuẩn bị là Muller-Hinton Agar (MHA) có bổ sung 100 µL dung dịch vi khuẩn với nồng độ 10^6 CFU/mL Phương pháp sử dụng được áp dụng trong nghiên cứu này.

Phương pháp Kirby-Bauer được sử dụng để kiểm tra độ nhạy kháng sinh, với các giếng trên đĩa thạch có kích thước 5 mm Mỗi đĩa cần có ít nhất ba giếng, trong đó một giếng được bổ sung 50 µL dung dịch cao toàn phần/cao phân đo lường, một giếng khác được bổ sung 50 µL DMSO 20% làm đối chứng âm.

Nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm với 50 àL khỏng sinh để kiểm tra hoạt tính kháng MRSA Sau đó, các đĩa được ủ ở nhiệt độ 37 ºC trong 24 giờ trong môi trường nuôi vi sinh Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác Đường kính vùng ức chế được đo bằng milimet (mm) sau 24 giờ, và hoạt tính kháng MRSA được xác định khi có sự xuất hiện vòng vô khuẩn Phương pháp vi pha loãng cũng được sử dụng để xác định hoạt tính kháng MRSA.

Nồng độ chất ức chế tối thiểu (MIC) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có thể ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn mà có thể quan sát được Để xác định nồng độ chất ức chế tối thiểu, phương pháp pha loãng dãy nồng độ trên đĩa 96 giếng được sử dụng Mỗi giếng được bổ sung 90 µL môi trường lỏng Muller-Hinton (MHB), 10 µL dịch vi khuẩn có nồng độ 10^6 CFU/mL, và 100 µL dung dịch cao phân tử hòa tan trong DMSO 20%, với tổng thể tích cuối cùng trong mỗi giếng là 200 µL.

Trên đĩa 96 giếng, các giếng được bố trí theo sơ đồ thí nghiệm, dung dịch cao phân tử được pha loãng với tỷ lệ 2X thành một dãy Các giếng được chia thành các nhóm: giếng chứa môi trường MHB; giếng chứa môi trường MHB và vi khuẩn; giếng chứa môi trường MHB, vi khuẩn, DMSO; giếng chứa môi trường MHB, vi khuẩn, kháng sinh Các giếng sẽ được ủ ở 37ºC trong vòng 24 giờ trong tủ nuôi vi sinh Sau thời gian này, quan sát bằng mắt thường so với đối chứng để xác định giếng không có sự tăng trưởng của vi khuẩn, sau đó giếng có nồng độ thấp nhất trong dãy pha loãng được nhận định là giếng có giá trị MIC của cao phân tử được lấy 150 µL dung dịch trong giếng trên 3 đĩa Muller Hinton agar (MHA), mỗi đĩa 50 µL dung dịch, các đĩa này sẽ tiếp tục được ủ trong 24 giờ, 37ºC trong tủ nuôi vi sinh Sau thời gian này, nếu vi khuẩn không hiện diện hoặc một đợt bào vi khuẩn trên đĩa đạt 300 CFU/mL thì xác định nồng độ thấp nhất trong dãy pha loãng của cao phân tử trong giếng khảo sát là nồng độ chất ức chế tối thiểu (MIC) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (mỗi sự thí nghiệm được thực hiện lặp lại trên 3 đĩa 96 giếng).

FICI là chỉ số xác định theo phương pháp bàn c, được đánh giá thông qua các thí nghiệm với hoạt động chống lại vi khuẩn do sự kết hợp của cao phân đoạn/tinh chất và kháng sinh Thí nghiệm được thiết kế để xác định giá trị MIC của cao phân đoạn, trong đó các giếng được bố trí hợp lý với các nồng độ cao phân đoạn/tinh chất và kháng sinh tương ứng Mỗi giếng chứa 90 µL môi trường Muller-Hinton, 10 µL dịch vi khuẩn có nồng độ 10^6 CFU/mL, 50 µL dung dịch cao phân đoạn/tinh chất (A) và 50 µL dung dịch kháng sinh (B), tổng thể tích là 200 µL Các giếng này được ủ trong 24 giờ ở 37ºC trong tủ nuôi vi sinh Sau thời gian ủ, giếng nào không có sự phát triển của MRSA sẽ được kiểm tra lại bằng phương pháp trên môi trường MHA, với 150 µL dịch trong giếng thử trên 3 đĩa MHA Các đĩa này cũng được ủ trong 24 giờ ở 37ºC Kết quả từ các thí nghiệm này sẽ được sử dụng để tính toán chỉ số chồng chéo (chỉ số FICI) theo công thức đã định.

H p l c (synergy) khi FICI ≤ 0.5; H p l c m t ph n (partial synergy) khi 0.5