tcvn8400-10-2011

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8400-10:2011 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 10: BỆNH LAO BÒ Animal disease - Diagnostic procedure - Part 10: Bovine tuberculosis disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh lao bị vi khuẩn Mycobacterium bovis gây Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: Bệnh lao bò (Bovine tuberculosis disease) Bệnh mạn tính trực khuẩn Mycobacterium bovis gây Đặc trưng bệnh hình thành hạt lao, thường thấy hạch phổi, hạch bạch huyết quan nội tạng Bệnh lao bị lây nhiễm sang người Thuốc thử vật liệu thử Trong tiêu chuẩn sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác - Etanol (C2H6O) - Fuchsin basic (C20H20ClN3) - Xanh metylen (C16H18N3SCl) - Axit clohydric (HCl) - Kali hydroxit (KOH) - Thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH) - Natri pyruvat (C3H3NaO3) - Axit oxalic (C2H2O4) - Amoni sắt (II) sulfat ((NH4)2Fe(SO4)2) - Pyrazinamid (C5H5N3O) - Các môi trường nuôi cấy phân lập: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY), Middlebrook 7H10 hay 7H11 - Tuberculin PPD bò - Tuberculin PPD gà Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau:  Tủ ấm, trì nhiệt độ 37oC - Tủ sấy - Nồi hấp - Buồng cấy - Kính hiển vi quang học - Tủ lạnh - Que cấy - Đèn cồn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - Đĩa Petri để đổ môi trường - Panh - Kéo - Lamen (coverlip) - Phiến kính - Pipet thủy tinh cỡ - Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml 1000 ml Cách tiến hành 5.1 Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1 Đặc điểm dịch tễ - Trâu, bò bị nhiễm lao tiếp xúc với trâu, bị bị bệnh hay từ vùng có dịch  Bệnh lao có khắp nơi giới - Động vật non cảm thụ với vi khuẩn lao mạnh động vật trưởng thành 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng - Con vật bị bệnh gầy, yếu, lông dựng đứng, da khô, sốt nhẹ chiều - Các triệu chứng bệnh phụ thuộc vào vị trí phân bố hạt lao Nếu hạt lao khu trú phổi: Con vật ho khan, ho ho nhiều thời tiết thay đổi Nếu hạt lao khu trú hạch: Các hạch bạch huyết sưng, cứng, sờ thấy lổn nhổn, hạch trước vai, trước đùi, hàm Nếu hạt lao khu trú ruột: Con vật ỉa chảy, phân khẳm ỉa chảy táo bón luân phiên - Con vật gầy dần chết suy nhược giai đoạn cuối bệnh 5.1.3 Bệnh tích Bệnh tích đặc trưng vật có hạt lao Các hạt lao quan nội tạng, màng treo ruột, ruột, màng phổi, màng bụng, vú,… hay gặp hạch phổi, hạch vùng đầu hạch bạch huyết xoang ngực Các hạt lao thường có màu vàng, màu trắng đục, dạng bã đậu dạng hạt xơ hay bị canxi hố thành khối tăng sinh thượng bì có kích thước ổi Trên quan thấy nhiều dạng hạt lao khác Nếu hạt lao có nhiều phổi nắn thuỳ phổi có cảm giác phổi có trộn cát, cắt có tiếng kêu lạo xạo Ở giai đoạn đầu, bệnh lao khó chẩn đốn qua mổ khám 5.1.4 Phản ứng tiêm nội bì (tuberculin test) Phản ứng dùng để chẩn đoán bệnh lao cho động vật sống 5.1.4.1 Vật liệu - Tuberculin PPD bò - Tuberculin PPD gà 5.1.4.2 Vị trí tiêm Nếu tiêm mũi tuberculin PPD cho bị chọn vị trí da cổ mặt nếp gấp da đuôi Nếu tiêm mũi tuberculin PPD cho bị tuberculin PPD cho gà chọn vị trí khác bên cổ vật, khoảng cách vị trí 12 cm đến 15 cm Gia súc non phải tiêm hai bên cổ Trước tiêm, cắt lơng vị trí tiêm, kiểm tra có tổn thương hay không Đánh dấu đo độ dày da trước tiêm tuberculin PPD thước cặp Tiêm tuberculin PPD bị/gà vào da (tiêm nội bì) vị trí tiêm chọn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Liều tiêm: Dùng khơng 2000 UI tuberculin PPD bị/gà lượng tiêm khơng q 0,2 ml 5.1.4.3 Đọc kết Sau tiêm 72 h, đo độ dày nếp gấp da đánh giá kết sau: Trường hợp tiêm mũi, kết cho thấy: - Độ sưng da không lớn mm vật khơng có triệu chứng lâm sàng: âm tính; - Độ sưng da lớn mm nhỏ mm, vật khơng có triệu chứng lâm sàng: nghi ngờ;  Độ sưng da lớn mm nhỏ mm, vật có triệu chứng lâm sàng: dương tính;  Độ sưng da lớn mm: dương tính Với động vật cho kết nghi ngờ sau 42 ngày làm lại phản ứng Sau kiểm tra lần hai, cho kết nghi ngờ dương tính, kiểm tra lại phản ứng tiêm nội bì hai mũi tuberculin PPD bò tuberculin PPD gà Đối với vị trí tiêm đi, phản ứng dương tính độ sưng da vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm lớn mm Nếu bị có nếp gấp da đi, phản ứng dương tính độ sưng da vị trí tiêm lớn mm Trường hợp tiêm hai mũi, kết cho thấy: - Độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD bị (mm) nhỏ độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm): âm tính; - Độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD bị (mm) lớn độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch hai độ sưng từ mm đến mm: nghi ngờ; - Độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD bị (mm) lớn độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch hai độ sưng lớn mm: dương tính 5.1.4 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm Lấy mơ nghi ngờ có bệnh tích với lượng từ 10 g đến 200 g đựng vào lọ miệng rộng túi nilon Bệnh phẩm phải lấy vô trùng, bảo quản điều kiện lạnh từ oC đến oC gửi phòng xét nghiệm chậm 24 h sau lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích thơng tin dịch tễ 5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 5.2.1 Nuôi cấy, phân lập Nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch, sau khử tạp khuẩn dung dịch axit oxalic % hay dung dịch NaOH từ % tới % Huyễn dịch lắc 10 nhiệt độ phòng (24 oC) đem trung hồ với dung dịch HCl N, sau ly tâm Chất cặn sử dụng cho nuôi cấy kiểm tra kính hiển vi Chất cặn cấy lên môi trường trứng ủ 37 oC vịng tuần, tất mơi trường nên bịt kín để tránh bị khơ Một số mơi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn lao như: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY) Ngoài ra, sử dụng mơi trường Middlebrook 7H10 hay 7H11 5.2.2 Giám định vi khuẩn 5.2.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy Giám định hình thái phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen theo quy định Phụ lục A Vi khuẩn M bovis hình gậy mảnh, bắt màu hồng xanh 5.2.2.2 Giám định tính chất mọc mơi trường Vi khuẩn M bovis mọc vòng tuần tới tuần nuôi cấy Khuẩn lạc mọc chậm 37oC, không mọc 22oC hay 45oC Kiểm tra phát triển vi khuẩn bị ức chế glyxerol: Cấy vi khuẩn lên mơi trường có khơng có glyxerol Trên mơi trường có glyxerol vi khuẩn mọc yếu Có thể sử dụng mơi trường trứng (Lowenstein Jensen) Kiểm tra phát triển vi khuẩn môi trường có 0,4 % natri pyruvat: Cấy vi khuẩn lên mơi trường Lowenstein Jensen (khơng có glyxerol) có khơng bổ sung 0,4 % natri pyruvat Vi khuẩn M bovis mọc tạo thành khuẩn lạc có dạng trơn, màu trắng nhạt LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Kiểm tra mẫn cảm vi khuẩn với thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH): Cấy vi khuẩn lên mơi trường Lowenstein Jensen có bổ sung TCH 10 µg/ml: Vi khuẩn M bovis khơng mọc 5.2.2.3 Giám định đặc tính sinh hóa Các đặc tính sinh hoá đặc trưng vi khuẩn M bovis trình bày bảng sau: Đặc tính sinh hố M bovis Sản sinh niacin âm tính Phân giải nitrat âm tính Pyrazinamidase âm tính Urease dương tính Phương pháp tiến hành: theo Phụ lục B Kết luận Bò bị bệnh lao có đặc điểm sau: - Con vật có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích bệnh - Kết ni cấy, phân lập, giám định vi khuẩn xác định vi khuẩn Mycobacterium bovis PHỤ LỤC A (Quy định) PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL-NEELSEN (ZN) A.1 Thuốc nhuộm A.1.1 Carbon fuchsin đặc - Chuẩn bị thuốc nhuộm Fuchsin basic 1,0 g Etanol 95 % (phần thể tích) 10,0 ml Phenol 5,0 g Nước 100,0 ml - Fuchsin basic hoà tan etanol, phenol hoà tan nước Trộn dung dịch với để vài ngày lọc qua giấy lọc, cho vào chai A.1.2 Dung dịch axit - alcohol Axit clohydric đặc 8,0 ml Etanol 95 % (phần thể tích) 97,0 ml Nên cho axit HCl vào cồn etanol A.1.3 Dung dịch xanh metylen Xanh metylen 8,0 g Etanol 95 % (phần thể tích) 300,0 ml Nước 1300,0 ml Kali hydroxit 0,13 g A.2 Cách tiến hành Cho carbon fushin ngập tiêu cố định đặt giá Dùng lửa đèn cồn đốt phía tiêu để thuốc nhuộm bốc 10 không sôi Nhỏ dung dịch axit-alcohol 15 (tẩy nhiều lần) Nhỏ xanh metylen lên tiêu 20 s Rửa tiêu nước, để khô LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn A.3 Xem tiêu Nhỏ giọt dầu vào tiêu xem tiêu kính hiển vi quang học với vật kính độ phóng đại 100 lần PHỤ LỤC B (Quy định) PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐẶC TÍNH SINH HĨA B.1 Phân giải nitrat Cho vài giọt nước vơ trùng vào ống nghiệm có nắp vặn (16 mm x 125 mm) cấy vào vòng que cấy vi khuẩn lao Dùng ống nghiệm có nước cất vơ trùng khác khơng cấy làm đối chứng âm Cho ml dung dịch NaNO3 (pha dung dịch NaNO3 0,01 M đệm phosphat 0,022 M, pH 7) Lắc ủ nồi đun cách thuỷ 37oC h Cho tiếp vao ống nghiệm giọt axít HCl đặc pha lỗng 1/2, giọt dung dịch sulphanilamid 0,2%, giọt dung dịch N-(1-naphthyl) etylendiamin dihydroclorua 0,1% Kiểm tra phát triển màu hồng đỏ so sánh với đối chứng âm: màu đỏ sậm phản ứng dương tính B.2 Kiểm tra mẫn cảm với pyrazinamid Dùng môi trường nước thịt Dubos có bổ sung 0,1 g pyrazinamid, 2,0 g axit pyruvic 15 g agar (cho lít mơi trường) Chia vào ống nghiệm có nắp vặn 15 ml/ống Hấp 121 oC 15 để rắn thạch vị trí thẳng Cấy vào thạch lượng vi khuẩn M bovis đặc ủ 37 oC ngày Sử dụng ống không cấy ống cấyM avium làm đối chứng âm dương Cho ml dung dịch amoni sắt (II) sulfat chuẩn bị vào ống để vào tủ lạnh h Phản ứng dương tính có vạch màu hồng thạch B.3 Urease Trộn phần thạch urê với phần nước cất vô trùng Chia vào ống nghiệm có nắp (16 mm x 125 mm), ống ml Trộn vòng que cấy vào ống, ủ 37oC Màu môi trường chuyển từ vàng sang hồng đỏ dương tính B.4 Sản sinh niacin Nên sử dụng kít thương phẩm (ví dụ sản phẩm Difco) chuẩn bị phản ứng cần sử dụng dung dịch BrCN chất độc thể LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162