Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 10910:2016 HẠT GIỐNG CÂY TRỒNG - HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SỐNG BẰNG PHÉP THỬ TETRAZOLIUM Crop Seeds - Guidelines for Viability Testing by Tetrazolium Lời nói đầu TCVN 10910:2016 xây dựng dựa tài liệu “Thử nghiệm khả sống sinh hóa, phép thử Tetrazolium” (Chương 6, điều lệ Kiểm nghiệm hạt giống quốc tế, Hội Kiểm nghiệm hạt giống Quốc tế (ISTA), 2011) TCVN 10910:2016 Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm trồng Quốc gia - Cục Trồng trọt biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn, Đo lường, Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố HẠT GIỐNG CÂY TRỒNG - HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SỐNG BẰNG PHÉP THỬ TETRAZOLIUM Crop Seeds - Guidelines for Viability Testing by Tetrazolium Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn hướng dẫn phương pháp xác định khả sống hạt giống loài trồng bảng A.1 phép thử Tetrazolium Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu, không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi bổ sung (nếu có): TCVN 8548:2011 Hạt giống trồng - Phương pháp kiểm nghiệm Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Hạt (Pure seed) Hạt loài trồng mà người gửi mẫu yêu cầu kiểm tra chiếm ưu phân tích, bao gồm tất giống lồi trồng 3.2 Hạt tươi (Fresh seed) Hạt hạt cứng không nảy mầm điều kiện phép thử nảy mầm, nhiên sạch, có khả phát triển thành mầm bình thường áp dụng phương pháp xử lý 3.3 Hạt cứng (Hard seed) Hạt cứng giai đoạn kết thúc thời gian thử nghiệm nảy mầm không hấp thụ nước có khả phát triển thành mầm bình thường, dạng hạt ngủ nghỉ; thường gặp nhiều loài thuộc họ Đậu Fabaceae (Leguminose) có họ trồng khác 3.4 Hạt có khả sống (Viable seed) Hạt sau nhuộm màu dung dịch muối Tetrazolium, phôi nhuộm đỏ hoàn toàn nhuộm đỏ phần vùng mơ định phát triển bình thường mầm Nguyên tắc - Dung dịch không màu 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride bromide dùng làm chất thị để phát trình khử oxy xảy bên tế bào sống, chất thị tiếp nhận hydrogen LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn từ men dehydrogenase hạt giống Do thủy phân chất 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride bromide tế bào sống sinh chất triphenyl formazan màu đỏ, ổn định không khuyếch tán - Chất màu đỏ dùng để phân biệt hạt giống có khả sống nhuộm màu hồn tồn hạt khơng có khả sống khơng nhuộm màu Có thể có hạt nhuộm màu phần nên tùy thuộc vào vị trí, kích thước mức độ nhuộm màu phôi để xác định hạt giống có khả sống khơng có khả sống Thiết bị, dụng cụ thuốc thử 5.1 Thiết bị dụng cụ - Thiết bị: Đèn chiếu sáng, kính lúp kính hiển vi soi - Dụng cụ: panh, dao cắt hạt (lưỡi dao mổ, lưỡi dao cạo ), gạt mẫu, dụng cụ ngâm mẫu, cốc đong, ống đong, đĩa thủy tinh 5.2 Thuốc thử - Dung dịch 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride bromide nồng độ 1,0%, pH từ 6,5 đến 7,5 - Chuẩn bị thuốc thử: Cách 1: pH nước cất từ 6,5 đến 7,5: pha 1g muối tetrazolium (chloride bromide) 100 ml nước cất Cách 2: pH nước cất không khoảng từ 6,5 đến 7,5 Muối Tetrazolium pha dung dịch đệm Dung dịch đệm chuẩn bị sau: Dung dịch 1: Hòa tan 9,078g KH2PO4 1000 ml nước cất Dung dịch 2: Hòa tan 9,472g Na2HPO4 1000 ml nước cất hòa tan 11,876g Na2HPO4.2H2O 1000 ml nước cất Trộn dung dịch theo tỷ lệ 2:3, kiểm tra pH khoảng từ 6,5 đến 7,5 Pha g muối tetrazolium (chloride bromide) 100 ml dung dịch đệm để có nồng độ dung dịch muối Tetrazolium 1% Cách tiến hành 6.1 Mẫu phân tích Mẫu phân tích gồm 400 hạt, lấy ngẫu nhiên từ phần hạt trộn chia thành lần nhắc lại, lần nhắc lại 100 hạt giống chuẩn bị mẫu phân tích phép thử nảy mầm (theo TCVN 8548:2011) Phép thử tiến hành hạt tươi, hạt cứng (được phát ngủ nghỉ) kết thúc phép thử nảy mầm Số lượng hạt giống phân tích phụ thuộc vào lượng hạt tươi, hạt cứng 6.2 Chuẩn bị hạt giống trước nhuộm màu 6.2.1 Làm ẩm hạt trước nhuộm màu Làm ẩm hạt biện pháp ban đầu cần thiết số loài trước nhuộm màu Thời gian làm ẩm tối thiểu 20 °C phụ lục A (bảng A.1) Nếu vỏ hạt cản trở hút nước phải chọc thủng vỏ hạt lồi thuộc họ đậu đỗ Fabaceae (Leguminoseae) - Làm ẩm chậm: Hạt giống làm ẩm chậm giấy đặt nẩy mầm Kỹ thuật nên sử dụng loài dễ bị gãy vỡ ngâm trực tiếp nước - Ngâm nước: Hạt giống phải ngâm nước để hút đủ nước Xác định khả sống hạt cứng loài thuộc họ đậu đỗ Fabaceae (Leguminoseae) cách ngâm nước nhiệt độ 20 °C 22h 6.2.2 Làm hở mô trước nhuộm màu Hạt cần phải làm hở mô trước nhuộm màu để dung dịch tetrazolium xâm nhập dễ dàng dễ đánh giá Xem hướng dẫn phụ lục (bảng A.1 B.1) - Chọc thủng hạt: Dùng kim mũi mác dao mổ nhọn chọc vào phần phần nội nhũ và/hoặc ngoại nhũ hạt - Cắt theo chiều dọc: Hạt giống ngũ cốc cắt hạt theo chiều dọc qua phần trụ phơi khoảng ¾ chiều dài nội nhũ Hạt giống thuộc loài thực vật hai mầm khơng có nội nhũ có phôi LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn thẳng cắt theo chiều dọc qua phần phía nửa mầm xa phôi, để lại trụ phôi không cắt - Cắt theo chiều ngang: Hạt giống hai mầm có phơi thẳng khơng có nội nhũ: cắt rời vứt bỏ đoạn 1/3 đến 2/5 phía đầu xa phơi mầm - Tách phơi: Tách phơi dùng lồi lúa mì, lúa mạch lúa mạch đen Phơi tách lưỡi dao mỏng, đẩy qua nội nhũ phía vảy bao (scutellum) xuống đến nội nhũ, sau lách nhẹ dao để nội nhũ mở rộng theo chiều cắt Phôi (cùng với scutellum) long khỏi nội nhũ, chuyển phôi sang dung dịch Tetrazolium - Loại bỏ vỏ hạt: Toàn vỏ hạt (và mô bao phủ khác) phải loại bỏ cách rạch dao nhọn kim mũi mác để tách chúng tránh làm hỏng phôi 6.3 Nhuộm màu - Quá trình nhuộm màu để tối Dung dịch Tetrazolium khơng để hở ngồi ánh sáng muối Tetrazolium bị khử Các hạt giống phải hoàn toàn ngập dung dịch tetrazolium Thời gian nhuộm màu loài khác nêu chi tiết phụ lục A (bảng A.1) - Thời gian nhuộm màu thích hợp 2h nhiệt độ 30°C ngũ cốc - Các hạt giống nhỏ khó thao tác tay hạt xà lách (Lactuca spp.) hạt cà chua (Lycopersicon spp.); cà chua lai (Lycopersicon hybrids) làm ẩm chuẩn bị dải giấy, cuộn lại ngâm vào dung dịch Tetrazolium 6.4 Đánh giá Mục đích phép thử Tetrazolium để phân biệt hạt có khả sống khơng có khả sống Quan sát bề mặt vết cắt để đánh giá nhuộm màu mơ Tùy vị trí mức độ nhuộm màu để xác định hạt giống có khả sống hạt khơng có khả sống a) Những hạt có khả sống: Những hạt có khả sống hạt khả sinh mầm bình thường Những hạt thế: - Phôi nhuộm thành màu đỏ hồn tồn - Phơi nhuộm màu khơng hồn tồn: Xem hướng dẫn phụ lục A (bảng A.2) b) Những hạt khơng có khả sống: Phơi khơng nhuộm đỏ nhuộm đỏ không đặc trưng Xem hướng dẫn phụ lục A (bảng A.2) phụ lục B (bảng B.2) Tính biểu thị kết 7.1 Tính kết Tính tỷ lệ phần trăm trung bình hạt có khả sống lần nhắc lại 100 hạt làm tròn đến số nguyên kết lần nhắc lại nằm khoảng sai số cho phép quy định phụ lục A (bảng A.3) 7.2 Sai số cho phép Kết phép thử xác định khả sống hạt giống đáng tin cậy sai khác lần nhắc cao thấp nằm giới hạn sai số cho phép, phép thử hai chiều mức ý nghĩa 2,5% quy định phụ lục A (bảng A.3.1) Kết thử nghiệm khả sống hạt giống phép thử tetrazolium mẫu khác mẫu gửi phòng kiểm nghiệm, phép thử hai chiều mức ý nghĩa 2,5% quy định phụ lục A (bảng A.3.2) Kết thử nghiệm khả sống hạt giống phép thử tetrazolium thực mẫu gửi khác phòng thí nghiệm khác nhau, phép thử chiều mức ý nghĩa 5% quy định phụ lục A (bảng A 3.3) Các kết tương thích sai khác tỉ lệ hạt có khả sống phép thử không vượt sai số cho phép 7.3 Báo cáo kết Kết phép thử xác định khả sống hạt giống Tetrazolium báo cáo tỷ lệ phần trăm trung bình hạt có khả sống tổng số hạt kiểm tra LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Hạt có khả sống biểu thị (% số hạt) Phụ lục A (Quy định) Trình tự thử A.1 Cách tiến hành phép thử Tetrazolium hạt giống số lồi trồng nơng nghiệp Cây trồng Làm ẩm trước 20°C Hình thức Thời gian tối thiểu (h) Chuẩn bị trước nhuộm Thời gian Bộ phận cần nhuộm quan sát thích hợp (h) Lúa (Oryza sativa) Ngâm nước 18 Cắt dọc qua phơi ¾ nội nnũ Quan sát bề mặt vết cắt Ngô (Zea mays) Ngâm nước 18 Cắt dọc qua phơi ¾ nội nhũ Quan sát bề mặt vết cắt Cây thuộc họ cải Brassica spp su hào, su lơ, cải dầu, cải thìa, cải xạnh, cải bẹ, cải bắp Ngâm nước 18 Rạch chéo phần vỏ bên mầm, tránh tổn thương thân mầm rễ mầm Loại bỏ vỏ hạt cách ấn nhẹ Quan sát phôi Yến mạch (Avena spp.) Loại bỏ mày trước làm ẩm; phương pháp giấy ngâm nước 18 Cắt hạt ngang gần phôi 18 Quan sát mặt ngồi phơi Cắt dọc qua phơi ¾ nội nhũ Quan sát: mặt ngồi phơi; mặt vết cắt; phía sau scutellum Dưa bở, dưa gang, Ngâm nước dưa chuột (Cucumis spp.) 18 Cắt ngang phần nhỏ ngoại biên hạt Cắt dọc bên qua vỏ hạt Loại bỏ vỏ hạt lớp màng mỏng bên Quan sát phôi Hạt hướng dương (Helianthus spp.) Ngâm nước 18 Loại bỏ vỏ vỏ hạt Cắt dọc qua mầm, rễ mầm thân mầm Quan sát hai phía hạt Hạt sen (Lotus spp.) Ngâm nước 18 Để nguyên hạt 18 Loại bỏ vỏ hạt để làm hở phôi Xà lách (Lactuca spp.) Chuẩn bị hạt khơ, cắt dọc ¼ qua ngoại biên (quả bế) Ngâm nước 18 Làm hở phôi cách ấn nhẹ vào vỏ hạt Quan sát phôi Cà chua Ngâm nước (Lycopersicon spp.); cà chua lai (Lycopersicon hybrids) 18 Cắt mầm thân mầm 1/3 qua nội nhũ 18 Cắt phẳng mặt hạt thành hai nửa Quan sát bề mặt cắt LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê Cây trồng Lúa mạch đen (secale cereale) www.luatminhkhue.vn Làm ẩm trước 20°C Chuẩn bị trước nhuộm Cắt phôi với scutellum Thời gian Bộ phận cần nhuộm quan sát Quan sát: Bề thích hợp mặt ngồi (h) phơi; phía sau scutellum Ngâm nước Ngâm nước 18 Cắt dọc qua phôi ¾ nội nhũ Bề mặt ngồi phơi; bề mặt vết cắt; phía sau scutellum Cao lương (Sorghum spp.) Ngâm nước 7°C 18 Cắt dọc qua phôi ¼ nội nhũ Bề mặt cắt Lúa mì (Triticum spp.) Ngâm nước Cắt phôi với scutellum Quan sát: bề mặt ngồi phơi; phía sau scutellum Ngâm nước 18 Cắt dọc qua phôi ¾ nội nhũ Quan sát: bề mặt phơi; bề mặt vết cắt; phía sau scutellum Lúa mạch (Hordeum Ngâm nước vulgare) Cắt phôi với scutellum Quan sát: mặt ngồi phơi; phía sau scutellum 18 Cắt dọc qua phơi ¾ nội nhũ Quan sát: mặt ngồi phơi; mặt vết cắt; phía sau scutellum A.2 Hướng dẫn đánh giá số trồng STT Lồi trồng nơng nghiệp Tế bào khơng có khả sống phép Lúa (Oryza sativa) 2/3 rễ mầm Ngô (Zea mays) Rễ sơ cấp, tổng số 1/3 diện tích phần mép scutellum Cây thuộc họ cải Brassica spp su 1/3 rễ mầm, đo từ đầu rễ mầm, 1/3 mô thối bề hào, su lơ, cải dầu, cải thìa, cải xanh, mặt mầm khơng tiếp nối với trụ mầm cải bẹ, cải bắp Yến mạch (Avena spp.) Diện tích rễ trừ đầu rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép scutellum Dưa bở, dưa gang, dưa chuột (Cucumis 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh rễ, ½ diện tích ngoại biên spp.) mầm Hạt hướng dương (Helianthus spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh rễ, ½ phía xa mầm bề mặt Hạt sen (Lotus spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh rễ, ½ phía xa mầm bề mặt Xà lách (Lactuca spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh rễ, ½ diện tích ngoại biên mầm bề mặt; 1/3 diện tích ngoại biên vết thối khơng lan rộng Cà chua (Lycopersicon spp.); cà chua laiKhông (Lycopersicon hybrids) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê STT www.luatminhkhue.vn Loài trồng Tế bào khơng có khả sống phép 10 Lúa mạch đen (secale cereale) Diện tích rễ, trừ phần đầu rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép scutellum 11 Cao lương (Sorghum spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh 12 Lúa mì (Triticum spp.) Diện tích rễ, trừ phần đầu rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép scutellum 13 Lúa mạch (Hordeum vulgare) Diện tích rẽ trừ đầu rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép scutellum A.3 Bảng sai số cho phép Các sai số cho phép tính tốn dựa vào sai số thí nghiệm quy định Bảng A.3.1, A.3.2, A.3.3 Bảng A.3.1: Bảng sai số cho phép lần nhắc 100 hạt phép thử Tetrazolium (phép thử chiều mức ý nghĩa 2,5%) Tỷ lệ hạt có khả sống trung bình (%) Sai số cho phép (hạt) Tỷ lệ hạt có khả sống trung bình (%) Sai số cho phép (hạt) 99 87 - 88 13 - 14 13 98 84 - 86 15 - 17 14 97 81 - 83 18 - 20 15 96 78 - 80 21 - 23 16 95 73 - 77 24 - 28 17 93 - 94 7-8 10 67 - 72 29 - 34 18 91 - 92 - 10 11 56 - 66 35 - 45 19 89 - 90 11 - 12 12 51 - 55 46 - 50 20 Bảng A.3.2: Bảng sai số cho phép kết thử khả sống tetrazolium 400 hạt khác mẫu gửi, phép thử thực phịng thí nghiệm (phép thử hai chiều mức ý nghĩa 2,5%) Tỷ lệ hạt có khả sống trung bình (%) Sai số cho phép (hạt) Tỷ lệ hạt có khả sống trung bình (%) Sai số cho phép (hạt) 98 - 99 2-3 83 - 88 13 - 18 96 - 97 4-5 75 - 82 19 - 26 93 - 95 6-8 58 - 74 27 - 43 89 - 92 - 12 51 - 57 44 - 50 Bảng A.3.3: Bảng sai số cho phép kết thử khả sống tetrazolium hai mẫu gửi khác phịng thí nghiệm khác nhau, mẫu 400 hạt (phép thử chiều mức ý nghĩa 5%) Tỷ lệ hạt có khả sống trung bình (%) Sai số cho phép (hạt) Tỷ lệ hạt có khả sống trung bình (%) Sai số cho phép (hạt) 99 86 - 88 13 - 15 11 98 82 - 85 16 - 19 12 97 78 - 81 20 - 23 13 95 - 96 5-6 73 - 77 24 - 28 14 93 - 94 7-8 65 - 72 29 - 36 15 91 - 92 - 10 51 - 64 37 - 50 16 89 - 90 11 - 12 10 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Phụ lục B (Tham khảo) Hướng dẫn thao tác cách đọc kết B.1 Phương pháp làm hở mô trước nhuộm Cắt đôi dọc qua phơi khoảng ¾ nội nhũ hạt ngũ cốc Cắt ngang - rạch ngang gần phôi Cắt dọc qua phần nội nhũ xa phôi hạt cỏ Chọc nội nhũ hạt cỏ Cắt dọc qua nửa mầm xa phơi, ví dụ hạt xà tách (Lactuca spp.), hạt thuộc họ Asteraceae (Compositae) Phần cắt dọc cho thấy vị trí dao thực cắt hình Cắt dọc sát cạnh phơi (Các lồi thuộc họ Apiaceae (Umbelliferae) lồi khác có phơi thẳng Cắt dọc sát cạnh phôi hạt giống kim Cắt dọc đầu để hở khoang phôi loại bỏ phần nội nhũ (mô đơn bội) B.2 Cách nhận biết hạt có khả sống hạt khơng có khả sống (đại diện hạt giống thuộc họ ngũ cốc) Hạt có khả sống Cột I: nhuộm màu hồn tồn, hạt có khả sống Hạt khơng có khả sống Cột I, II, III, IV: lớn 2/3 rễ mầm không nhuộm màu, hạt khơng có khả sống Cột II, III: rễ mầm, phôi không nhuộm màu phần (tối đa < 2/3 rễ mầm khơng nhuộm màu), hạt có khả Cột V: Phơi khơng nhuộm màu hồn tồn sống Thư mục tài liệu tham khảo [1] Chương 6, Điều lệ kiểm nghiệm hạt giống Quốc tế, ISTA 2011; Thử nghiệm khả sống sinh hóa, phép thử Tetrazolium LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162