GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC CHỦNG 2512

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8683-16:2017 GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC CHỦNG 2512 Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 16: The procedure for preservation of gumboro virus, 2512 strain, living Lời nói đầu TCVN 8683-16 : 2017 Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 8683 Giống vi sinh vật thú y - Quy trình giữ giống gồm phần: - TCVN 8683-1 : 2011, Phần 1: Quy trình giữ giống vi rút dịch tả lợn qua thỏ, chủng C; - TCVN 8683-2 : 2011, Phần 2: Quy trình giữ giống vi rút cường độc dịch tả lợn, chủng Thạch môn; - TCVN 8683-3 : 2011, Phần 3: Quy trình giữ giống vi rút Newcastle, chủng hệ I; - TCVN 8683-4 : 2011, Phần 4: Quy trình giữ giống vi rút dại chủng cố định; - TCVN 8683-5 : 2011, Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2; - TCVN 8683-6 : 2011, Phần 6: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán vô độc, chủng 34 F2; - TCVN 8683-7 : 2011, Phần 7: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán cường độc, chủng 17JB; - TCVN 8683-8 : 2011, Phần 8: Quy trình giữ giống vi khuẩn phó thương hàn lợn, chủng SC.1; SC.2; SC.4 SC.5; - TCVN 8683-9 : 2011, Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, chủng PB.1, PB.2, P.52, PBU.1 PBU.2; - TCVN 8683-10 : 2011, Phần 10: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn nhược độc, chủng AVPS3; - TCVN 8683-11 : 2011, Phần 11: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn, chủng PS1; - TCVN 8683-12 : 2011, Phần 12: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng gà, chủng PA.1, PA.2; - TCVN 8683-13 : 2011, Phần 13: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn, chủng E.37, E.47 E.80; - TCVN 8683-14 : 2011, Phần 14: Quy trình giữ giống vi khuẩn ung khí thán, chủng CL.C1 CL.C2; - TCVN 8683-15 : 2017, Phần 15: Quy trình giữ giống vi rút viêm gan vịt cường độc; - TCVN 8683-16 : 2017, Phần 16: Quy trình giữ giống vi rút gumboro nhược độc chủng 2512; -TCVN 8683-17 : 2017, Phần 17: Quy trình giữ giống vi khuẩn bordetella bronchiseptica GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 16: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI RÚT GUMBORO NHƯỢC ĐỘC CHỦNG 2512 Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 16: The procedure for preservation of gumboro virus, 2512 strain, living CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình ni giữ giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 sử dụng công tác giữ giống, đánh giá chất lượng vắc xin chế phẩm sinh học, chẩn đoán, nghiên cứu giảng dạy Tài liệu viện dẫn Tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 8684 : 2011, vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y - Phép thử độ khiết Ký hiệu chữ viết tắt AGID Agar gel immunodiffussion AND Acid deribonucleic ARN Acid ribonucleic EID50 50 Egg Infective Dose CID50 50 Chicken infective dose SN Serum neutralization SPF Specific Pathogen Free TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverce Transcription Polymerase Chain Reaction Nguyên tắc Lấy giống vi rút Gumbro nhược độc giữ dạng đơng khơ để kiểm tra đặc tính sinh học giống phương pháp phân tích phịng thí nghiệm Giống bồi dưỡng cách cấy truyền tế bào xơ phôi gà lớp, sau 48 h đến 72 h, giống thu hoạch, giám định vi rút phương pháp RT-PCR, giống vi rút Gumbro nhược độc đạt yêu cầu đông khô bảo quản quản nhiệt độ âm 80 °C Vật liệu thuốc thử 5.1 Vật liệu 5.1.1 Giống vi rút Gumbro nhược độc chủng 2512 thuộc serotype 1, họ Birnaviridae, đông khô với lượng giống 0,1 ml/lọ với hiệu giá vi rút 10 TCID50/0,1 ml, kiểm tra vơ trùng, khiết, tính an tồn, tính miễn dịch, tính nhân lên vi rút 5.1.2 Gà 14 ngày tuổi (gà khỏe mạnh, khơng có kháng thể kháng vi rút Gumboro, có nguồn gốc từ đàn gà bố mẹ khỏe mạnh) 5.1.3 Tế bào xơ phôi gà lớp đĩa nhựa đáy phẳng 96 giếng chai Flash T25 T75 5.1.4 Trứng gà SPF có phơi từ ngày tuổi đến 11 ngày tuổi 5.1.5 Giống vi rút Gumboro cường độc 5.2 Thuốc thử 5.2.1 Dung dịch PBS pH 7,2 (xem phụ lục A) 5.2.2 Môi trường nuôi cấy tế bào 5.2.3 Thạch Agar 5.2.4 Huyết dương tính chuẩn (với Gumboro) 5.2.5 Kháng nguyên chuẩn (với Gumboro) 5.2.6 Huyết âm tính chuẩn (với Gumboro) 5.2.7 Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR 5.2.8 Các loại kháng sinh Penicillin (200 Ul/ml), Streptomycin (200 μg/ml) 5.2.9 Sữa bò tách bơ 10% (xem phụ lục A) Xem Phụ lục A mô tả dung dịch thuốc thử Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm thơng thường cụ thể sau: 6.1 Tủ lạnh (có thể trì nhiệt độ từ °C đến °C), tủ lạnh sâu (có thể trì nhiệt độ âm 80 °C) 6.2 Tủ ấm CO2 trì nhiệt độ 37 °C 6.3 Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm 6.4 Máy khuấy từ có tốc độ khuấy tới 2400 vịng/phút 6.5 Nồi cách thủy trì nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C thời gian 10 min, 15 min, 20 6.6 BSC II màng lọc ULPA với hiệu suất lọc 99,99% hạt có kích thước 0,1 - 0,3 mm 6.7 Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc tới 12 000 g 6.8 Máy đông khô có nhiệt độ âm sâu tới âm 80 °C 6.9 Máy RT-PCR 6.10 Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR hãng Fermentas Bio-Rad 6.11 Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ) 6.12 Máy tính phần mềm sinh - tin học 6.13 Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl 6.14 Micropipet đa kênh, dung tích từ μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl 6.15 Chai nuôi cấy tế bào T25, T75 6.16 Đầu tip phù hợp với micropipet 6.17 Đèn soi trứng 6.18 Tủ ấp trứng trì nhiệt độ 37 °C 6.19 Cốc có mỏ, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml 1000 ml 6.20 Bộ cối chày sứ vô trùng 6.21 Lọ đông khô giống vô trùng 6.22 Đĩa Petri vô trùng 6.23 Dao, kéo, panh kẹp vô trùng 6.24 Chai Schott vô trùng 100 ml, 200 ml, 500ml Yêu cầu giống vi rút Gumboro nhược độc 7.1 Yêu cầu kỹ thuật ống giống - Lọ kín, khơng rạn nứt, đảm bảo chân không - Hợp chất ống giống xốp, màu đồng nhất, độ ẩm 4% hịa tan hồn tồn nước sinh lý sau 7.2 Yêu cầu sinh học giống - Giống vi rút đảm bảo vô trùng (không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc), đảm bảo khiết (không bị tạp nhiễm Mycoplasma, Salmonella vi rút ngoại lai) - Giống vi rút nhận dạng phương pháp RT-PCR (xuất vạch giống mẫu đối chứng dương) phản ứng kết tủa khuếch tán thạch (vi rút kết tủa với kháng huyết đặc hiệu tạo thành đường kết tủa màu trắng) - Hiệu giá vi rút giống phải đạt 103 TCID50/0,1 ml - Giống vi rút kiểm tra tính an tồn gà (khi nhỏ giống vi rút cho gà gà sống khỏe, khơng có biểu triệu chứng lâm sàng bệnh Gumboro) - Giống vi rút kiểm tra khả nhân lên vi rút môi trường tế bào xơ phôi gà lớp (sau 48 h đến 72 h gây nhiễm, vi rút nhân lên phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào) - Giống vi rút kiểm tra tính gây miễn dịch phương pháp cơng cường độc phương pháp trung hòa Cách tiến hành 8.1 Nhận dạng giống Chọn phương pháp sau: 8.1.1 Nhận dạng vi rút phản ứng kết tủa khuếch tán thạch AGID Giống vi rút (5.1.1) nhận dạng phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch thạch (AGID) Vi rút (5.1.1) kết tủa với kháng huyết đặc hiệu tạo thành đường kết tủa màu trắng thực phản ứng kết tủa khuếch tán miễn dịch thạch (xem phụ lục C) 8.1.2 Nhận dạng vi rút phương pháp RT- PCR Giống vi rút (5.1.1) nhận dạng phương pháp RT - PCR (tham khảo phụ lục F) 8.2 Kiểm tra vô trùng 8.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684:2011 8.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc Theo TCVN 8684:2011 8.3 Kiểm tra khiết 8.3.1 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma Theo TCVN 8684:2011 8.3.2 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella Theo TCVN 8684:2011 8.3.3 Kiểm tra vi rút ngoại lai Kiểm tra tạp nhiễm vi rút Cúm gia cầm tiến hành phản ứng RT-PCR (tham khảo phụ lục B) 8.4 Chuẩn độ vi rút Chuẩn độ giống vi rút (5.1.1) môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp (5.1.3) thực nhựa 96 giếng đáy (xem phụ lục D) Giống đạt yêu cầu hiệu giá vi rút giống phải đạt 103 TCID50/0,1 ml 8.5 Kiểm tra tính an tồn 8.5.1 Chuẩn bị - 10 gà (5.1.2) - Giống vi rút (5.1.1) chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha loãng với PBS (5.2.1) thành nồng độ 10 -3 8.5.2 Cách tiến hành Nhỏ mắt, mũi cho uống gà 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) pha loãng Theo dõi biểu triệu chứng lâm sàng gà vòng 21 ngày 8.5.3 Đánh giá kết Giống vi rút (5.1.1) coi an toàn khi: Sau 21 ngày nhỏ giống vi rút (5.1.1) 10/10 gà (5.1.2) sống khỏe, khơng có biểu triệu chứng lâm sàng bệnh Gumboro Toàn gà thí nghiệm bị giết kiểm tra bệnh tích, khơng có gà thí nghiệm có bệnh tích bệnh Gumboro Ghi chú: - Triệu chứng điển hình bệnh Gumboro: Gà quay đầu tự mổ vào hậu mơn, gà có dấu hiệu hoảng loạn có tiếng kêu khác thường Sau ngày đến ngày gà bị ỉa chảy, phân loãng, nhiều nước, trắng, nhớt - Bệnh tích bệnh Gumboro: Xuất huyết đùi, ngực; thận lách sưng; túi Fabricius sưng, xuất huyết có dịch nhày xung quanh 8.6 Kiểm tra khả nhân lên vi rút Kiểm tra khả nhân lên giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 môi trường tế bào xơ phôi gà lớp (5.1.3) 8.6.1 Chuẩn bị - Tế bào xơ phôi gà lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6) - Giống vi rút (5.1.1) chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha lỗng với mơi trường ni cấy tế bào (5.2.2) thành nồng độ 103 TCID50/0,1 ml 8.6.2 Cách tiến hành - Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) chai T25 (6.15) có tế bào phát triển - Chia huyễn dịch giống vi rút pha vào chai nuôi cấy - Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) cho lượng môi trường cho vào lượng môi trường hút - Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào tủ ấm CO2 nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h - Hàng ngày kiểm tra phát triển vi rút bệnh tích tế bào kính hiển vi soi ngược 8.6.3 Đánh giá kết Giống vi rút (5.1.1) đạt yêu cầu khi: Sau 48 h đến 72 h gây nhiễm (8.6.2), vi rút nhân lên phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào - Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành khối, bong khỏi thành giếng 8.7 Kiểm tra tính gây miễn dịch Chọn phương pháp sau: 8.7.1 Phương pháp công cường độc 8.7.1.1 Chuẩn bị - 20 gà (5.1.2) - Giống vi rút (5.1.1) chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha lỗng với mơi trường nuôi cấy (5.2.2) thành nồng độ 10 TCID50/0,1 ml 8.7.1.2 Cách tiến hành - 20 gà (5.1.2) chia làm nhóm: + Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) nhỏ mắt, mũi cho uống 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) pha loãng + Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) nhỏ mắt, mũi cho uống 0,1 ml PBS (5.2.1) - Sau 14 ngày hai nhóm gà cơng cường độc giống vi rút Gumboro cường độc (5.1.5) liều 102 CID50/0,1 ml - Theo dõi đàn gà từ 24 h đến 72 h sau công cường độc Tồn gà thí nghiệm bị giết kiểm tra bệnh tích 8.7.1.3 Đánh giá kết - Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn tính gây miễn dịch khi: + Nhóm miễn dịch 80% gà khơng có bệnh tích bệnh Gumboro + Nhóm đối chứng 80% gà có bệnh tích bệnh Gumboro xuất huyết đùi, sưng, xuất huyết có dịch túi Fabricius 8.7.2 Phương pháp trung hịa (SN) 8.7.2.1 Chuẩn bị - 20 gà (5.1.2) - Giống vi rút (5.1.1) chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha lỗng với mơi trường ni cấy (5.2.2) thành nồng độ 10 TCID50/0,1 ml 8.7.2.2 Cách tiến hành - 20 gà (5.1.2) chia làm nhóm: + Nhóm miễn dịch: 10 gà (5.1.2) nhỏ mắt, mũi cho uống 0,1 ml giống vi rút (5.1.1) pha lỗng + Nhóm đối chứng: 10 gà (5.1.2) nhỏ mắt, mũi cho uống 0,1 ml PBS (5.2.1) - Sau 21 ngày hai nhóm gà lấy máu, chắt huyết kiểm tra hiệu giá kháng thể Gumboro phản ứng trung hòa (SN) (xem phụ lục E) 8.7.2.3 Đánh giá kết - Giống vi rút Gumboro (5.1.1) đạt tiêu chuẩn tính gây miễn dịch khi: + Nhóm miễn dịch 80% mẫu huyết kiểm tra đạt hiệu giá kháng thể trung hịa ≥ 1:256 + Nhóm đối chứng mẫu huyết kiểm tra âm tính 8.8 Bồi dưỡng giống vi rút 8.8.1 Tiêm truyền giống - Giống vi rút (5.1.1) chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 80 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha lỗng với mơi trường ni cấy (5.2.2) thành nồng độ 10 TCID50/0,1 ml - Tế bào xơ phôi gà lớp (5.1.3) (xem phụ lục A.6) - Dùng pipette hút bỏ môi trường nuôi cấy (5.2.2) chai T75 (6.15) có tế bào phát triển Lưu ý, trình hút tránh làm bong tế bào - Chia huyễn dịch giống vi rút pha vào chai nuôi cấy - Bổ sung môi trường nuôi cấy (5.2.2) cho lượng môi trường cho vào lượng môi trường hút - Tiếp tục nuôi cấy chai tế bào tủ ấm CO2 nhiệt độ 37 °C từ 48 h đến 72 h - Hàng ngày kiểm tra phát triển vi rút bệnh tích tế bào kính hiển vi soi ngược 8.8.2 Thu hoạch giống - Sau gây nhiễm (8.8.1) 48 h đến 72 h, vi rút nhân lên phá hủy ≥ 80% diện tích tế bào tiến hành thu hoạch huyễn dịch vi rút vào chai vô trùng (6.24) - Chọn chai tế bào có cấy vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 đạt tiêu vơ trùng có hiệu giá vi rút ≥ 106 TCID50 - Trước đông khô phải tiến hành kiểm tra huyễn dịch vi rút phản ứng RT - PCR (tham khảo phụ lục F) chuẩn độ vi rút môi trường tế bào (xem phụ lục D) để kiểm tra diện vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 - Sau kiểm tra diện vi rút, huyễn dịch vi rút bảo quản nhiệt độ âm 70 °C chờ đông khô 8.9 Đông khô giống vi rút - Pha huyễn dịch vi rút (8.8.2) với sữa bò tách bơ (5.2.9) chia vào lọ đông khô (6.21) Giữ nhiệt độ âm 80 °C từ h đến 12 h chuyển vào máy đông khô (6.8) - Chạy đơng khơ theo quy trình máy đơng khơ Kiểm tra ống giống vi rút sau đông khô 9.1 Kiểm tra đặc tính kỹ thuật ống giống - Cảm quan: Quan sát mắt thường, ống giống vi rút coi đạt yêu cầu lọ kín, khơng rạn nứt, chế phẩm xốp, màu đồng - Chân không: Sử dụng máy đo chân không, ống giống vi rút coi đạt yêu cầu phát huỳnh quang màu ánh tím - Độ ẩm: Sử dụng máy đo độ ẩm, ống giống vi rút coi đạt yêu cầu độ ẩm 4% - Độ hòa tan: ống giống vi rút coi đạt u cầu hịa tan hồn tồn nước sinh lý sau có lắc nhẹ 9.2 Kiểm tra đặc tính sinh học giống vi rút Đạt tiêu mục 10 Bao gói, bảo quản ống giống vi rút sau đông khô Chọn ống giống đạt tiêu mục để dán nhãn, bao gói bảo quản: 10.1 Dán nhãn - Các ống giống vi rút phải dán nhãn - Nhãn phải có thơng tin sau: + Nơi sản xuất + Tên giống + Số lô ngày tháng năm sản xuất + Người thực + Điều kiện bảo quản 10.2 Bao gói bảo quản Ống giống bao gói giấy, để túi Polyeste giữ nhiệt độ âm 80 °C năm Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịch PBS pH 7,2 Natri clorua (NaCl) 8g Kali clorua (KCI) 2g Natri hiđrophotphat (Na2HPO4) 1,15 g Mono kaliphotphat (KH2PO4) 0,2 g Nước 1000 ml Chỉnh pH đến 7,2 dung dịch NaOH 1N dung dịch HCl 1N Hấp tiệt trùng nhiệt độ 121 °C h Bảo quản nhiệt độ °C A.2 Dung dịch sữa bò tách bơ 10% Sữa bò tách bơ PBS 10 g PBS 90 ml 90 ml Đun sôi PBS để nguội đến nhiệt độ 50 °C đến 70 °C cho sữa bò tách bơ vào, lắc cho sữa tan hết A.3 Kháng nguyên chuẩn - Gây nhiễm giống cường độc Gumboro cho gà mẫn cảm (3 tuần tuổi đến tuần tuổi) nhỏ vào mắt mũi gà 200 μl (102CID50) - Sau 03 ngày gây nhiễm thu hoạch túi Fabricius, nghiền túi Fabricius có bệnh tích điển hình nước sinh lý với tỷ lệ 1:10 (1g túi Fabricius : ml PBS pH 7,2) - Ly tâm 1500 r/min - Giải đông tan lần đến lần - Ly tâm 3000 r/min 15 thu lấy nước trên, bỏ cặn Chia ống nhỏ, bảo quản âm 70 °C - Cũng dùng giống Gumboro cường độc tiêm vào màng niệu nang phôi gà ngày đến 10 ngày thu hoạch phôi nước niệu nang phơi chết vịng 48 h đến 96 h sau tiêm, trộn xử lý A.4 Chế tạo huyết dương tính chuẩn - Dùng gà trống choai khỏe mạnh (4 tuần tuổi đến tuần tuổi, khơng có kháng thể kháng vi rút Gumboro) - Nhỏ mắt mũi cho gà 200 μl giống Gumboro cường độc (nồng độ 10 -1) - Sau ngày nhỏ tiếp 200 μl giống Gumboro cường độc (nồng độ 10 -1) lần - Nhỏ tiếp lần lần cách ngày - Sau lần nhỏ lần 4, 28 ngày lấy máu gà để lấy huyết thanh, chia ống bảo quản nhiệt độ âm 20 °C dùng dần (thời gian bảo quản năm) A.5 Huyết âm tính chuẩn - Lấy huyết gà khỏe mạnh chưa tiêm phòng vắc xin Gumboro - Dùng kháng nguyên Gumboro chuẩn: Để xác định kháng thể huyết đàn gà cần kiểm tra (xác định mức độ kháng thể đàn gà miễn dịch) - Chuẩn bị đĩa thạch: Dùng dung dịch PBS 0.01 M (pH7.2) cho thêm 8% muối NaCI, 1% thạch Agar, 0.5 ml phenol đun cho tan thạch, đổ đĩa lồng đĩa 10 ml (thực vô trùng), để nguội cho đơng lại, đục lỗ trịn đĩa thạch, lỗ đĩa lỗ xung quanh, đường kính lỗ mm, lỗ cách mm - Cho thành phần phản ứng vào lỗ: Lỗ cho Kháng nguyên chuẩn, lỗ xung quanh lỗ 1-4 cho huyết cần kiểm tra lỗ cho huyết đối chứng dương lỗ cho huyết đối chứng âm Cho đĩa vào hộp để nhiệt độ 37 °C, quan sát ngày - Kết quả: Sau quan sát đối chứng dương đối chứng âm rõ ràng, quan sát lỗ thí nghiệm thấy lỗ thí nghiệm lỗ kháng ngun dương tính có vạch ngưng kết kết luận phản ứng dương tính, khơng có vạch ngưng kết giống đối chứng âm phản ứng âm tính A.6 Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp tiến hành theo bước sau: -Trứng gà SPF có phơi ấp ngày - Soi để chọn có phơi sống, khỏe - Giết chết phôi nhiệt lạnh để làm co mạch máu, sát trùng vỏ trứng, mổ trứng - Gắp phơi đĩa Petri có chứa PBS khơng bổ sung calcium, magnesium làm ấm nhiệt độ 37 °C - Rửa phôi lần PBS, cắt đầu, chân, loại bỏ nội tạng - Sau cắt nhỏ phôi rửa máy khuấy từ lần - Rửa tiếp dung dịch Trypsin 0,125% - Hút bỏ phần nước - Tiêu hóa tế bào dung dịch Trypsin 0,25% máy khuấy từ phòng ấm 37 °C từ 30 - 60 - Lọc tế bào qua lưới lọc ly tâm lạnh với tốc độ 2000 r/min - Chắt bỏ nước trong, dùng mơi trường phát triển để pha lỗng tế bào - Đếm tế bào buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào - Pha tế bào thành nồng độ 0,5% (tương đương 75 x 104 tế bào /ml), chia tế bào chai nuôi T25, T75 đĩa nhựa 96 giếng đáy phẳng đặt nuôi phịng ấm 37 °C Kích cỡ chai Lượng tế bào nuôi cấy (tế bào) Tổng lượng môi trường nuôi cấy (ml) T25 2.0 - 6,0 x 105 - ml T75 9.0 - 15.0 x 10 15 - 30 ml Cơng thức tính lượng tế bào diện nuôi cấy là: 1,0 - 1,4 x 104 tế bào/ 1cm2 - Hàng ngày quan sát phát triển tế bào xơ phôi gà chai tế bào kính hiển vi soi ngược Phụ lục B (Tham khâo) Phản ứng RT-PCR kiểm tra tạp nhiễm với vi rút cúm gia cầm B.1 Chiết tách ARN Chiết tách ARN kít, sử dụng theo hướng dẫn nhả sản xuất B.2 Tiến hành phản ứng RT-PCR Áp dụng cho Maxime RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology) Nguyên liệu Thể tích (μl) H2O Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCl KCl) OptiScript reverse transcriptase dNTP i-StarTaq DN A polymerase Mồi xuôi (10pmole/ μl) Mồi ngược (10pmole/ μl) Mẫu ARN Tổng cộng 20 Danh sách cặp mồi dùng cho phản ứng kiểm tra tạp nhiễm với vi rút Cúm gia cầm Mồi Trình tự chuỗi mối (5’ → 3’) H5-155F 5'-ACACATGCYCARGACATACT-3' H5-699R 5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3' N1-F 5'-AGRCCTTGYTTCTGGGTTGA-3' N1-R 5'-ACCGTCTGGCCAAGACCA-3' Kích thước sản phẩm 545bp 126bp B.3 Chu trình nhân gen Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt độ (°C) Bước 1 chu kỳ 30 45 Bước chu kỳ 94 30 s 52 30 s 72 20 s 94 Bước 40 chu kỳ Bước chu kỳ 72 Bước chu kỳ ∞ B.4 Chạy điện di Chuẩn bị thạch agaroze 2% pha dung dịch TAE 1X TBE 1X có ethidi bromua (10 μg/μl) Đổ thạch vào khn điện di (có lược) Thạch khơ, rút lược cho mẫu vào giếng (8 μl sản phẩm PCR + μl dung dịch tải) Sử dụng thang chuẩn (Marker), trọng lượng phân tử thang 100 bp trở lên Chú ý chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm kèm (mẫu đối chứng âm nước cất sạch) B.5 Đọc kết Mẫu dương tính: Xuất vạch giống với mẫu đối chứng dương tính Mẫu âm tính: Khơng có vạch B.6 Đánh giá kết Có vi rút Cúm gia cầm mẫu chạy kết RT-PCR dương tính Phụ lục C (Quy định) Phương pháp kết tủa khuếch tán miễn dịch thạch AGID (Agar gel immunoffusion) C.1 Mục đích Sử dụng phản ứng AGID dùng để phát kháng nguyên Gumboro nhược độc chủng 2512 C.2 Nguyên tắc phản ứng AGID Phản ứng dương tính kháng nguyên kháng thể tương ứng, nằm cách khoảng thạch, chúng khuếch tán chỗ gặp hình thành đường kết tủa màu trắng Sự kết tủa xảy vùng mà tỷ lệ kháng nguyên kháng thể tương ứng đồng C.3 Chuẩn bị kháng nguyên Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha loãng với PBS thành nồng độ từ 10 -2 đến 10-4 C.4 Chuẩn bị thạch làm phản ứng + Hòa tan NaCl (8,0 g) Phenol (0,5 ml) vào nước cất Chú ý cho NaCl vào trước, sau cho Phenol + Chỉnh pH: 7,2 - 7,4 (dùng NaOH N/1) + Cho thạch Agar vào hấp + Lọc qua lần vải gạc + Chia đĩa làm phản ứng (chia 15 ml đĩa to đường kính cm, độ dày thạch mm) + Sau đổ đĩa để tủ lạnh h tiến hành đục lỗ thạch C.5 Cách tiến hành phản ứng phát kháng nguyên + Lỗ nhỏ kháng huyết dương tính chuẩn 0,025 ml + Các lỗ xung quanh nhỏ huyễn dịch giống pha nồng độ (C.3), có lỗ cho kháng ngun dương tính chuẩn lỗ cho PBS, lỗ nhỏ 0,025 ml + Để đĩa thạch làm phản ứng nhiệt độ phịng thí nghiệm hộp giữ ẩm + Đọc kết vòng từ 24 h đến 48 h (có thể cho phản ứng giả) C.6 Đọc kết Phản ứng dương tính có vạch kết tủa màu trắng đục, gọn, sắc nét, khơng có đường phụ Phụ lục D (Quy định) Phương pháp chuẩn độ vi rút D.1 Chuẩn bị - Chuẩn bị đĩa nhựa 96 giếng đáy có lớp tế bào xơ phơi gà - Môi trường tế bào DMEM - Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 D.2 Cách tiến hành - Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, hoàn nguyên trở lại với mơi trường ni cấy thành 1ml - Pha lỗng giống vi rút ống nghiệm theo số 10 môi trường nuôi cấy tế bào từ 10 -1 đến 10-8 - Lấy đĩa tế bào xơ phôi gà nuôi, loại bỏ môi trường cũ - Rửa tế bào mơi trường ni cấy, 200 μl/giếng, sau loại bỏ môi trường nuôi cấy - Hút 100 μl huyễn dịch vi rút pha loãng vào giếng tương ứng đĩa tế bào (từ A1 đến H5), dãy đối chứng tế bào (từ A6 đến H6),cho 100 μl mơi trường trì vào giếng Sơ đồ bố trí phản ứng chuẩn độ vi rút tế bào A 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 ĐCTB B 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 ĐCTB C 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 ĐCTB D 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 ĐCTB E 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 ĐCTB F 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 ĐCTB G 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 ĐCTB H 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 ĐCTB 10 11 12 - Ủ tế bào nhiệt độ 37 °C có 5% CO2 30 - Loại bỏ huyễn dịch giếng - Rửa tế bào môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, loại bỏ môi trường nuôi cấy - Cho 200 μl mơi trường trì vào giếng - Nuôi tế bào nhiệt độ 37 °C có 5% CO2, theo dõi hàng ngày, ngày D.3 Đánh giá kết Giếng có bệnh tích tế bào dương tính - Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành khối, bong khỏi thành giếng (hoặc chai nuôi cấy) - Tính tốn liều gây nhiễm 50% (TCID50) theo phương pháp Reed Muench, 1938: λ.TCID50 (0,1 ml) = X + 1/2- (Nx/n) Trong đó: X logarit số 10 độ pha lỗng vi rút có 100% giếng xuất bệnh tích tế bào Nx tổng số giếng có bệnh tích tế bào thí nghiệm n số giếng độ pha loãng λ độ pha loãng vi rút - Kết quả: Giống vi rút coi đạt liều vắc xin có 10 3TCID50 Phụ lục E (Quy định) Phản ứng trung hịa E.1 Chuẩn bị tế bào xơ phơi gà đĩa 96 giếng đáy Xem phụ lục A.6 E.2 Chuẩn bị vi rút Giống vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 chuyển từ nhiệt độ bảo quản âm 70 °C sang nhiệt độ từ °C đến °C khoảng đến 10 min, pha lỗng với mơi trường ni cấy thành nồng độ 103TCID50/0,1 ml E.3 Chuẩn bị huyết Toàn gà thí nghiệm lấy máu để chắt huyết thanh, huyết chắt xong bảo quản nhiệt độ âm 20 °C E.4 Cách tiến hành - Pha loãng mẫu huyết miễn dịch theo số 2, từ 1/2 đến 1/1028 môi trường nuôi cấy tế bào - Trung hòa: Lấy 100 μl huyết pha loãng nồng độ bổ sung 100 μl huyễn dịch vi rút có chứa 103 TCID50, ủ 30 nhiệt độ phòng - Hút bỏ dịch nuôi dĩa tế bào: Hút 100 μl huyễn dịch huyết - vi rút trung hòa vào giếng đĩa tế bào tương ứng theo sơ đồ: Sơ đồ bố trí phản ứng trung hịa 10 11 12 Huyết pha loãng A ĐCTB Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 10 ĐCVR 1/8 B ĐCTB ĐCVR 1/16 C ĐCTB ĐCVR 1/32 D ĐCTB ĐCVR 1/64 E ĐCTB ĐCVR 1/128 F ĐCTB ĐCVR 1/256 G ĐCTB ĐCVR 1/512 H ĐCTB ĐCVR 1/1028 ĐCTB: Đối chứng tế bào ĐCVR: Đối chứng vi rút - Ủ tế bào nhiệt độ 37 °C có 5% CO2 60 - Loại bỏ huyễn dịch giếng - Rửa tế bào môi trường nuôi cấy, 200 μl/giếng, loại bỏ môi trường nuôi cấy - Cho 200 μl mơi trường trì vào giếng - Ni tế bào tủ ấm CO2 nhiệt độ 37 °C, theo dõi ngày E.5 Đọc kết Giếng có bệnh tích tế bào dương tính (khơng có kháng thể kháng Gumboro) Giếng khơng có bệnh tích tế bào âm tính (có kháng thể kháng Gumboro) - Bệnh tích tế bào: Các tế bào vỡ ra, co cụm thành khối, bong khỏi thành giếng (hoặc chai nuôi cấy) - Kết quả: Huyết đạt hiệu giá 1/256 Phụ lục F (Tham khảo) Phản ứng RT-PCR phát vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 F.1 Chiết tách ARN Chiết tách ARN kít, sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất F.2 Tiến hành phản ứng RT-PCR Áp dụng cho Maxime RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology) Nguyên liệu Thể tích (μl) H2O Dung dịch đệm RT- PCR (Tris/HCI KCI) OptiScript reverse transcriptase dNTP i-StarTaq DN A polymerase Mồi xuôi (10pmole/ μl) Mồi ngược (10pmole/ μl) Mẫu ARN Tổng cộng 20 Danh sách cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR phát vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 Tên mồi Nồng độ sử dụng Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’) GVF(Kz2) CCGGAATTCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGA GKZF 10pM CCGGAATTCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGAT 10pM GSALR GAATCCCGTCGACTACAGGATTCTG 10pM GSALF CAGAATCCYGTAGTCGACGGGATTC 10pM GNOR ATAAGAATGCGGCCGCTTATCACTCAAGGTCCTCA 10pM G908F GCCAATCACATCCATCAAACTG 10pM GV2R ATAAGAATGCGGCCGCTCATTACCTCCTTATGGCCCGGATTATGTC 10pM F.3 Chu trình nhân gen Bước Chu kỳ Thời gian Nhiệt độ (°C) Bước 1 chu kỳ 30 45 Bước chu kỳ 94 30 s 52 30 s 72 20 s 94 Bước 40 chu kỳ Bước chu kỳ 72 Bước chu kỳ ∞ F.4 Chạy điện di Chuẩn bị thạch agaroze 2% pha dung dịch TAE 1X TBE 1X có ethidi bromua (10 μg/μl) Đổ thạch vào khn điện di (có lược) Thạch khơ, rút lược cho mẫu vào giếng (8 μl sản phẩm PCR + μl dung dịch tải) Sử dụng thang chuẩn (Marker), trọng lượng phân tử thang 100 bp trở lên Chú ý chạy PCR phải có mẫu đối chứng dương mẫu đối chứng âm kèm (mẫu đối chứng âm nước cất sạch) F.5 Đọc kết Mẫu dương tính: Xuất vạch giống với mẫu đối chứng dương tính Mẫu âm tính: Khơng có vạch F.6 Đánh giá kết Có vi rút Gumboro nhược độc chủng 2512 mẫu chạy kết RT-PCR dương tính Thư mục tài liệu tham khảo [1] OIE 2015: Chapter 2.3.12: Infectious Bursal Disease (Gumboro disease) [2] Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dựng danh mục giống vi rút gia cầm Quốc gia - Mục 3.3 - Phương pháp nghiên cứu - Mục 3.1.3 - Nguyên liệu hóa chất - Mục 3.3.4 - Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà lớp, Mục 3.3.5 Phương pháp gây nhiễm vi rút, Mục 3.3.6 - Phương pháp chuẩn độ vi rút, Mục 3.3.18 Phương pháp giải trình tự gen vi rút [3] Bệnh truyền nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế - Nhà xuất nông nghiệp - Bệnh Gumboro (Gumboro disease, Infectious Bursal Disease) - Trang 387-395