ẢNH HƯỞNG của môi TRƯỜNG đến SINH TRƯỞNG và TÍCH lũy ASTAXANTHIN của h PLUVIALIS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN BẢO XUYÊN ẢNH HƯỞNG CỦA MƠI TRƯỜNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY ASTAXANTHIN CỦA H.PLUVIALIS ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 09/2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN BẢO XUYÊN ẢNH HƯỞNG CỦA MƠI TRƯỜNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY ASTAXANTHIN CỦA H.PLUVIALIS ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Nguyễn Văn B Thành phố Hồ Chí Minh – 09/2021 i LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn B, người tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Trường, Phịng Đào tạo, thầy cô Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Qua đây, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ tơi thời gian thực khóa luận Tp Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 10 năm 2021 SINH VIÊN Trần Bảo Xuyên ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục từ viết tắt iv Danh mục bảng iv MỞ ĐẦU I Lí chọn đề tài II Mục tiêu nghiên cứu III Đối tượng nghiên cứu IV Nhiệm vụ nghiên cứu V Phạm vi nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 1.1 Lược sử nghiên cứu vi tảo H.pluvialis nước 1.1.1 Các nghiên cứu nước 1.1.2 Các nghiên cứu quốc tế 1.2 Astaxanthin 1.2.1 Cấu trúc phân tử 1.2.1.1 Đồng phân 1.2.1.2 Dạng ester hóa khơng ester hóa 1.2.2 Sinh tổng hợp 1.2.3 Nguồn tổng hợp 1.3 Vi tảo Haematococcus pluvialis 1.3.1 Vị trí phân loại phân bố iii 1.3.2 Hình thái, đặc điểm cấu tạo 1.3.3 Điều kiện tăng trưởng 1.4 Môi trường nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis 1.4.1 Môi trường BBM 1.4.1.1 Tổng quan 1.4.1.2 Thuộc tính 1.4.1.3 Thành phần 1.4.2 Môi trường OHM 1.4.2.1 Tổng quan 1.4.2.2 Thành phần 1.4.3 Môi trường RM 1.4.4 Môi trường f/2 Guillard 1.4.4.1 Tổng quan 1.4.4.2 Thành phần 1.4.5 Môi trường Walne 10 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Thời gian, địa điểm tư liệu nghiên cứu 10 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 10 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 10 2.1.3 Tư liệu nghiên cứu 11 2.2 Phương pháp khảo sát môi trường nuôi cấy vi tảo H pluvialis 11 2.3 Tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo 12 iv 2.4 Phân tích astaxanthin thu nhận từ sinh khối vi tảo H pluvialis nuôi cấy hệ thống bioreactor phương pháp sắc ký mỏng sắc ký lỏng hiệu cao 12 2.5 Xử lý số liệu 12 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 13 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu BBM DME HPLC OHM RM TLC TL-PSBRs Chú giải Bold’s Basal medium Dimethyl ether High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Optimal Haematococcus medium Rudic’s medium Thin Layer Chromatography Sắc ký mỏng Twin-layer porous substrate photobioreactor DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần môi trường BBM (theo Nichols Bold, 1965) Bảng 1.2 Thành phần môi trường OHM (theo J Fábregas cộng sự, 2011) Bảng 1.3 Thành phần môi trường RM (theo Esra Imamoglu cộng sự, 2007) Bảng 1.4 Thành phần môi trường f/2 Guillard (theo Kyong-Hwa Kang cộng sự, 2011) Bảng 1.5 Thành phần môi trường Walne (theo Võ Minh Sơn, 2016) 10 MỞ ĐẦU I LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Astaxanthin sắc tố màu đỏ thuộc nhóm hóa chất carotenoid Astaxanthin xuất tự nhiên số loại tảo, tạo màu hồng đỏ cho cá hồi, tôm loại hải sản khác Astaxanthin chất chống oxy hóa Chính tính chống oxy hóa astaxanthin, mà người ta cho astaxanthin bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại, cải thiện cách hoạt động hệ miễn dịch Nếu astaxanthin giúp da khỏe mạnh hơn, tăng sức bền, sức khỏe tim mạch, giảm đau khớp, chí điều trị ung thư tương lai Hiện nay, astaxanthin tự nhiên thu cách nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis hệ thống nuôi huyền phù cố định Tuy nhiên, số nghiên cứu trước nêu việc ảnh hưởng số hoạt chất định môi trường nuôi cấy mà chưa đưa kết luận, thống môi trường nuôi cấy nào, tỉ lệ nồng độ chất thích hợp cho việc ni cấy H.pluvialis để sản xuất astaxanthin tự nhiên Vì vậy, đề tài nghiên cứu này, thực nghiên cứu để tìm mơi trường ni cấy phù hợp cho việc nuôi cấy H.pluvialis để sản xuất astaxanthin tự nhiên II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phát mơi trường thích hợp cho việc nuôi cấy H.pluvialis để sản xuất astaxanthin tự nhiên Tìm tỉ lệ nồng độ chất nuôi cấy khiến H.pluvialis tăng trưởng tối đa, nhằm tăng hiệu suất sản xuất astaxanthin Tìm phương pháp tối ưu cho việc sản xuất astaxanthin quy mô công nghiệp III ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu khóa luận môi trường nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis (các môi trường BBM, OHM, RM, f/2 Guillard Walne) 2 IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU Xác định số đặc điểm sinh lý phát triển vi tảo Haematococcus pluvialis nhằm lựa chọn môi trường nuôi cấy tối ưu Xác định hiệu suất sản xuất astaxantin tự nhiên H.pluvialis thời điểm nghiên cứu V PHẠM VI NGHIÊN CỨU Phạm vi nghiên cứu khóa luận ảnh hưởng mơi trường ni cấy vi tảo Haematococcus pluvialis (bao gồm độ pH, nồng độ nitrate chất khác) sản xuất astaxanthin tự nhiên Chương TỔNG QUAN 1.1 Lược sử nghiên cứu vi tảo H.pluvialis nước 1.1.1 Các nghiên cứu nước Đề tài nghiên cứu thu astaxanthin tự nhiên cách nuôi cấy vi tảo H.pluvialis chủ đề lạ Việt Nam Đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng cường độ ánh sáng, phương pháp nuôi H.pluvialis Có thể kể đến số nghiên cứu như: Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng số nhân tố ngoại sinh lên tăng trưởng tích lũy lipid vi tảo Haematococcus Pluvialis Flotow (Nguyễn Trần Đông Phương cộng sự, 2018), 50 mL vi tảo tuần thứ 9, ni bình 500 mL có chứa 250 mL mơi trường lỏng BB với pH sục khí, mật độ tế bào ban đầu 4,3.103 tế bào/mL, dùng để bố trí thí nghiệm Tất thí nghiệm đặt nhiệt độ 25 ± 3oC, cường độ ánh sáng huỳnh quang 50 µmol photon.m−2.s−1 thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày trừ xử lý với ánh sáng LED Kết cho thấy, có xử lý ánh sáng đèn LED đỏ 24 làm tăng lượng dầu sinh học, làm giảm trọng lượng tươi khô so với đối chứng (ánh sáng huỳnh quang) Xử lý ± 3oC làm tăng hàm lượng dầu sinh học thay đổi không đáng kể trọng lượng tươi, giảm trọng lượng khô Các xử lý Cu2+, Fe2+, Mg2+ Zn2+ với nồng độ cao gấp 1,5 hay lần làm giảm không tăng hàm lượng dầu sinh học Xử lý NaCl 0,5% làm tăng hàm lượng dầu sinh học, làm giảm trọng lượng tươi khô 3 Trong nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng từ light emitting diode lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis nuôi twin-layer porous substrate photobioreactor phương nghiêng (Đỗ Thành Trí cộng sự, 2020), dòng vi tảo H.pluvialis CCAC 0125 cung cấp sưu tập tảo Đại học Cologne (Culture Collection of Algae at the University of Cologne), Đức Môi trường BG-11 sử dụng để nuôi huyền phù vi tảo bình tam giác 500 mL, l túi PE 10 L, 25 ± 2°C chiếu sáng đèn huỳnh quang với cường độ ánh sáng 40-60 µmol photon.m−2.s−1 Đối với nuôi cố định vi tảo hệ thống quang sinh học hai lớp màng theo phương nghiêng, lượng thể tích mơi trường BG-11 lớn chuẩn bị bồn nhựa 40 L Kết cho thấy kết hợp ánh sáng LED đỏ lam cường độ sáng 300-400 µmol photon.m−2.s−1 cho kết tăng sinh khối khơ tích lũy astaxanthin cao nhất, với chế độ chiếu sáng 24 sáng:0 tối cho kết sinh khối khô vi tảo đạt 111,6 g.m−2 tích lũy astaxanthin 1,3% sau 10 ngày nuôi Việc sử dụng ánh sáng đơn sắc từ LED cho thấy hiệu lượng có khả ứng dụng cho việc nuôi cấy tảo cố định hệ thống twin-layer porous substrate photobioreactor quy mô lớn 1.1.2 Các nghiên cứu quốc tế Astaxanthin đề tài nghiên cứu nhiều nhất, không phạm vi nước mà phạm vi quốc tế Tương tự nghiên cứu nước, có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng cường độ ánh sáng, phương pháp ni H.pluvialis Có thể kể đến số nghiên cứu như: Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng mật độ chất cấy thời gian bảo quản lên suất sinh khối khả sản xuất Astaxanthin Haematococcus pluvialis hệ thống twin-layer porous substrate photobioreactor giàn nghiêng (Thanh-Tri Do cộng sự, 2019), thí nghiệm thực quy mơ nhỏ (diện tích tăng trưởng 0,1 × 0,5 = 0,05 m2) quy mơ lớn (0,5 m2 × khu vực tăng trưởng) hệ hệ thống TL-PSBRs giàn nghiêng Môi trường nuôi cấy không vô trùng bảo quản can nhựa 40 L Kết cho thấy, suất sinh khối astaxanthin phần lớn không phụ thuộc vào cường độ ánh sáng 300–1000 µmol photon m−2 s−1 hiệu suất sử dụng ánh sáng mol photon cao khoảng 300–500 µmol photon m−2 s−1 Hàm lượng astaxanthin sinh khối khô dao động khoảng 2-3% (w/w) Cung cấp hiệu CO2 cho môi trường nuôi cấy nhiệm vụ cải tiến tương lai TL-PSBRs giàn nghiêng 1.2 Astaxanthin Astaxanthin sắc tố màu đỏ thuộc nhóm hóa chất carotenoid (Choi Seyoung; Koo Sangho, 2005) Astaxanthin xuất tự nhiên số loại tảo, tạo màu hồng đỏ cho cá hồi, tôm loại hải sản khác (Ambati Ranga Rao cộng sự, 2014) Bên cạnh dầu cá acid béo omega-3, dưỡng chất từ đại dương cải thiện chức thể người Astaxanthin chất chống oxy hóa Nguồn gốc hóa học cho astaxanthin có tính chống oxy hóa này, nguyên nhân cho có sắc tố màu đỏ Chính tính chống oxy hóa astaxanthin, mà người ta cho astaxanthin bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại, cải thiện cách hoạt động hệ miễn dịch Nếu astaxanthin giúp da khỏe mạnh hơn, tăng sức bền, sức khỏe tim mạch, giảm đau khớp, chí điều trị ung thư tương lai 1.2.1 Cấu trúc phân tử 1.2.1.1 Đồng phân Ngoài đồng phân cấu trúc, astaxanthin chứa hai carbon bất đối vị trí 3', dẫn đến việc hình thành ba đồng phân lập thể (3R,3'R 3R,3'S meso 3S,3'S) Trong ba đồng phân lập thể có tự nhiên, tỉ lệ phân bố tương đối thay đổi tùy loài (Bjerkeng Bjørn, 1997) Astaxanthin tổng hợp hỗn hợp gồm ba đồng phân lập thể, theo tỷ lệ khoảng 1:2:1 (Stachowiak Barbara; Szulc Piotr, 2021) 1.2.1.2 Dạng ester hóa khơng ester hóa Astaxanthin tồn hai dạng chủ yếu, khơng ester hóa (tồn nấm men tổng hợp) ester hóa (tồn tảo) với gốc acid béo có độ dài khác Tỷ lệ thành phần hai dạng astaxanthin bị ảnh hưởng thức ăn điều kiện tăng trưởng Astaxanthin khơng ester hóa cho cá hồi ăn để tăng cường màu sắc thịt (Rüfer Corinna E cộng sự, 2008) 1.2.2 Sinh tổng hợp Quá trình sinh tổng hợp astaxanthin bắt đầu với ba phân tử isopentenyl pyrophosphate (IPP) phân tử dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) kết hợp enzyme IPP isomerase biến đổi thành geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) enzyme GGPP synthase Hai phân tử GGPP sau dimer hóa enzyme phytoene synthase để tạo thành phytoene Tiếp theo, enzyme phytoene desaturase tạo liên kết đôi phân tử phytoene để tạo thành lycopene Sau giai đoạn khử bão hòa, enzyme lycopene cyclase tạo thành γ-carotene cách chuyển đổi đầu mạch ψ hở lycopene thành vịng β, sau chuyển đổi đầu để tạo thành βcarotene Từ β-caroten, hydrolases tạo hai nhóm 3-hydroxy ketolases tạo hai nhóm 4-keto, tạo thành nhiều phân tử trung gian thu phân tử astaxanthin cuối (Barredo Jose cộng sự, 2017) 1.2.3 Nguồn tổng hợp Gần tất astaxanthin có sẵn thị trường cho nuôi trồng thủy sản sản xuất tổng hợp, với doanh thu hàng năm 200 triệu dollar giá bán khoảng 5000–6000 dollar/kg Thị trường tăng lên 500 triệu dollar vào năm 2016 dự kiến tiếp tục phát triển với ngành nuôi trồng thủy sản (Grand View Research, 2017) Một trình tổng hợp hiệu từ isophorone, cis-3-metyl-2-penten-4-yn-1-ol C10-dialdehyde đối xứng ứng dụng sản xuất công nghiệp, cách kết hợp hóa chất với phản ứng ethynyl hóa sau phản ứng Wittig (Ashford's Dictionary of Industrial Chemicals, phiên thứ (2011), nhà xuất Wavelength, trang 984) Hai đương lượng ylide thích hợp cụ thể kết hợp với đượng lượng dialdehyde thích hợp pha dung mơi methanol, ethanol hỗn hợp hai, tạo astaxanthin với sản lượng lên đến 88% (Krause Wolfgang cộng sự, 1995) 1.3 Vi tảo Haematococcus pluvialis Haematococcus pluvialis loài nước thuộc ngành Diệp lục thuộc họ Haematococcaceae Loài tiếng với hàm lượng cao chất chống oxy hóa mạnh astaxanthin, quan trọng ni trồng thủy sản mỹ phẩm (Lorentz R.T G.R Cysewski, 2000) Một lượng astaxanthin cao có tế bào già, sản xuất tích lũy nhanh chóng điều kiện môi trường trở nên không thuận lợi cho phát triển bình thường tế bào Ví dụ điều kiện bao gồm ánh sáng chói, độ mặn cao chất dinh dưỡng (S Boussiba A Vonshak, 1991) Haematococcus pluvialis thường tìm thấy vùng ôn đới giới Các nang lành tính chúng thường nguyên nhân tạo màu đỏ máu đáy bể đá khô bể tắm cho chim Màu astaxanthin tạo cho có tác dụng bảo vệ nang nghỉ khỏi tác động bất lợi xạ tia cực tím, tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời (J.R Dore G.R Cysewski, 2003) 1.3.1 Vị trí phân loại phân bố Có nhiều hệ thống phân loại tảo khác Theo hệ thống phân loại tảo H pluvialis theo Smith G.M (1950): Giới: Eukaryota Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Bộ: Volvocales Họ: Chlamydomonadales Chi: Haematococcus Loài: Haematococcus pluvialis H pluvialis phân bố rộng rãi nhiều môi trường sống giới, nhiều cơng trình cơng bố cho thấy tảo sinh sống điều kiện mơi trường khí hậu đa dạng nước lợ tảng đá bờ biển (Chekanov K cộng sự, 2014); lưu vực nước đảo Blomstrandhalvoya; Na Uy (Klochkova T.A cộng sự, 2013); đài phun nước khô gần Rozhen, Blagoevgrad Bulgaria (Gacheva G cộng sự, 2015); ao cá nước Bihor (Romania Dragoş N cộng sự, 2010); bề mặt tầng thượng tòa nhà Kiost Seoul, Hàn Quốc (Kim J.H cộng sự, 2015); ao nuôi vịt, thân cây, thành chậu hoa vùng ngoại thành Hà Nội (Nguyễn Thị Hường cộng sự, 2008) H pluvialis có khả chống chịu tốt điều kiện sống bất lợi, điều kiện môi trường sống thay đổi, thành tế bào dày lên bao bọc xung quanh tế bào nảy mầm trở lại gặp điều kiện môi trường thuận lợi, chúng nhanh chóng trở thành lồi chiếm ưu (Proctor V.W, 1957) 7 1.3.2 Hình thái, đặc điểm cấu tạo Tảo H pluvialis tảo lục có kích thước nhỏ, quan sát kính hiển vi Cơ thể đơn bào, sinh sản vơ tính cách nhân đơi Có dạng tế bào: tế bào sinh dưỡng (hình cầu, elip, có màu xanh lục, thành tế bào suốt, roi, di động được) nang bào tử (hình cầu, thành tế bào dày lên, roi, bất động) Khi môi trường thuận lợi H pluvialis tồn dạng tế bào sinh dưỡng Khi môi trường bất lợi, tế bào chuyển sang dạng nang bào tử 1.3.3 Điều kiện tăng trưởng Điều kiện tăng trưởng H.pluvialis phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường nhiệt độ, pH, nồng độ chất dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng… Vi tảo tăng trưởng tốt nhiệt độ 15-27oC gần không sinh trưởng nhiệt độ môi trường vượt 28oC (Gim G.H cộng sự, 2016) Tế bào đạt mật độ cao pH = 6.5-8, tế bào gần không tăng trưởng pH = (Sarada R cộng sự, 2002) Vi tảo quang tự dưỡng sáng dị dưỡng tối sử dụng nguồn carbon hữu acetate Nguồn carbon yếu tố thiết yếu ảnh hưởng đến tăng trưởng vi tảo Cường độ sáng tác động đến phân chia tế bào chu kỳ tế bào, thay đổi hình thái tế bào hàm lượng chất tế bào Khi cường độ sáng dao động từ 30-150 µmol photon.m−2.s−1, tế bào H.pluvialis tăng trưởng tốt nhất, tùy thuộc vào thể tích mơi trường ni Khi cường độ chiếu sáng thấp 15-30 µmol photon.m−2.s−1 cao 160 µmol photon.m−2.s−1 tăng trưởng vi tảo giảm 1.4 Môi trường nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis 1.4.1 Môi trường BBM 1.4.1.1 Tổng quan Môi trường BBM (Bold’s Basal medium) môi trường sử dụng để ni cấy nhiều loại tảo lục (ví dụ Trichosarcina, Chlorococcum Chlorella) mà không cần bổ sung đất vitamin (Brown cộng sự, 1964; Nichols Bold, 1965) Bản chất môi trường chủ yếu chất vô cơ, tạo điều kiện trở thành môi trường ni cấy trì axenic (Nichols Bold, 1965) 8 1.4.1.2 Thuộc tính Nồng độ điển hình mơi trường 0,705 g/L Nhiệt độ lưu trữ nằm khoảng từ đến 6ºC Dung dịch mơi trường phát triển thành màu tím theo thời gian 1.4.1.3 Thành phần Bảng 1.1 Thành phần môi trường BBM (theo Nichols Bold, 1965) Boric Acid Manganese Chloride.4H2O Calcium Chloride, Anhydrous Potassium Hydroxide Cobalt Nitrate.6H2O Potassium Phosphate, Dibasic Cupric Sulfate.5H2O Potassium Phosphate, Monobasic EDTA, Disodium Salt Sodium Chloride Ferrous Sulfate.7H2O Sodium Molybdate Magnesium Sulfate, Anhydrous Sodium Nitrate Zinc Sulfate.7H2O 11.42 mg/L 1.44 mg/L 18.87 mg/L 31 mg/L 0.49 mg/L 75 mg/L 1.57 mg/L 175 mg/L 63.61 mg/L 25 mg/L 4.98 mg/L 1.19 mg/L 36.63 mg/L 250 mg/L 8.82 mg/L 1.4.2 Môi trường OHM 1.4.2.1 Tổng quan Môi trường OHM (Optimal Haematococcus medium) môi trường sử dụng để nuôi cấy Haematococcus pluvialis Đây mơi trường tối ưu hóa cho việc nuôi cấy Haematococcus pluvialis gồm 18 thành phần nhằm tối đa hóa suất sinh dưỡng H.pluvialis nuôi cấy bán liên tục (J Fábregas cộng sự, 2000) 1.4.2.2 Thành phần Bảng 1.2 Thành phần môi trường OHM (theo J Fábregas cộng sự, 2011) KNO3 Na2HPO4 MgSO4.7H2O CaCl2.H2O Fe (III) citrate H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O Cr2O3 MnCl2.4H2O Na2MoO4.2H2O 0,41 g/L 0,03 g/L 0,246 g/L 0,11 g/L 2,62 mg/L 0,011 mg/L 0,012 mg/L 0,075 mg/L 0,98 mg/L 0,12 mg/L SeO2 Biotin Thiamine Vitamine B12 0,005 mg/L 25 µg/L 17,5 µg/L 15 µg/L 1.4.3 Môi trường RM Bảng 1.3 Thành phần môi trường RM (theo Esra Imamoglu cộng sự, 2007) NaNO3 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.H2O EDTA NaCl H2BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O (NH4)6Mo7O24.4H2O CuSO4.5H2O Co(NO3)2.6H2O FeCl3.6H2O 300 mg/L 80 mg/L 20 mg/L 10 mg/L 58.5 mg/L 7.5 mg/L 20 mg/L 0.3 mg/L 1.5 mg/L 0.1 mg/L 0.3 mg/L 0.08 mg/L 0.26 mg/L 17 mg/L 1.4.4 Môi trường f/2 Guillard 1.4.4.1 Tổng quan Môi trường f/2 Guillard môi trường tập trung chất dinh dưỡng chính, kim loại vi lượng vitamin pha loãng nước biển lọc để hỗ trợ q trình hồn ngun mơi trường làm giàu nước biển Môi trường f/2 Guillard môi trường nước biển làm giàu sử dụng rộng rãi để nuôi cấy loại tảo biển đắt giá 1.4.4.2 Thành phần Bảng 1.4 Thành phần môi trường f/2 Guillard (theo Kyong-Hwa Kang cộng sự, 2011) Dung dịch A: Nitrate phosphate (1 L) NaNO3 Na2MoO4.2H2O FeCl3.6H2O Na2EDTA.2H2O Dung dịch B: Silicate (1 L) Na2SiO3.9H2O Dung dịch C: Kim loại vi lượng (1 L) 84.15 g 6.0 g 2.90 g 10.0 g 33.0 g 10 CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O Ma2MoO4.2H2O MnCl2.4H2O CoCl2.6H2O Dung dịch D: Vitamins (1 L) Vitamine B1 Vitamine B12 Biotine 1.96 g 4.40 g 1.26 g 36.0 g 2.0 g 0.4 g 0.002 mg 0.1 mg 1.4.5 Môi trường Walne Bảng 1.5 Thành phần môi trường Walne (theo Võ Minh Sơn, 2016) Dung dịch A (1 L) FeCl3 MnCl2.4H2O H3BO3 EDTA NaH2PO4.2H2O NaNO3 Vitamine B12 Vitamine B1 Dung dịch B (1 L) ZnCl2 CoCl2.6H2O (NH4)6Mo7O24.4H2O CuSO4.5H2O HCl 1M 0.8 g 0.4 g 33.6 g 45.0 g 20.0 g 100.0 g 0.005 g 0.1 g 2.1 g 2.0 g 0.9 g 2.0 g - mL Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian, địa điểm tư liệu nghiên cứu 2.1.1 Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu khóa luận kéo dài khoảng thời gian tháng (từ tháng 12/2021 đến tháng 03/2022) 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu khóa luận phịng thí nghiệm vi sinh – di truyền, dãy M, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh: 280 An Dương Vương, Phường 4, Quận 5, Tp.HCM 2.1.3 Tư liệu nghiên cứu 11 Các tư liệu nghiên cứu khóa luận là: Ảnh hưởng ánh sáng từ light emitting diode lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis ni twin-layer porous substrate photobioreactor phương nghiêng nhóm tác giả Đỗ Thành Trí, Lại Thị Lan Anh, Tơn Nữ Thùy An, Lê Thượng Chỉ, Bùi Thị Thu Hiền, Trần Hoàng Dũng (2020) Ảnh hưởng số nhân tố ngoại sinh lên tăng trưởng tích lũy lipid vi tảo Haematococcus Pluvialis Flotow nhóm tác giả Nguyễn Trần Đông Phương, Lê Huyền Ái Thúy, Bùi Trang Việt (2018) Nâng cao tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện stress mơi trường ni cấy nhóm tác giả Trịnh Ngọc Nam, Trương Ngọc Bảo Trân, Huỳnh Thị Hiếu, Nguyễn Thị Duy Hiền, Trần Thị Bích Liên (2017) Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ chất cấy thời gian bảo quản lên suất sinh khối khả sản xuất Astaxanthin Haematococcus pluvialis hệ thống twin-layer porous substrate photobioreactor giàn nghiêng nhóm tác giả Thanh-Tri Do, Binh-Nguyen Ong, Minh-Ly Nguyen Tran, Doan Nguyen, Michael Melkonian and HoangDung Tran (2019) Khả thương mại việc sản xuất astaxanthin từ vi tảo Haematococcus pluvialis nhóm tác giả Lorentz R.T G.R Cysewski (2000) 2.2 Phương pháp khảo sát môi trường nuôi cấy vi tảo H pluvialis Các môi trường BBM, OHM, RM, f/2 Guillard Walne sử dụng điều kiện nuôi cấy mẻ bình tam giác 500 mL chứa 250 mL môi trường Các môi trường nuôi bổ sung 10 mL dịch tăng sinh vi tảo có mật độ x 106 tế bào/mL Bình ni cấy đặt điều kiện cường độ chiếu sáng klux, chu kỳ chiếu sáng 24 sáng:0 tối, nhiệt độ 25 ± 0,5ºC, tốc độ sục khí L/phút Sự sinh trưởng vi tảo H.pluvialis môi trường xác định dựa vào phương pháp đo mật độ quang học OD bước sóng 680 nm phương pháp đếm số lượng tế bào buồng đếm vi sinh vật, sau ngày mật độ tảo không tiếp tục tăng môi trường nuôi cấy Tế bào vi tảo quan sát kính hiển ảnh chụp qua hệ thống camera kính hiển vi Sinh khối vi tảo tích lũy xác định cuối mẻ nuôi cách lọc cân sinh khối sau sấy khô 80ºC Dựa vào đường cong sinh trưởng vi tảo H pluvialis khối lượng 12 khô tế bào xác định môi trường phù hợp môi trường thử nghiệm cho sinh trưởng gia tăng sinh khối vi tảo 2.3 Tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo Lipid chứa astaxanthin tế bào vi tảo tách chiết theo phương pháp chiết ướt sử dụng dung môi hữu không độc hại dimethyl ether (DME) lỏng Sinh khối vi tảo thu nhận từ hệ thống bioreactor lọc giấy lọc GF/C Sinh khối vi tảo có độ ẩm 82-90% sử dụng để tách chiết astaxanthin Phương pháp tách chiết DME thực theo hướng dẫn nghiên cứu năm 2014 Boonnoun cộng [16] Sinh khối ướt vi tảo đặt vào cột tách chiết, bên bên phủ lớp hạt thuỷ tinh có kích thước 0,77-0,99 mm Dịng DME bơm qua cột với tốc độ 10 cm3/phút nhiệt độ 20ºC áp suất tách chiết cột trì 0,52 MPa Sau qua cột, DME cho bay hơi, lipid chứa astaxanthin thu hồi Hiệu suất tách chiết lipid xác định sau sản phẩm tách chiết sấy loại nước 40ºC Hiệu suất tách chiết astaxanthin dung môi dimethyl ether lỏng so sánh với phương pháp tách chiết astaxanthin phổ biến dùng acetone 2.4 Phân tích astaxanthin thu nhận từ sinh khối vi tảo H pluvialis nuôi cấy hệ thống bioreactor phương pháp sắc ký mỏng sắc ký lỏng hiệu cao Astaxanthin có lipid thu nhận từ sinh khối vi tảo định lượng phương pháp sắc ký mỏng (TLC) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Với phương pháp TLC, astaxanthin chấm lên sắc ký Merck TLC Plate Dung môi triển khai hexane:chloroform:benzene theo tỉ lệ 10:20:1 (v:v:v) Astaxanthin mẫu xác định thông qua so sánh Rf với astaxanthin chuẩn Phương pháp HPLC thực thiết bị HPLC với cột 150 × 4,5 mm Prontosil RP C-18 (Knauer, Berlin, Đức) trì nhiệt độ 25ºC detector Waters e2695 DAD (Waters, Milford, MD, USA) Pha động hỗn hợp acetonitrile:nước:ethyl acetate với tỉ lệ 98:2:0 (trong phút), 40:0:60 (trong 10 phút), 0:0:100 (trong phút) (% thể tích) Tốc độ dịng mL/phút thể tích tiêm 20 μL Bước sóng phát 480 nm Sự diện hàm lượng astaxanthin xác định so sánh peak diện tích peak với astaxanthin chuẩn 2.5 Xử lý số liệu Tất thí nghiệm nghiên cứu tiến hành lần lặp lại Số liệu thu nhận từ thí nghiệm xử lý cơng cụ Microsoft Excel 2019 Kết trình bày 13 trung bình cộng lần lặp lại độ lệch chuẩn (SD) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê kết nghiệm thức thí nghiệm xác định phân tích ANOVA phần mềm SPSS 20 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - Cả năm loại môi trường có khả ni cấy H pluvialis sinh trưởng thuận lợi - Môi trường RM cho kết nuôi cấy đạt tối ưu - Hiệu suất sản xuất astaxanthin tự nhiên tối ưu đạt ngày thứ 22 - Đề quy trình, điều kiện tối ưu để sản xuất astaxanthin tự nhiên tối ưu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Trần Đông Phương, Lê Huyền Ái Thúy, Bùi Trang Việt (2018) Ảnh hưởng số nhân tố ngoại sinh lên tăng trưởng tích lũy lipid vi tảo Haematococcus Pluvialis Flotow, Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 13(1), 1-13 Đỗ Thành Trí, Lại Thị Lan Anh, Tơn Nữ Thùy An, Lê Thượng Chỉ, Bùi Thị Thu Hiền, Trần Hoàng Dũng (2020) Ảnh hưởng ánh sáng từ light emitting diode lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis nuôi twin-layer porous substrate photobioreactor phương nghiêng, Tạp chí khoa học trường Đại học Sư phạm Tp.Hồ Chí Minh Tập 17, Số (2020): 1597-1609 Trịnh Ngọc Nam, Trương Ngọc Bảo Trân, Huỳnh Thị Hiếu, Nguyễn Thị Duy Hiền, Trần Thị Bích Liên (2017) Nâng cao tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện stress môi trường nuôi cấy, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 13 (1) (2017) 48-59 Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Thị Hoài Hà (2008) "Nghiên cứu tách chiết astaxanthin từ chủng vi tảo Haematococcus phân lập Việt Nam" Tiếng Anh Thanh-Tri Do, Binh-Nguyen Ong, Minh-Ly Nguyen Tran, Doan Nguyen, Michael Melkonian and Hoang-Dung Tran (2019) Biomass and Astaxanthin Productivities of Haematococcus pluvialis in an Angled Twin-Layer Porous Substrate Photobioreactor: Effect of Inoculum Density and Storage Time, Biology 2019, 8(3), 68 Lorentz R.T, and G.R Cysewski (2000) Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin Trends Biotechnol 18: 160-167 S Boussiba and A Vonshak (1991) Astaxanthin Accumulation in the Green Alga Haematococcus pluvialis Plant and Cell Physiology 32: No 1077-1082 J.R Dore, and G.R Cysewski (2003) Haematococcus algae meal as a source of natural astaxanthin for aquaculture feeds Cyanotech Corporation Hawaii Choi Seyoung; Koo Sangho (2005) Efficient Syntheses of the Keto-carotenoids Canthaxanthin, Astaxanthin, and Astacene The Journal of Organic Chemistry 70 (8): 3328–31 10 Ambati Ranga Rao; Phang Siew-Moi; Ravi Sarada; Aswathanarayana, Ravishankar Gokare (2014) Astaxanthin: Sources, Extraction, Stability, Biological Activities and Its Commercial Applications—A Review Marine Drugs 12 (1): 128–152 11 Bjerkeng Bjørn (1997) Chromatographic Analysis of Synthesized Astaxanthin—A Handy Tool for the Ecologist and the Forensic Chemist? The Progressive FishCulturist., 59 (2): 129–140 12 Stachowiak Barbara; Szulc Piotr (2021) Astaxanthin for the Food Industry Molecules 26 (9): 2666 13 Rüfer Corinna E.; Moeseneder Jutta; Briviba Karlis; Rechkemmer Gerhard; Bub Achim (2008) Bioavailability of astaxanthin stereoisomers from wild (Oncorhynchus spp.) and aquacultured (Salmo salar) salmon in healthy men: a randomised, double-blind study The British Journal of Nutrition, 99 (5): 1048–54 14 Barredo Jose; García-Estrada Carlos; Kosalkova Katarina; Barreiro Carlos (2017) Biosynthesis of Astaxanthin as a Main Carotenoid in the Heterobasidiomycetous Yeast Xanthophyllomyces dendrorhous Journal of Fungi (3): 44 15 Astaxanthin Market Analysis By Source Grand View Research (2017) 16 Brown, R.M., Larson, D.A., and H.C Bold (1964) Science 143 (3606), 583-585 17 Nichols H.W., and H.C Bold (1965) J Phycology 1, 34-38 18 J Fábregas, A Domínguez, M Regueiro, A Maseda, A Otero (2000) Optimization of culture medium for the continuous cultivation of the microalga Haematococcus pluvialis, Appl Microbiol Biotechnol (2000) 53: 530 – 535 19 Kyong-Hwa Kang, Zhong-Ji Qian, BoMi Ryu, and Se-Kwon Kim (2011) Characterization of Growth and Protein Contents from Microalgae Navicula incerta with the Investigation of Antioxidant Activity of Enzymatic Hydrolysates, Food Sci Biotechnol 20(1): 183-191 (2011) 20 Chekanov K., Lobakova E., Selyakh I., Semenova L., Sidorov R., Solovchenko A (2014) "Accumulation of astaxanthin by a new Haematococcus pluvialis strain BM1 from the White Sea coastal rocks (Russia)", Marine drugs, Vol 12, No , pp 45044520 21 Klochkova T.A., Kwak M.S., Han J.W., Motomura T., Nagasato C., Kim G.H (2013), "Cold-tolerant strain of Haematococcus pluvialis (Haematococcaceae, Chlorophyta) from Blomstrandhalvøya (Svalbard)", Algae, Vol.28, No.2, pp 185 22 Gacheva G., Dimitrova P., Pilarski P (2015) "New strain Haematococcus cf pluvialis Rozhen-12-growth, biochemical characteristics and future perspectives", Genet Plant Physiol, 5, pp 29-38 23 Dragoş N., Bercea V., Bica A., Drugă B., Nicoară A., Coman C (2010) "Astaxanthin production from a new strain of Haematococcus pluvialis grown in batch culture", Annals of the Romanian society for cell biology, Vol 15, No 2, 2010 24 Kim J.H., Affan M.A., Jang J., Kang M.-H., Ko A.-R., Jeon S.-M., Oh C., Heo S.-J., Lee Y.-H., Ju S.-J (2015) "Morphological, molecular, and biochemical characterization of astaxanthin-producing green microalga Haematococcus sp KORDI03 (Haematococcaceae, Chlorophyta) isolated from Korea", J Microbiol Biotechnol, Vol 25, No 2, pp 238-246, 2015 25 Proctor V.W (1957) "Some controlling factors in the distribution of Haematococcus pluvialis", Ecology, Vol 38, No 3, pp 457-462, 1957 26 Gim G.H., Ryu J., Kim M.J., Kim P.I., Kim S.W (2016) "Effects of carbon source and light intensity on the growth and total lipid production of three microalgae under different culture conditions", Journal of industrial microbiology & biotechnology, Vol 43, No 5, pp 605-616, 2016 27 Sarada R., Tripathi U., Ravishankar G (2002) "Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions", Process Biochemistry, Vol 37, No 6, pp 623-627, 2002  ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI H? ??C SƯ PHẠM THÀNH PHỐ H? ?? CHÍ MINH TRẦN BẢO XUYÊN ẢNH H? ?ỞNG CỦA MƠI TRƯỜNG ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY ASTAXANTHIN CỦA H. PLUVIALIS ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI H? ??C NGÀNH... cách lọc cân sinh khối sau sấy khô 80ºC Dựa vào đường cong sinh trưởng vi tảo H pluvialis khối lượng 12 khô tế bào xác định môi trường phù h? ??p môi trường thử nghiệm cho sinh trưởng gia tăng sinh. .. độ ánh sáng, phương pháp ni H. pluvialis Có thể kể đến số nghiên cứu như: Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh h? ?ởng số nhân tố ngoại sinh lên tăng trưởng tích lũy lipid vi tảo Haematococcus Pluvialis