Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên HuếNghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

HUẾ, NĂM 2024ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI LÊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐÁNH GIÁHOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM CAU

(CURCULIGO ORCHIOIDESGAERTN.) THU TẠI THỪA THIÊN HUẾ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI LÊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐÁNH GIÁHOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY SÂM CAU

(CURCULIGO ORCHIOIDESGAERTN.) THU TẠI THỪA THIÊN HUẾ

Ngành: Sinh lý học thực vậtMã số: 9420112

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS TRƯƠNG THỊ BÍCHPHƯỢNG2 TS HOÀNG TẤNQUẢNG

LỜI CẢM ƠN

Nhữngbướcchânđầutiênvàoconđườngnghiêncứukhoahọc,cũngchínhlà một chặng đườngđầy khó khăn, gian nan và thách thức đối với tôi Nhưng những bước chân chập chững này sẽchẳng đi đến đâu nếu không có sự hỗ trợ, giúp đỡ và dìu dắt từ quý Thầy, Cô, anh, chị, bạn bè,đồng nghiệp và giađình.

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn và dành những lời tri ân sâu sắc nhất đến CôPGS.TS Trương Thị Bích Phượng Cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôitrong suốt thời gian thực hiện luận án Cô đã hỗ trợ tôi hết sức, hết lòng vàđầytráchnhiệmđểgiúptôivượtquacáckhókhăn,tiếnhànhcácnghiêncứuvàhoàn thành luậnán

CũngxinchotôiđượcgửilờicảmơnsâusắcđếnThầyTS.HoàngTấnQuảng, Nghiên cứu viênPhòng thí nghiệm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, ĐạihọcHuếcùngphốihợpvớiCôPGS.TS.TrươngThịBíchPhượnghướngdẫnvàgiúp đỡ tôi hoàn thànhluậnán.

Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa học,phòng Đào tạo Sau đại học trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, quý Thầy Cô khoaSinh học đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường.

trườngĐạihọcYDược;KhoaSinhhoá,BệnhviệnTrungươngHuế;CôngtyHương Cát đã tạo điều kiệnthuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luậnán.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Y-Dược, BanChủ nhiệm Khoa Cơ bản, Trường Đại học Y-Dược, Đại học Huế, nơi tôi đang công tác đãtạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án.

thâncũngnhưcácđồngnghiệpvàanhchịemtạiđơnvịtôiđangcôngtácvàcácđơn vị hỗ trợ trong thờigian thực hiện luậnán.

Vàcuốicùng,conxindànhnhữnglờitriân,lờichúcsứckhỏetốtđẹpnhấtvà sâu sắc nhất đếnBa Mẹ Ba Mẹ là những người đã tần tảo chăm lo và nuôi nấng con lớn khôn cho đến ngàyhôm nay Ba Mẹ luôn ở bên cạnh con, động viên và ủng hộ con Em cũng xin gửi lời cảm ơnđến các anh chị em trong gia đình mình cũng như các cháu đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốtnhất cho em để học tập và hoàn thành tốt luận án Em cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đếnchồng và hai con, đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ và giúp đỡ em rất nhiều khi gặp khó khăn, độngviên khi em chán nản trong công việc, buồn phiền trong cuộcsống.

Huế, tháng 05 năm 2024

Tác giả

Bùi Lê Thanh Nhàn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và dánh giá hoạt

tính sinh học của cây Sâm cau(Curculigo orchioidesGaertn.)” là công trình

nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Cô PGS.TS Trương Thị Bích Phượng vàThầy TS Hoàng Tấn Quảng Những kết quả nghiên cứu của người khác và các sốliệuđượctríchdẫntrongluậnánđềuđượcchúthíchđầyđủ.Tôixincamđoancácsố

liệuvàkếtquảtrongluậnánlàhoàntoàntrungthực.Tôihoàntoànchịutráchnhiệm trước nhàtrường về sự cam đoannày.

Huế, tháng 05 năm 2024

Tác giả

Bùi Lê Thanh Nhàn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALP Phosphatasekiềm

ALT AlanineaminotransferaseAST AspartateaminotransferaseBCG BromocresolGreen

BGL Blood Glucose Level (Nồng độ glucose trong máu) BMD Bone Mineral Density (Mật độ khoáng hoá của xương)BSA Bovin Serum Albumin (Albumin huyết thanhbò)BVF Bone Volume Fraction (Tỷ lệ thể tích xương)

C100 NhómchuộtchouốngdịchchiếtSâmcauvớiliềudùng100mg/kgthể trọng, không stressnhiệt

C200 NhómchuộtchouốngdịchchiếtSâmcauvớiliềudùng200mg/kgthể trọng, không stressnhiệt

C400 NhómchuộtchouốngdịchchiếtSâmcauvớiliềudùng400mg/kgthể trọng, không stressnhiệt

CCI4 CarbontetrachlorideCD ConjugatedDienes

ECO Ethanol Extract ofC orchioides(Dịch chiết ethanol của cây Sâmcau) es

Elongating spermatids (Tinh tửdài)

FSH Follicle Stimulating Hormone (Kích noãn bào tố)GGT Gamma GlutamylTranspeptidase

GPS Global Positioning System (Hệ thống định vị toàn cầu)GPX GlutathionePeroxidase

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng caoHPTLC HighPerfromanceThinLayerChromatography(Sắckýlớpmỏnghiệu

năng cao)

I Shannon Index (Chỉ số

Shannon)LD50hoặc IC50Liều gây chết trungbình

ISSR Inter-Simple Sequence Repeats (Trình tự chuỗi lặp lại đơn giản)Le Leydig Cells (Tế bàoLeydig)

LH LuteinizingHormoneLPO LipidperoxidationMDA Malondialdehyde

MECO Methanol Extract ofC orchioides(Dịch chiết methanol của Sâm cau)

MF Mount frequency (Tần suất gắnkết)

MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tốithiểu)

MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor (Yếu tố ức chế di chuyểnđại thựcbào)

ML Mount Latency (Tần suất gặpgỡ)

MMP Mitochondrial Membrane Potential (Điện tích màng ty thể)Na Observed Number of Alleles (Số allele quan sát được) rnDNA Nuclear ribosomal DNA (DNA ribosome hạchnhân)

Ne Effective Number of Alleles (Số allele hiệuquả)

OD Optical Density (Mật độ quang học, hay độ hấp thụ quang)OG Orcinolglucoside

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân bản DNA)PEI Penile Erection Index (Chỉ số cương cứng dươngvật)

PPB Percentage of Polymorphic Bands (Tỉ lệ phần trăm band đahình)RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphism(Đahìnhchiềudàiđoạncắt hạnchế)RAPD RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA(DNAđahìnhđượcnhânbản

ROS ReactiveOxygenSpecies(Cácgốcoxyhóahoạtđộngcónguồngốctừ oxygen)rs Round Spermatids (Tinh tửtròn)

S Spermatozoa (Tinhtrùng)Sc Spermatocytes (Tinhbào)Se Sertoli Cells (Tế bàoSertoli)Sg Spermatogonia (Tinh nguyênbào)

SHBG Sex Hormone-Binding Globulin (Hormone giới tính liên kết với globulin)

SOD SuperoxideDismutases

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription (Bộ chuyển đổi tín hiệu và hoạt hoá phiênmã)

TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances (Cơ chất phản ứng với thiobarbituric acid, hay chỉ số ôihoá)

v/v Tỷ lệ thể tích trên thểtích

WCO Water Extract ofC orchioides(Dịch chiết nước của Sâm cau)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thếgiới)w/v Tỷ lệ khối lượng trên thểtích

2.2 ĐỊA ĐIỂMTHU MẪU 39

2.3 PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU 40

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểmsinh học 40

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền câySâm sau 41

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiếtSâmcau 52

2.3.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau lên khảnăng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thưdạdày522.3.4.2 Đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau lên quá trình sinhtinh 5 32.4 PHÂN TÍCHTHỐNGKÊ 56

Chương 3 KẾT QUẢ VÀBÀNLUẬN 57

3.1 ĐẶCĐIỂMTHỰCVẬTHỌCVÀĐADẠNGDITRUYỀNCỦACÂYSÂMCAU TẠI THỪATHIÊNHUẾ 57

3.1.1 Đặc điểm thực vật học của câySâmcau 57

3.1.1.1 Đặc điểmphânbố 57

3.1.1.2 Đặc điểm hình thái củaSâmcau 59

3.1.1.3 Đặc điểm vi phẫu củaSâmcau 62

3.1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của câySâmcau 66

3.1.2 Đặc điểm di truyền của câySâmcau 68

3.1.2.1 Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị DNA mã vạch quần thểSâm cau ở ThừaThiênHuế

683.1.2.2 Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉthịRAPD 75

3.2.ĐẶC ĐIỂM HOÁ SINH CỦA CÂY SÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ803.2.1 Một số chỉ tiêu hóa sinhcơbản 80

3.2.2 PhântíchđịnhtínhmộtsốdượcchấttrongcâySâmcauthutạiThừaThiênHuế 83

3.2.2.1 Địnhtínhflavonoid 83

3.2.3.5 Phân tích lycorine bằng kỹthuậtHPLC 91

3.3 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦASÂMCAU 93

3.3.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày MKN45 của dịch chiếtSâmcau 94

3.3.1.1 Tác động của dịch chiết Sâm cau lên kiểu hình tếbàoMKN45 94

3.3.1.2 Tác động của dịch chiết Sâm cau lên sự tăng sinh tế bào MKN45

9 53.3.2 Đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau đến quá trình sinh tinh ở chuộtSwissđực 97

3.3.2.1 Tác động của dịch chiết Sâm cau đến nồngđộtestosterone 97

3.3.2.2 Tác dụng bảo vệ quá trình phát sinh tinh của dịch chiết Sâm cautrên mô học tinh hoàn dưới tác độngcủanhiệt

101KẾT LUẬN VÀKIẾNNGHỊ 109

TÀI LIỆUTHAMKHẢO 112PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếchđạiPCR 42

Bảng 2.2 Danh sách các xuất xứ Sâm cau được sử dụng trongnghiêncứu 43

Bảng 2.3 Trình tự các mồi dùngtrongPCR-RAPD 43

Bảng 2.4 Quy trình nhiệt của phản ứng khuếchđạiRAPD-PCR 44

Bảng 2.5 Phân bố các nhóm chuột Swiss đựcthínghiệm 54

Bảng 2.6 Thang điểm Johnsen đánh giá mô học ốngsinhtinh 56

Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố, thực bì và phẫu diện đất tại các vùngnghiêncứu 58

Bảng 3.2 Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau tại các vùngnghiêncứu 61

Bảng 3.3 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển củaSâmcau 66

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng và tỉ lệ bao phủ của các đoạn genetrnL-trnF ở cácmẫu Sâmcau với trình tự tham chiếu tương đồng nhất trên cơ sở dữliệuNCBI 69

Bảng 3.5 Thành phần bốn loại nucleotide của các Sâm cau nghiên cứu và mẫu đốichứngtrênGenBank 72

Bảng 3.6 Phân tích tính trung lập của quần thể Sâm cau tại ThừaThiênHuế 73

Bảng 3.7 Các haplotype được tạo ra từ 15 mẫu Sâm caunghiêncứu 73

Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giữacácmẫu 74

Bảng 3.10 Kết quả phân tích PCR-RAPD của các quần thểSâmcau 78

Bảng 3.11 Chỉ số đa dạng di truyền của 7 quần thể Sâm caunghiêncứu 78

Bảng 3.12 Sự đa dạng di truyền giữa 7 quần thể Sâm caunghiêncứu 79

Bảng3.13.MộtsốchỉtiêuhóasinhcơbảncủaSâmcautạicácvùngnghiêncứu.81Bảng 3.14 Hàm lượng flavonoid của Sâm cau tại các vùngnghiêncứu 86

Bảng 3.15 Hàm lượng polysaccharide của Sâm cau tại các vùngnghiêncứu 88

Bảng 3.16 Hàm lượng saponin của Sâm cau tại các vùngnghiêncứu 89

Bảng 3.17 Hàm lượng alkaloid của Sâm cau tại các vùngnghiêncứu 90

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ mẫu đến nồngđộlycorine 91

Bảng 3.20 Nồng độ lycorine của Sâm cau tại các vùngnghiêncứu 92

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone trong máucủa chuộtSwissđực 98

Bảng 3.22 Đặc điểm của mô học tinh hoàn theo hệ thốngđiểmJohnsen 103

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây (A) và rễ củ (B) của Sâm cau (CurculigoorchioidesGaertn.) 5

Hình 1.2 Các bước thực hiện kỹthuậtRAPD 14

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số chất glycoside trongSâmcau 21

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của ba loại curculigoside (F,G,H) 23

Hình 1.5 Cấu trúc của lycorine (1) vàN,N,N’,N’-tetramethylsuccinamide(2) 24

Hình 2.1 Cây Sâm cau tại các địa điểm thu mẫu tại ThừaThiênHuế 40

Hình 2.2 Bản đồ thu mẫu Sâm cau tại ThừaThiênHuế 40

Hình 2.3 Mẫu cây Sâm cau được thu hái tại núiNgựBình 47

Hình 2.4 Dịch chiết Sâm cau ở các nồng độkhácnhau 53

Hình 3.1 Hình ảnh điều tra vùng phân bố cây Sâm cau tại ThừaThiênHuế 57

Hình 3.2 Hình thái cây Sâm cau tại tỉnh ThừaThiênHuế 60

Hình 3.3 Cấu trúc vi phẫu của lá câySâmcau 62

Hình 3.4 Cấu trúc vi phẫu của rễ củSâmcau 64

Hình 3.5 Cấu trúc vi phẫu của bột câySâmcau 65

Hình 3.6 Chu kỳ sinh trưởng và tuổi củaSâmcau 67

Hình 3.7 Sản phẩm PCR của vùng genetrnL-trnF điện di trên gel agarose 1% củacác mẫunghiêncứu 68

Hình3.8.VịtrísaikháccủamẫuSâmcautạiThừaThiênHuếdựatrêntrìnhtựDNAvùngtrnL-trnFso với trình tự đối chứngtrênGenBank 70

Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh phả hệ củaSâmcau 75

Hình 3.10 Sản phẩm PCR được khuếch đại bằng mồi OPA-01 của 92 mẫu nghiêncứu 77

Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại của 7 quần thể Sâm caunghiêncứu 80Hình 3.12 Phân tích định tính các mẫu lá Sâm cau tại khu vựcnghiêncứu 84Hình 3.13 Phân tích định tính rễ củ Sâm cau tại khu vựcnghiêncứu 85Hình3.14.ẢnhhưởngcủadịchchiếtSâmcaulênmậtđộvàkiểuhìnhcủatếbàoungthư dạ dày MKN45(Thang đo100µm) 94Hình 3.15 Tỷ lệ tăng sinh (A) và tỷ lệ ức chế (B) của tếbàoMKN45 95Hình 3.16 Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone trong máucủa chuột Swiss đựcnghiêncứu 99Hình 3.17 Cấu trúc mô tinh hoàn ở chuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằngdịch chiếtSâmcau 102Hình3.18.Đánhgiátổnthươngmôtinhhoànởchuộttiếpxúcvớinhiệtvàđượcđiềutrị bằng dịch chiết Sâm cau theo hệ thốngđiểmJohnsen 104Hình 3.19 Phân bố tần số của điểm số Johnsen của mặt cắt ngang ống dẫn tinh ởchuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằng dịch chiếtSâmcau 105

PHẦN MỞ ĐẦU1 Sự cần thiết của đềtài

Việt Nam với 3/4 diện tích tự nhiên là vùng đồi núi, chịu sự ảnh hưởng củakhíhậunhiệtđớigiómùa,đãtạonênchođấtnướcchúngtamộthệsinhtháithựcvật vô cùng phong phúvà đa dạng với khoảng 4.000 loài cây thuốc[258].

Cây Sâm cau (Curculigo orchioidesGaertn.) là một loài thảo dược sống lâu năm

thuộc họ Hạ trâm (Hypoxidaceae), thường phân bố ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đớinhư Việt Nam,Trung Quốc, Ấn Độ, [3], [102], [259] Các nghiên cứu về

thành phần hoá học cho thấy, cây Sâm cau (C orchioides) có chứa glycoside [163], [217],

[240]; alkaloid, saponin [174], [221]; triterpenoid [117], [255], flavonoid vàpolysaccharide,…[168],[150],[224],[244].Vớithànhphầnhoạtchấtphongphúnày, Sâm cau đã được sửdụng rộng rãi trong y học bản địa các nước nhằm bảo vệ sức khoẻ, bảo vệ gan [172], [215], chống oxy hóa,

đáitháođường[242],[252].ChiếtxuấtrễcủtừSâmcaucũngđượcsửdụngnhưmột loại thuốc bổ đểkhắc phục chứng bất lực, liệt dương [62], [186], rối loạn tiết niệu [3], [126], [58]; vàng da [111],[123]; an thần, bảo vệ thần kinh, hoạt động chống hoại tử [156], [244] và hoạt tính kháng khuẩn

quámứcdẫnđếntìnhtrạngngàycàngcạnkiệtvànhiềunơiđãbiếnmấthẳn.Vìvậy, Liên minh Bảo tồnThiên nhiên Quốc tế (IUCN) và Việt Nam đã đưa cây Sâm cauvàodanhmụccủasáchđỏcầnđượcbảovệởmứcnguycấp(mứcEN,phânhạngVU A1c,d) [27],[102].

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế-xã hội, các stress cũng như sự ônhiễmmôitrường,tỷlệmắcbệnhungthưvàbệnhsuygiảmchứcnăngsinhdụclàmộttrong những vấn đề nhức nhốicủa xã hội hiện đại Số người mắc bệnh ngày càng gia tăng vàcóxuhướngtrẻhoábệnhnhân[56],[121],[189].Theosốliệutoàncầunăm2020,

ungthưdạdàyđứngthứnămtrongsốcácbệnhungthưthườnggặpvớihơnmộttriệungườimắcmới,đứngthứtưvềtỷlệtửvongdobệnháctínhvới770.000ca[189].

Bêncạnhđó,theoướctínhcủaWHOcókhoảng80triệucặpvợchồngvôsinh,trong đó vô sinh do namgiới chiếm khoảng 40 - 50% Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ vô sinh cao trên thếgiới với 50% số ca mắc bệnh nằm ở độ tuổi dưới 30 Thống kê của Bộ Y tế nước ta cho thấy, mỗinăm có khoảng 1 triệu cặp vợ chồng mắcbệnhvôsinh,hiếmmuộn,chiếm8-10%ởcáccặpvợchồngđangởđộtuổisinh đẻ Những nghiên cứu gần đây cho thấy chất lượng tinh

đãgiảmnhiềusovớitrước.Từnăm1965đếnnăm2015,mậtđộtinhtrùngtrungbình ở đàn ông đã giảm32,5% sau 50 năm [183] Sự suy giảm quá trình sinh tinh khôngchỉảnhhưởngđếnsứckhỏe,tinhthầnvàkinhtếcủanamgiớimàcònảnhhưởngđến sức lao động, cũngnhư hạnh phúc gia đình, sự phát triển nòi giống và gây hậu quả tiêu cực đối với đời sống xã hội[69] Vì vậy, nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây Sâm cau đối với các tế bào ung thư dạ dày vàquá trình sinh tinh là rất cầnthiết.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách tổng thể về cây Sâm cau tại Việt NamnóichungvàtỉnhThừaThiênHuếnóiriêng,vẫncònrấthạnchế.Việcxácđịnhđúng

câySâmcauvàphânbiệtvớicácgiốngsâmkháclàrấtcầnthiếttrongquátrìnhkhai thác, sử dụng cũngnhư định hướng bảo tồn và phát triển nguồn cây dượcliệu.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

aertn.) thu tại Thừa ThiênHuế”2 Mục tiêu và nội dung của đềtài

2.1 Mục tiêuchung

Xácđịnhđượcmộtsốđặcđiểmhìnhthái,hóasinh,đadạngditruyềnvàdược tính của cây Sâm

cau (Curculigo orchioidesGaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa ThiênHuế.

2.2 Mục tiêu cụthể

- Xác định được một số đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau

(CurculigoorchioidesGaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa ThiênHuế;

- Nghiên cứu được một số hoạt tính sinh học của cây Sâm cau

(CurculigoorchioidesGaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa ThiênHuế.

2.3 Nội dung của đềtài

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đa dạng di truyền của cây Sâm cau tự nhiên phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa thiênHuế;

- Nghiên cứu một số đặc điểm hoá sinh và sự tích luỹ dược chất của cây Sâm cau tự nhiên tại Thừa ThiênHuế;

- Đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế, đồng thời xác định dược lý của cây Sâm cau trên mô hình động vật thựcnghiệm.

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đềtài

3.1 Ý nghĩa khoahọc

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về mộtsố đặc điểm thực vật học cũng như hoạt tính sinh học của cây Sâm cau tại Thừa ThiênHuế Đồng thời, luận án cũng là tài liệu tham khảo cho các hoạt động nghiên cứu và giảngdạy về sinh học và cây dược liệu.

3.2 Ý nghĩa thựctiễn

Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc bảo tồn và phát triển loài dược

liệu Sâm cau (Curculigo orchioidesGaertn.) tại Thừa Thiên Huế nói riêng và Việt Nam

nói chung.

4 Phạm vi nghiên cứu của đềtài

Nghiên cứu các đặc điểm hình thái của cây Sâm cau tự nhiên phân bố trênđịabàn tỉnh Thừa Thiên Huế Các thông số của cây được xác định tại địa điểm thumẫu.Các thí nghiệm phân tích thành phần dược chất và đánh giá đa dạng di truyềncủacâySâmcauđượctiếnhànhtạiphòngthínghiệmcủaKhoaSinhhọc,trườngĐại học Khoa học vàViện Công nghệ Sinh học, Đại họcHuế.

5 Những đóng góp mới của luậnán

- Đề tài cung cấp các đặc điểm sinh học của loài Sâm cau phân bố tại ThừaThiên Huế, bao gồm: chiều cao cây, kích thước lá, kích thước rễ củ, hình dạng vàmàu sắc hoa,quả,…

- Sử dụng kỹ thuật DNA mã vạch đã định danh được loài Sâm cau phân bố

trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế là loàiCurculigo orchioidesGaertn., thuộcchiCurculigo,họHypoxidaceae.15trìnhtựtrnL-trnFcómãsốtươngứngtừOR035735- OR035749

đã được ký gửi lênGenBank.

- ĐãđánhgiáđượcmứcđộđadạngditruyềncủacácmẫuSâmcauthôngqua

6mồikhuếchđạinhiềubandDNAvớiđộđahìnhcao.Sựkhácbiệtditruyềncủacác quần thể Sâmcau tại một số địa phương trong nước khá cao Tỉ lệ locus đa hình của các quần thể Sâmcau đạt trung bình là 80,66% với khoảng cách di truyền giữa các mẫu từ 0,0611đến0,2958.

-Đã xác định được một số thành phần hóa sinh ở mẫu rễ củ và mẫu lá trongcây Sâm cau phân bố tại Thừa Thiên Huế, bao gồm các chỉ tiêu về hàm lượng của

C (0,088 - 0,172%), lipid tổng số (5,010 - 10,420%), protein (0,166 - 3,480 mg/g),flavonoid(0,508-2,129mg/g),polysaccharide(24,859-102,274mg/g),saponin(2,469

- 5,340 mg/g), alkaloid (9,553 - 10,039 mg/g), và lycorine (0,241 - 1,777 µg/mL).

- DịchchiếttừrễcủcủacâySâmcauvớinồngđộlycorinecaocótácdụngức chế sự tăngtrưởng của các tế bào ung thư dạ dày, cũng như kích thích quá trình sinh tinh trên môhình thực nghiệm, đặc biệt ở liều dùng dịch chiết 200 mg/kg thể trọng và 400 mg/kgthểtrọng.

6 Đạo đức nghiêncứu

NghiêncứuthựcnghiệmtrênmôhìnhchuộtSwissđựcđãđượcHộiđồngđạo đức trong nghiêncứu Y đức của Đại học Huế thông qua (số HUVN0007).

A B

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚITHIỆU CHUNG VỀ SÂMCAU1.1.1 Đặcđiểm phânloại

Cây Sâm cau (Curculigo orchioidesGaertn.) thuộc chi Cồ Nốc (Curculigo) Trướcđây, chiCurculigoxếp vào họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [11], nhưng hiện nay được xếp

vào họ Tỏi voi lùn (hay còn gọi là họ Hạ trâm, Hypoxidaceae), Bộ Măng tây (Asparagale)[195], [260].

Hình 1.1 Cây (A) và rễ củ (B) của Sâm cau (Curculigo orchioidesGaertn.) [46], [195]

1.1.2 Đặcđiểm của họHypoxidaceae

Hypoxidaceae là một họ thực vật hạt kín, gồm có 9 chi và khoảng 220 loài, chủ yếuphân bố tại các khu vực thuộc Nam Bán cầu, vùng nhiệt đới chấu Á và Bắc

Mỹ[224].TạiViệtNamcó2chilàchiCồnốc(Curculigo)vàchiHạtrâm(Hypoxis) với khoảng 10

loài [260] Các loài thực vật thuộc họ này đều có đặc điểm chung là cây thảo, rễ củ hoặcrễ củ dạng củ Lá hình lưỡi mác mọc từ gốc giống như lá cau non, có gân song song vànổi rõ Hoa mọc thành cụm hoa, và được mọc từ gốc Hoa thuộc mẫu 3, bầu dưới Noãnnhiều đính thành 2 hàng trên giá noãn trụ giữa Hạt có mỏ nhỏ ở bên [46],[260].

Hệ thống phân loại học thực vật của Anh cũng mô tả các đặc điểm của thực vậtthuộc họ Hypoxidaceae bản địa là những loại thảo mộc lâu năm có lá giống cỏ mọc từthân ngầm Các lá nguyên vẹn, có gân song song, không có răng và có lông trắng Cụmhoa được mọc trên một cuống không có lá Hoa có 6 đài hoa, có hìnhdạngđốixứngtỏatrònvàcómàuvàng;cácláđàiđínhphíatrênbầunhụy(tứclàbầu

nhụyởdưới)vàcólôngởmặtngoài/mặtdướicó6nhị.Quảcóhìnhdạngnhưlàmột viên nang khô Cácloài trong họ này trước đây được coi là thuộc về Liliaceae Hiện nay ở Anh quốc, họHypoxidaceae chỉ có 1 chi và 1 loài trong khu vực [224],[259].

1.1.3 Đặcđiểm của chiCurculigo

ChiCurculigotrên thế giới có khoảng hơn 20 loài Theo Phạm Hoàng Hộ(2003),chiCurculigoởViệtNamhiệncó7loài[11].TheocôngbốcủaLãĐìnhMỡi vàcs(2005)

tiếngViệt:CồNốcTrungbộ),C.capitulata(Lour.)O.Kuntze(têntiếngViệt:CồNốc hoa đầu, Sâm

cau lá dừa; tên khác:LeucoiumcapitulataLour.;CurculigorecurvataDryan.),C.disticha(Gagnep.)(têntiếngViệt:CồNốcsongđính),C.gracilis(Kurz)Wall ex Hook.f (tên tiếng Việt: Cồ Nốc mảnh, Lòng thuyền; tênkhác:MolinieragracilisKurz),C latifoliaDryand ex Ait (tên tiếng Việt: Cồ Nốc lárộng, Sâm cau lá rộng),Curculigo orchioidesGaertn (tên tiếng Việt: Cồ Nốc lan,Sâm cau, Ngải cau, Nam sáng ton, Soọng ca, Thài léng),C sinensisS.C Chen, C.tonkinensisGagnep (tên tiếng Việt: Cồ Nốc Bắc bộ),C conocGagnep (tên tiếng

Việt: Cồnốc),

C crassifolia(Baker) (tên tiếng Việt: Cỏ lá dừa trắng).

ChiCurculigocó nguồn gốc từ Ấn Độ và có thể tìm thấy nhiều nơi trên thế

giới,phânbốởđộcaolêntới2.300msovớimựcnướcbiển,đặcbiệtởcácvùngnúi đá vôi Các loài

thực vật thuộc chiCurculigolà loài cây thân thảo, sống lâu năm, thường có thân rễ dạng củ.

Lá dẹt có gốc bẹ, thường có phủ lông Cụm hoa mọc gần gốc Hoa màu vàng, có bầu nhụyẩn trong bẹ lá; bao hoa, nhụy và bao phấn nhô caolênphíatrênbầunhụytrênmộtốnghẹpthondài(ốngbaohoa).Quảnangcóhạtmàu đen, bóng [11] Thực

vật thuộc chiCurculigochứa thành phần các chất chuyển hoá thứ cấp đa dạng và phong phúvới nhiều hoạt tính sinh học Vì vậy,Curculigođược sử dụng trong y dược học nhằm giúp

điều hoà miễn dịch, loại bỏ các gốc tự do và chống oxy hoá, điều chỉnh vị giác, chốngviêm [34], [37]; kích thích tình dục, điều chỉnhhànhvitìnhdụcvàhormonesinhdục[50],[58],[200];bảovệthầnkinh[250]; chống loãng xương; chống viêm; chống khối u [233]; ổn định tế bàomast và kháng histamin [214]; cũng như hoạt tính chống đái tháo đường[114].

1.1.4 Đặcđiểm thực vật học của Sâmcau

Trong dân gian Sâm cau còn được gọi với nhiều tên khác nhau, nhưKali

MusalihaySiyah Muslitheo hệ thống y học Ayurvedic [102], [125], [181] hoặc Cồ nốc

lan, Ngải cau, Nam sáng ton, Soọng ca, Thài léng, Tiên mao, Ngãi sâm, Cỏ mắt vàng,… [11],[27],[260].Sâmcaulàmộtloàithảomộc,sốnglâunăm,thânngầmcănhànhhình trụ, cao3 - 10 cm, mọc thẳng hoặc hơi cong queo, hai đầu thót lại, mang nhiều rễ phụ[3],đườngkính0,6-1,2cm.Mặtngoàirễcủcóvỏthômàunâuhoặcnâuđen,cócáclỗ sẹo rễ con vànhiều vết nhăn ngang, bên trong có nạc màu vàng ngà Chất cứng vàgiòn, dễ bẻ gãy, mặt gãykhông phẳng, màu nâu nhạt tới nâu hoặc nâu đen ở giữa Mùi thơm nhẹ, vị đắng và cay Lá (10 - 45 × 0,5 - 3,5 cm) mọc thànhđám ở thân ngắn với các bẹ láởgốc,xếpnếptựanhưláCau,dài20-50cm,rộng2,5-3,0cm;phiếnlácóhìnhmũi mác hẹp có gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùngmàu, gân song song rấtrõ; bẹ lá to và dài, cuống lá có thể dài đến 10 cm [11], [46],[125].

Sâm cau có hoa quanh năm, hoa màu vàng nhạt, lưỡng tính Phát hoa ở mặt đất,cụm hoa nằm trên một trục ngắn và mảnh giữa các bẹ lá, gồm 3 - 5 hoa; baohoa nằm trên mộtphần kéo dài của bầu hình thoi có lông rậm kéo dài thành mỏ Lá bắc hình trái xoan nhọn, lá đài 3 có lọng dài ở lưng; tràng 3 cánh nhẵn; nhị 6 xếp thànhhai dãy, chỉ nhị ngắn; đầu nhụy hình trái xoan, chia 3 nhánh mập Noãn nhiều trên mỗi ô, đường kính 2 mm, đầu nhụy 3, thuỳ dài ra Quả nang, thuôn,dài 1,2 - 2,0cm, rộng 8 mm, chứa 1 - 4 hạt [11], [65], [181], có khi lên đến 8 hạt [46], [192], [195] Hạt màu đen, hình cầu, đường kính 1-2 mm, ở đầuhơi phình còn phía dưới có một phầnphụhìnhliềm,cómỏ,khoétsâuthànhcácđườnglượnsóng[3],[192].Câysinhtrưởng tốt trong mùa mưa ẩm, mùa hoa quả từ tháng 5 - 7[3].

1.1.5 Phânbố

Curculigolà một chi thực vật có hoa trong họ Hypoxidaceae, được mô tả lần đầu tiên

vào năm 1788 Nó phổ biến trên khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á,châu Phi, châu Úc và châu Mỹ trong các khu rừng râm mát [94], [111].

TrongchiCurculigothìloàiCurculigoorchioidesGaertn.(2n=36)làmộtloạithuốc quan trọng trong hệ

thống y học Ayurvedic và Unani, được sử dụng dưới tên “KaliMusli”và “Siyah Musl i” Cáccâynày được phâ nbốở Ra jas tha n, ẤnĐ ộ, Trung

Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippines, Indonesia, Pakistan,Papua New Guinea, …[63], [260] và xuất hiện rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới Himalaya

[181] Ở nước ta,Curculigo orchioidesGaertn (hay còn gọi là Sâm cau đen, Ngải cau,

Tiên mao,…), phân bố rải rác ở các khu vực ẩm ướt tại các vùng núi như Lai Châu, TuyênQuang, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Nam, Quảng Trị,Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, KonTum, Lâm Đồng, Bà Rịa-Vũng Tàu [7],[11].

CâySâmcauthườngphânbốtrênnềnđấtẩmvenrừng,nhấtlàcácvùngrừng đá vôi hoặc trênnương rẫy của Việt Nam, nơi có độ cao lên tới 1.500 m [1] Ở Java, có thể gặp Sâm cau trêncác đồng cỏ trảng nắng hoặc dưới bóng che nhẹ, tại những khu vực có một mùa khô hạn hoặcdưới tán các rừng Tếch, ở độ cao 400 m so với mực nước biển [22] Ở vùng núi cận nhiệt đới

thấySâmcauphânbốtrongcáckhurừngthưa,nhưnghiếmgặptrongrừngrậmởđộ cao 2.250 m đến2.300 m so với mực nước biển [32], [102], [138] Sâm cau đượcxemlàloàicâybảnđịacủaẤnĐộvàxuấthiệnrộngrãinhiềukhuvựckhácnhưvùng Mahabharat (Nepal),Khasia Hills, Assam, Arunachal, Manipur, Bengal; Western Ghats từ Konkan về phía nam-BangMaharashtra, Kanara, Nilghiris, Madras đến Cape Comorin, Tích Lan, Trung Quốc, Nhật Bản vàNepal, … [51],[192].

1.2 MỘTSỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DITRUYỀN

1.2.1 DNAmãvạch

Thuật ngữ DNA mã vạch (DNA-barcoding, DNA barcode) lần đầu tiên được Arnotvà cs sử dụng vào năm 1993 trong một bài báo mà không nhận được sự chú ýnhiềutừcộngđồngkhoahọc.Đếnnăm2002,thôngquanghiêncứucủaHebertvàcs phản ánh mốiquan hệ gần gũi của 200 loài sinh vật thuộc bộ cánh vảy với độ chính xác 100% bằng cách sử

dụng gene ty thể cytochrome-c oxidase tiểu đơn vị I (COI), DNA mã vạch bắt đầu có tầm ảnh

hưởng lớn mạnh Để thúc đẩy việc sử dụng DNA mã vạch cho tất cả sinh vật nhân chuẩn

fortheBarcodeofLife)đãđượcthànhlậpvàotháng5năm2004,gồmhơn120tổ

chức từ 45 quốc gia, với mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự mãvạch (barcode) cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại chobất kỳ mẫu DNA nào [20], [55] Với sự hỗ trợ của CBOL, cũng như Trung tâm công nghệthông tin Quốc gia (National Center for Biotechnology Information - NCBI) củaGenBank, DNA mã vạch ngày càng phát triển và là mộtcôngcụditruyềnhữuíchđượchệthốnghóađểthựchiệnchínhxácviệcxácđịnhvà định danh cho mọiloài [71], [154],[212].

Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một hoặc nhiều trình tự gene ngắn(200 - 900 bp) được lấy từ một phần chuẩn hóa của hệ gene để hỗ trợ các loàitrongnhậndạngvàkhámphábằngcáchsửdụngphânkỳtrìnhtựdựatrênsựliênkết nucleotide [73],[84], [92] Đặc điểm quan trọng nhất của DNA mã vạch là phải phổbiếnvàđặchiệutrongcácbiếndịvàdễdàngsửdụng,dễdàngkhuếchđạibằngPCR [71], [243] Trong

những năm gần đây, một số vùng gene lục lạp (cpDNA), và vùng gene nhân (ITS-rDNA) đang

được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại(phylogeny), phân loại (taxonomy) và nhận dạng loài (identity) ở thực vật [55], [84],[238].

Hiện nay, các ứng viên mã vạch tiêu chuẩn chính giúp phân biệt các loàithực vật với

độ chính xác cao gồm có:ITS,matK,rbcL,psbA-trnH vàtrnL-trnF Trong đó,trnL-trnF là mã

vạch chiếm ưu thế nhờ tính đa vị trí DNA mã vạch và độ biến thiên cao, giúp nhận diện

một cách chính xác thực vật ở cấp độ loài và dưới loài Số trnFgiatănghàngnămvàđạttrên10.000vàonăm2021[93], [253] VùngtrnL-trnF là vùng là chất

lượngấnphẩmvềtrnL-đệm giữa 2 gene tRNA-Leucine và tRNA- Phenylalanine, nằm trong vùng sao chép đơnlớn của bộ gene lục lạp [118], [177] Vùng gene này có tỷ lệ chuyển đổi nucleotide cao,khả năng tạo biến thể di truyền tương đối cao và cung cấp các thông tin phân loại có tínhhệ thống hơn Sử dụng mã vạch này để phân tích có thể ảnh hưởng đến việc đọc trình tự ởmột số loài do việc lặp lại mononucleotide, nhưng nhìn chung rất đơn giản để giải trình tự

[93], [253] Ngoàira,sựphânbốkhônggianđadạngcủacácnucleotidedọctheovùngtrnL-trnF còn

giúp xác định sự tiến hóa khác nhau giữa các loài sinh vật[248].

DNA mã vạch là một công cụ chẩn đoán hiện đại với các ứng dụng ngày càng

tăng trong phân loại học, sinh học hệ thống và nghiên cứu sinh thái DNA mã vạchcóthểdễdàngkhắcphụcnhữnggiớihạncủaviệcphânloạiloàithôngthườnggâyra do các mẫu nghingờ có thể bị hư hỏng hoặc không đầy đủ chỉ với một phần mô khả thi để nhận dạng; giảmthiểu được tình trạng DNA bị phân mảnh trong môi trường [71],[84].TínhhữuíchcủaDNAmãvạchkhôngchỉgiớihạntrongnghiêncứukhoa học về đa dạng sinh họcmà còn liên quan đến bảo tồn, sức khỏe cộng đồng và an toàn sinh học [71], [196], [228],[232].

Trong nghiên cứu của Yu và cs (2017), vùngITS2 được đánh giá trên 127 trình

tự đại diện cho 101 mẫu cây thuốc thu thập từ 14 tỉnh thành khác nhau tại Trung

Quốc(Trachelospermum jasminoides, F pumila,F tikouavàE fortui) Kết quả chothấy, tỷ lệ khuếch đại thành công của các vùngITS2 cho tất cả 101 mẫu là 100% và cáctrình tự hai chiều đều có chất lượng cao Trình tựITS2 của các loài nghiên cứu tương

đối khác nhauvớiđộdàiđượccănchỉnhlà270bpvàtồntại126vịtríbiếnđổichiếmtỷlệ46,7% Ngoài

ra, trong nghiên cứu chỉ có một kiểu đơn bội của loàiT jasminoidesđược tìmthấy,khôngquansátthấycácvịtríbiếnđổivàkhoảngcáchgiữacácloàiT.jasminoideslà 0,000;

trong khi đó khoảng cách với các loài còn lại rất cao và khoảng cách mã vạch rõ ràng

được ghi nhận dao động trong khoảng từ 0,488 - 0,607 Như vậy, vùngITS2 có thể thay

đổi và phù hợp với sự khác biệt cao giữa các loài trong cây thuốc[243].

Ứng dụng kỹ thuật DNA mã vạch, Phạm Văn Kiền và cs (2018) đã địnhdanhchínhxácđượctrong6mẫudượcliệumangtênBakíchđượcthuthậptạimộtsốtỉnh

ởViệtNam,trongđó4/6mẫulàthuộcloàiBakíchMonrindaofficinalis,và2/6mẫu không phải là Bakích nhưng thuộc chiPolygala, họ Viễn chí[18].

ChiBlumealàmộttrongnhữngchicónhiềuloàiđượcsửdụnglàmthuốcthảo dược hoặc trong

ngành công nghiệp hóa chất với giá trị kinh tế cao ở Trung Quốc Tuy nhiên, người ta biết rất ít vềmối quan hệ phát sinh loài và tiến hóa phân tử củachinàyởTrungQuốc.Vìvậy,Zhangvàcs(2019)đãtiếnhànhphântích16mẫucủa 12 loài thuộc

chiBlumeaở Trung Quốc bằng trình tự DNA ribosome hạch nhân(nrDNA)vàDNAlụclạp(cpDNA)trnL-Fđểtáicấutrúcmốiquanhệphátsinhgene và ước tính thờigian phân kỳ Kết quả chỉ ra rằng, chiBlumealà đơn ngành vàđược

chia thành 2 nhánh khác nhau về môi trường sống, hình thái, loại nhiễm sắc thể vàthành phần hóa Trong đó, nhánh I gồm 3 loài thuộc phân

chiMacrophyllae(B.aromatica,B densiflora,B balsamifera) và 1 loài thuộc phânchiPaniculatae(B.lanceolaria); 8 loài còn lại đều thuộc nhánh II [248].

Để đánh giá quan hệ họ hàng của các loài trong chi nhân sâm (Panax), Vũ Đình

Duy và cs (2020) đã tiến hành thu thập và phân tích các mẫu sâm thu tại núi Phu Xai LaiLeng và vườn Dược liệu của công ty TH (Kỳ Sơn, Nghệ An) Mã vạch DNA vùng gene

nhân (ITS-rDNA) và vùng gene lục lạp (matK) đã được sử dụng Kết quả cho thấy 100%vùng geneITS-rDNA vàmatK đều được khuyếch đại PCR và trình tự đọc hai chiều với độ

dài trình tự nucleotide tương ứng là 616 bp và 1433 bp So sánh với dữ liệu trên ngânhàng gene thế giới (NCBI), tất cả 32 mẫu sâm tự

= 99%, BPP = 100%), 19 mẫu sâm tại vườn dược liệu đều có mối quan hệ chặt chẽ với

loài Tam thất (P notoginseng) (MLBS = 100%, BPP = 100%) Sự khác biệt di truyềngiữa các loài trong chiPanaxthay đổi từ 0,2 - 7,9%, trung bình 4% đối với vùngITS-rDNAvàtrungbình1,2%(0,1-2,9%)đốivớivùngmatK.Nghiêncứunày đã chỉ ra rằng các loài trongchiPanaxcó cùng nguồn gốc tiến hóa, giúp xác định mối quan hệ di truyền của cácloài/thứ trong chiPanaxvà ghi nhận Tam thất hoang có phân bố tại núi Phu Xai Lai Leng,

xã Na Ngòi, Kỳ Sơn, Nghệ An, trên cở sở đó chính thức mở rộng vùng phân bố của loàinày ở Việt Nam[8].

Huỳnh Thị Thu Huệ và cs (2021) đã tiến hành giải trình tự, phân tích chỉ thị DNA

vùngtrnL-trnF có kích thước 1.075 bp từ 10 mẫu lá khô của cây Cà gai leo (SolanumprocumbensLour.) Kết quả cho thấy 100% đoạn gene từ 10 mẫu nghiên cứu đều tươngđồng với các công bố của loàiSolanum procumbensLour Khoảng cách di truyền dựatrêntrnL-trnF của các mẫu so với một số loài trongchiSolanumdaođộngvớibiênđộthấp,từ0,0082đến0,0399.Cácsốliệuthuđượctừnghiêncứu đãcung cấp thêm thông tin cho những nghiên cứu đa dạng di truyền về chi Cà (Solanum) cũng

như cây thuốc của Việt Nam [13] Ở một nghiên cứu khác trên cây Bách bộ thu được từvùng núi miền Bắc Việt Nam, hai chỉ thị DNA mã vạch

gồmrbcLvàtrnLđãđượcsửdụngđểthựchiện.Kếtquảnghiêncứukhoảngcáchditruyền

và cây phát sinh chủng loại cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các mẫu Bách bộ nghiên

cứu với trình tự của loàiStemona tuberosaLour Vùng genetrnL (1100 bp) cho thấy khảnăng phân biệt các loài Bách bộ tốt hơn so với vùng generbcL (600

bp).NhữngkếtquảnàylàtiềnđềchonhữngnghiêncứutiếptheovềloàiBáchbộvà những loài câythuốc quý khác, phục vụ cho nghiên cứu khoa học và thực tiễn như phân loại đánh giá đa dạngvà bảo tồn[12].

Nghiên cứu dựa trên 3 vùng gene DNA mã vạch làrbcL,ITS,ycf1 và vị trí codon mã

hoá đầu tiên (ScoT) đã được Hasim và cs (2021) sử dụng để tìm ra mốiquanhệphátsinhgenecủa9loàicâythuốcnguycấpđặchữucónguycơtuyệtchủng ở vùng SaintKathrine, bán đảo Sinai 19 trình tự mã vạch mới đã được đưa vào cơ sở dữ liệu NCBI DNA mãvạch có hiệu quả cao trong việc xác định mối quan hệ di truyền giữa 9 loài nghiên cứu, và có thểphân cụm các loài được nghiên cứu thành các nhóm thích hợp ở cấp phân loại chi và loài một cáchhiệu quả Trong khi đó, chỉ thị phân tử SCoT không thể nhóm các loài thực vật thuộc cùng một chilại với nhau, nó chỉ có thể nhóm các loài thực vật thuộc cùng một họ[91].

Năm 2022, Chen và cs đã phân tích trình tựITScủa cây Gừng đenDistichochlamyscitreacó nguồn gốc từ Bạch Mã (Thừa Thiên Huế, Việt Nam) KếtquảđiệnditrêngelagarosechothấycácbộkhuếchđạibởicácđoạnmồiITScókích thước khoảng 750bp So sánh dựa trên BLAST giữa 15 trình tựITSnghiên cứu với các các trình tự tham chiếutrên GenBank cho thấy các trình tự hình thành cụm với các trình tựITScủa cùng loài

táchbiệtvớicácloàikháctronghọZingiberaceae[60].Cũngtrongnămnày,loàihoa đặc hữu ở Sa Pa, tỉnh

Lào Cai, Việt Nam làLilium poilaneithuộc chiLilium, họ Liliaceae đã được đánh giá các đặc

điểm hình thái và dữ liệu trình tự DNA bao gồm các đoạn DNA ribosome nhân

đượcphântíchcụthểvàcảhaichỉthịITS2vàrpoC1đềuchothấysựvượttrộitrong việc phân biệtL.polinaneivới điểm tương đồng 100% và có số gia nhập mới là KR632775.1 vàKR632777.1 được đăng ký tại NCBI GenBank.Những dữ liệu chi

tiếtvềloàinàycóthểđónggópvàosựpháttriểnbềnvữnghơnnữacủacácchiến

lược nhân giống hoa loa kèn và góp phần vào các cuộc điều tra đa dạng sinh học và bảotồn sinh học của loài hoa loa kèn quý hiếm [100].

Bêncạnhđó,cácloàithựcvậtthuộcchiDóbầu(Aquilaria)làloàithựcvậtcó nhiều tác dụng

dược lý, đặc biệt là tác dụng trị đái tháo đường và nhuận tràng Itovà cs (2022) đã xác định được 3 loài Dó

bầu:A.rugosa,A.sinensisvàA.crassnanhờtrnF.Đồngthời,phântíchmẫulábằngkỹthuậtHPLC và LC/MS, nhóm tác giả đã cho thấy sự khác

sửdụngtrìnhtựmatKvàtrnL-biệt về hàm lượng và thành phần hóa học của 3 loài Dó bầu, cũng như phân sửdụngtrìnhtựmatKvàtrnL-biệt được sự khác sửdụngtrìnhtựmatKvàtrnL-biệtvề hoạt tính ức chế và cường độ ức chế α-glucosidase trong dịch chiết lá[104].

(2022)đểxácđịnh20loàithựcvậtquantrọngvềmặtyhọcthuộcchiCaryophyllales Kết quả chỉ rarằngITS2 đã thành công trong việc phân biệt các loài được kiểm tra,

vàcóthểđượcsửdụngđểpháthiệntạpnhiễmbẩnởnhữngcâythuốcnày.Hơnnữa, nghiên cứu nàycho thấy rằng sự kết hợp của nhiều phương pháp có thể hỗ trợ giải quyết các phân loại tươngtự về mặt hình thái hoặc có liên quan chặt chẽ[105].

1.2.2 KỹthuậtRAPD

KỹthuậtRAPD(RandomLyAmplifiedPolymorphicDNA)làkỹthuậtchỉthị phân tử đượcWilliam và cs công bố lần đầu tiên vào năm 1990 Hiện nay, RAPD được sử dụng rộng rãi nhấttrong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật[20].

Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR vớicác mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vịtrí bắt mồi Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên,vớitỷlệbasenitơGCđạttốithiểu40%(thườnglà50-80%),khôngcótrìnhtựbase đầu xuôi và ngượcgiống nhau và nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34 - 40ºC) [28],[229].

RAPDlàchỉthịtrộiđượcditruyềntheoquiluậtMendelvàđượcxácđịnhdựa trên sự xuấthiện/không xuất hiện của band DNA Một band RAPD sẽ được tạo ra ở cả dạng đồng hợp tử và dịhợp tử, mặc dù độ đậm nhạt của band có thể khác nhaunhưngxácđịnhsựđadạngdựatrênđộđậmnhạtcủacácbandlàcôngviệckhókhăn Vì vậy, việc phânbiệt các cá thể trội đồng hợp tử với dị hợp tử thường là khôngthể.

Hơn nữa, khó có thể xác định là các band được khuếch đại từ các locus khác nhau hay làcác allele khác nhau của một locus đơn Vì vậy, có thể xác định sai số lượng các locusđược khuếch đại Điều này đúng trong trường hợp sản phẩm RAPD khác nhau do đột biếnthêm/mất đoạn chứ không phải do đột biến ở vị trí gắn mồi [20].

Hình 1.2 Các bước thực hiện kỹ thuật RAPD [33]

Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu vàcóthểứngdụngchocácloàikhácnhauvớicácmồichung.Hơnnữa,kỹthuậtRAPD đơn giản và dễ thựchiện gồm các bước cơ bản sau[28]:

- Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máyPCR- Điện di trên gel agarose hoặc gelpolyacrylamide

- Xácđịnhtínhđadạngditruyềnbằngcácphầnmềmthôngdụng(NTSYSpc,

UPGMACluster,Gelcompar…).Cácsốliệuthuđượcchothấysựgầngũihoặccách biệt ditruyền của các mẫu nghiêncứu.

Ngàynay,cácnhànghiêncứuđãthiếtlậpđượcphầnmềmmáytínhđểtựđộng hoá việc xây dựng sơđồ quan hệ hay độ tương đồng di truyền của các đối tượng nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân

đóchophépđánhgiáđượcmốiquanhệditruyềngiữacáccáthểđượcnghiêncứu.

NTSYSPC là một công trình cho phép giảm bớt thời gian tính toán và có độ chính xác caonên nó là một phần mềm hiệu quả trong việc phân tích kĩ thuật RAPD Chỉ thị RAPD sinhra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những band DNA đặc trưng, vì vậykhông phân biệt được thể dị hợp Đó là hạn chế của chỉ thị này sovớichỉthịđồngtrộiRFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)[229].Mặc dù vậy, chỉ thịnày vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòngnhịbội,nhữngdòngcậnphốihaycácquầnthểlaitrởlại.RAPDlàkĩthuậtphânloại phân tử dễ sửdụng, được ứng dụng trong xác định tính đa dạng sinh học và quan hệ họ hàng của các giốngthực vật, động vật khác nhau trong các loài Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biếtthông tin về trình tự Chỉ thị RAPD còn có một hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụthuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quảkhônglặplạiđược,đặcbiệtlàởnhữngđốitượngcóbộgenelớnnhưlúamì.Đểkhắc

tựcủachúngrồithiếtkếnhữngđoạnmồidàikhoảng20bptừcảhaiđầuvàgọilàchỉ thị SCARs(Sequence-Characterized Amplified Region) Do đó, trong phân tích di truyền, để đảm bảo kếtquả có độ chính xác cao, người ta thường sử dụng kết hợp kĩ thuật RAPD với các kĩ thuật phântử khác [48],[97].

NghệđenlàmộttrongnhữngloàinghệcósựphânbốrộngnhấtởBangladesh, để đánh giá mức độđa dạng di truyền giữa các quần thể nghệ đen tự nhiên, Islam và cs (2005) đã sử dụng kỹ thuậtRAPD Sử dụng hệ số Shannon cho thấy nghệ đen ở các vùng đồi như Srimangal, Chittagong vàSitakundu có mức độ đa dạng di truyền cao hơn ở vùng đồng bằng (Savar) hay cao nguyên (Birganj).Các tác giả nhận thấymứcđộđadạnggiữacácquầnthể(H′pop/H

′sp)đạt0,717,caohơnmứcđộđadạngbên trong quần thể (GST) là 0,283 Phân tích phân bố ditruyền (PCoA) cho thấy các cáthể có nguồn gốc từ vùng đồi được xếp vào một nhóm vàphân biệt rõ với các quần thể vùng đồng bằng hay vùng cao nguyên[103].

phổbiếntrongdângian,cótácdụnglàmthuốcbổ,điềukinh,chữanóngsốt,…PhạmNgọcOanhvàcs(2006)đãsửdụngkỹthuậtRAPDđểnghiêncứuđadạngditruyền

của 7 mẫu sâm Bố chính tại các tỉnh phía Nam Kết quả cho thấy sự tương đồng của7mẫunghiêncứuthayđổitừ25-94%vàđượcchiathành2nhóm:mộtnhómlàSâm Báo hoa vàng ThanhHóa, một nhóm là 6 loại còn lại Sử dụng chỉ thị RAPD, nhómtácgiảđãnhậndạngđượcchínhxácloàiSâmBáohoavàngThanhHóa,SâmPhúYên, Sâm thành phố HồChí Minh và Sâm Lộc Ninh[24].

Dhanyavàcs(2011)đãnghiêncứuvùngkhuếchđạitrìnhtựđặctrưng(SCAR) có độ đặc hiệu, độ

nhạy và độ lặp lại cao để phân biệt các loài Nghệ khác nhau làC.longa,C zedoariavàC malabarica.

Hai chỉ thị giả định RAPD là ‘Cur 01’ và ‘Cur 02’ được tạo bởi các cặp mồi ngẫu nhiên

gốctừC.zedoariavàC.malabarica.Kếtquảphântích,sosánhbộtnghệthậtvớicác mẫu bột nghệ đanglưu hành trên thị trường đã phát hiện sự có mặt củaC longa,C.zedoariavàC malabarica Như

vậy, RADP là một phương pháp hữu ích giúp các cơ quan quản lý chất lượng thực phẩmkiểm định và sàng lọc các sản phẩm bột nghệ ở qui mô lớn dành cho xuất nhập khẩu[66].

Trong nghiên cứu của Trương Thị Hồng Hải và cs (2020), 100 cây sâm NgọcLinh4và5tuổitrồngtạitrạiTăkNgo(NamTràMy,tỉnhQuảngNam)đãđượcđánh

thuđược132bandDNAđahình,cókíchthướcnằmtrongkhoảngtừ150-3.500bp; sự đa dạng ditruyền của các cá thể trong quần thể sâm nghiên cứu khá cao, hệ số đadạngtrongtừngmồingẫunhiêndaođộngtừkhoảng0,350-0,484.Hệsốtươngđồng di truyền giữa cácmẫu sâm Ngọc Linh biến động từ 0,000 - 0,950 và chia thành hai nhóm chính ở hệ số tương đồngdi truyền 0,700[9].

Cà Ba thùy (Solanum trilobatum) là một cây thuốc của Ấn Độ có thành phần

glyco-alkaloid steroid có thể sử dụng như tiền chất cho sản xuất steroid thương mại.Shilphavàcs(2013)đãsửdụngchỉthịRAPDvàISSR(Inter-SimpleSequenceRepeats)để đánh giá sự

đa dạng di truyền trên 14 mẫuSolanum trilobatumthu được từ 5 tiểu

bangNamẤnĐộ.Bằngcáchsửdụng20mồiRAPDđãthuđược189bandriêngbiệttrongđócó160bandđahình;bảymồiISSRđãthuđược72/83bandđahình.CácgiátrịPICdaođộngtừ0,49-0,93đốivớichỉthịRAPDvà0,16-0,9đốivớiISSR.PhântíchnhómUPGMAđãchothấytấtcảcácmẫuthuthậptừTamilNadu(ẤnĐộ)phân

bố trong một nhóm và các mẫu còn lại trong một nhóm khác.Nghiêncứu nàyđãthểhiệnmốiquan hệ phát sinh loài và biến động di truyền cao,từ đócung cấp dữ liệucơ bản cho việc bảo tồn vàchọn lọc giống cây Ba thuỳ trong tương lai[188].

Năm 2014, Ashraf và cs đã thực hiện nghiên cứu để đánh giá 12 mẫu Gừng

RAPD.13/20mồiđượcsànglọcđãtạora275bandkhuếchđại,trongđó261bandđa hình (94,9%) Từ cácsố liệu phân tích, nhóm nghiên cứu đã xác định được tỷ lệ đa hình của tất cả 12 mẫu dao động từ88,23% - 100%, hệ số tương quan và dựng cây phả hệ Qua đó, các tác giả cho thấy rằng Gừng đãtrãi qua biến đổi di truyền dưới tác động của các điều kiện sinh thái[45].

Bằng chỉ thị RAPD, Nguyễn Thị Ngọc Trâm và Đặng Trọng Lương (2014) đãđánhgiáđượcsựđadạngditruyềncủa4mẫucâyĐinhlăng.Hệsốtươngđồngditruyền

giữacácmẫulàrấtlớnđạttừ0,90-0,98.Trongđó,câysố1khácxavềmặtditruyềnso với 3 giốngcòn lại với độ tương đồng di truyền đạt 0,9 Dựa vào đặc điểm hình thái,

L Harms), cây số 1 có nguồn gốc từ Hưng Yên, để đưa vào sản xuất thuốc [31].

Trà hoa vàng thuộc chi Trà (Camellia), họ Chè (Theaceae), có nguồn gốc ở khu

vực miền Đông và miền Nam Châu Á Đây là loài thực vật quý hiếm vừa có giá trị làmcảnh vừa có giá trị chữa bệnh Đặng Quang Bích và cs (2017) đã sử dụng chỉthịRAPDvàISSRđểđánhgiáđadạngditruyềnnguồngene25mẫuTràhoavàngthu thập tại Quảng Ninh.Với tổng số 53 mồi phân tích (45 chỉ thị RAPD và 8 chỉ thịISSR).Tổngsố4656bandđãđượcpháthiệntrongđócó3628bandđahình.Kếtquả

phântíchchothấyhệsốtươngđồngditruyềncủa25mẫuTràhoavàngbiếnđộngtừ 0,81.25mẫuTràhoavàngđượctáchthành9nhómchínhvớimứctươngđồng di truyền 0,71 Như vậy,việc kết hợp giữa phân tích kiểu hình, sự đa dạng di truyền đã giúp các nhà khoa học xác địnhđược sự đa dạng về kiểu gene của các mẫu Trà hoa vàng có kiểu hình khá giống nhau[2].

0,54-Đảngsâm(Condonopsisjavanica(Blume)Hookf.)làmộtcâythuốcquýđược lưu truyền từ lâu đời

với các tác dụng bổ tỳ, ích khí, sử dụng để bồi bổ sức khỏe, cơthểbịsuynhược.Nhằmmụcđíchbảotồnvàchọn,tạogiốngloàicâythuốcĐảngsâm

nghiêncứunhằmđánhgiámứcđộđadạngditruyềncủamộtsốquầnthểĐảngsâmphân bố tự nhiên vàtrồng trọt ở một số tỉnh miền núi Tây Bắc (Lào Cai, Hà Giang, Sơn La)vàTâyNguyên(LâmĐồng,KonTum).Tổngcộng15mẫuquầnthểĐảngsâm,trongđó

từKonTumđãđượcthuthậpđểtáchchiếtDNAvàphântíchđadạngditruyềnbằngchỉ thị PCR sử dụng 12 mồi có trình tự 10 nucleotide ngẫu nhiên Kết quả phân tíchbằngphầnmềmNTSYSpc2.1chothấytrongtổngcộng106bandRAPD-PCRthuđược có 88band đa hình (83%) và 18 band đồng hình (17%) Mười lăm mẫu quần thể chialàm 2 nhóm lớn, tách biệt rõ rệt giữa nhóm mẫu thu ở Tây Bắc và nhóm mẫuthu ở Tây Nguyên Các mẫu thu thập ở vị trí địa lý gần nhau có khác biệt di

thấynhiềukhảnăngchúngcónguồngốcchung.Sựkhácbiệtditruyềncaogiữacácquần thể cách xa vềđịa lý cho thấy những nguồn gene này cần được bảo tồn độc lập phục vụ cho công tác chọnlọc và tạo giống trong tương lai[15].

họTiếtdê(Menispermaceae)chứaberberinthuthậptừcáctỉnhởViệtNam.Sửdụng 22 mồi RAPD đểkhuếch đại DNA đã thu được tổng số 3216 band DNA thuộc 202 loại band khác nhau, trong đó có167 band đa hình (chiếm 82,7%) và 35 band đơn hình (chiếm 17,3%) Hệ số tương đồng di truyềngiữa 36 mẫu giống dao động trong khoảng 0,53 đến 0,92 Ở mức tương đồng 73%, 36 mẫu giốngđược chia thành 9 nhóm,táchbiệtrõrệtgiữacácchi,loàikhácnhautronghọTiếtdê.Nhóm1baogồm 8

mẫu giống thuộc loài Vảy đắng (còn gọi là Dây hoàng liên,Arcangelisia flava(L.)

oàiNghệr ừ n g ( Curcumaaromatica)từmiềnĐôngẤnĐộsửdụngcácchỉthịISSRvàRAPD.CácmẫuCurcumaaromaticađượcthuthậptừ4khuvựckhácnhaucủabangOdisha(ẤnĐộ),sơđồcâydi

truyềnđãđượcxâydựngthôngquaphươngphápphânnhómUPGMAsửdụnghệsốtương tự của Jaccard Hai nhóm chính đã được tạo ra đã cho thấy mức độtươngđồngditruyềngiữacácnguồngenethuthậptừ4khuvựcđó.Nhữngpháthiệnnàysẽcóýnghĩađủlớnđểbổsungchocácchiếnlượcbảotồnvàmôtảcáccâythuốcquantrọngthuộc

họZingibearceae(họ Gừng) theo cách tiếp cận Công nghệ Sinh học hiện đại [157].

1.2.3 ỨngdụngchỉthịphântửtrongnghiêncứuđadạngditruyềncâySâmcau

Alagar và cs (2014) đã sử dụng phương pháp Trình tự chuỗi lặp lại đơn giản (InterSimple Sequence Repeats ISSR) để xác định tính trung thực về mặt di truyền của cây convi nhân giống được tái sinh từ 5 con đường khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy 4/10mồi được chọn để phát hiện các chỉ thị phân tử cho kết quả tốt ở các cây Số lượng bandđược khuếch đại thay đổi từ 8 - 12 band đơn hình và 4 - 8 band đa hình tùy thuộc vàođoạn mồi được sử dụng được quan sát thấy trong điện di trên gel agarose Phân tích DNAbộ gene cho thấy sự tương đồng về mặt di truyền của cây vi nhân giống với cây đối chứngđạt tỷ lệ đa hình đạt 66% Ngoài ra, nghiên cứu còn chứng tỏ cây con được tái sinh trực

tiếp từ rễ củ cũng như từ lá của câyinvitrođều ổn định về mặt di truyền và hóa học thực

vật [39].

Các phân tích trên 10 đoạn mồi RAPD của các cây Sâm cau thu thập thập từ 4 xuất

xứ khác nhau của vùng Tamil Nadu, Ấn Độ, và các cây con được sản xuấtinvitrocũng

được Susindran và Ramesh (2016) thực hiện Kết quả ghi nhận 6/10 mồi hiển thị cácband, trong đó mồi 1 tạo ra 43 band và mồi 9 chỉ tạo ra 2 band Kích thước các band từ150 đến 3.000 bp Hệ số tương đồng của Jaccard đạt 100% chứngtỏmứcđộđadạngditruyềnrấtthấptrongloàivàRAPDlàmộtchỉthịphântửtốtđể nghiên cứu tính đadạng di truyền của các loài này[198].

Lê Đình Chắc và cs (2018) đã tiến hành phân lập generpoC1 từ 2 mẫu Sâm

cauthutạiVườnquốcgiaBếnÉnvàKhubảotồnthiênnhiênXuânLiênThanhHóa Nghiên cứu đã xác

định được kích thước generpoC1 của hai mẫu là bằng nhau và

đềugồm570nucleotidevàcósựtươngđồngđạt99,5%sovớimãsốJF972810được công bố trên

GenBank Điều này cho thấy, trình tự nucleotide của generpoC1 là rất cao đối với các cá thể

cùng loài tại những vùng địa lý tương tự nhau về điều kiện tự nhiên, thổ nhưỡng, tiểu khíhậu[6].

PhântíchphátsinhloàidựatrêndữliệucpDNAđãhỗtrợmạnhmẽchoviệcsửa đổi hệthống của họ Hypoxidaceae, phát hiện mối quan hệ phát sinh loài gần và sự hồi

sinhlàmtổtrongchiCurculigo.Kếtquảthunhậnđượckhitiếnhànhnghiêncứutrêncơ sở liên kếtcủa bộ dữ liệurbcL vàtrnL-F của 64 đơn vị phân loại dài 1821 bp[80].

Nghiên cứu trong giai đoạn 2020 - 2021 đã cho thấy hiệu quả của DNA

mãvạch,matK vàrbcL đối với việc phân loại quần thể Sâm cau Sau khi kiểm tra 11 mẫu

Sâm cau được thu thập từ các địa điểm khác nhau ở các tỉnh phía Bắc và Bình Định,

Việt Nam, độ dài căn chỉnh cho locusmatK vàrbcL lần lượt là 704 bp và 671 pb Ngoàira, locusmatK cũng cho thấy khả năng nhận dạng cao hơnrbcL với sự hiển thị cao hơn

1.3 THÀNHPHẦN HÓA HỌC CỦA SÂMCAU

Thành phần hóa học của Sâm cau luôn được các nhà khoa học quan tâm nghiêncứu.Cácnghiêncứuhiệntạichothấysựhiệndiệncủacácthànhphầnhóathựcvậttrong

cây Sâm cau rất phong phú và đa dạng, gồm: flavonoid, saponin, glycoside, terpenoid,steroid và glycoside [61], [109], [256]; các hợp chất aliphatic hydroxylketone[208],các saponin thuộc nhóm cycloartan và nhóm ursan [138], [161]; flavone

alkaloid[150].Bêncạnhđócâycònchứacácthànhphầnkhác:steroid;đườngtựdonhư glucose,manose, xylose;mucilage;hemicellulose; polysaccharide và glucoronic acid [108], [195].Hợp chất hoạt tính sinh học được khám phá nhiều nhất là curculigoside, một glycosidephenolic được phân lập chủ yếu từ rễ củ của cây[125].

1.3.1 Hợpchấtglycoside

ĐâylànhómhợpchấtchínhtrongSâmcau.Theocácnghiêncứutrênthếgiới, nhóm phenolicglycoside trong cây thường tồn tại dưới dạng các loại đường khácnhaunhư glucose, manose,xylose và glucoronic acid[109].

Phân tích thành phân hóa học của Sâm cau, các nhà khoa học đã phân lập vàlàmsáng tỏ thành phần phenolic glycoside trong rễ củ của cây này gồm có curculigoside A, và curculigoside C, curculigoside Bvà 2, 6-dimethoxylbenzoic acid[122].

khử,saponin,chấtbéo,carotene.Đồngthời,cáctácgiảcũngđãphânlậpđượcđượcmột hợp chất tinhkhiết 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid từ dịch chiết acetone[30].

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số chất glycoside trong Sâm cau

[230]Ghi chú: orcinol glucoside (1),

orcinol-1-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (2), β-D-

orcinol-1-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-glucopyranoside (3), curculigoside (4), curculigoside B (5), curculigoside C (6),2,6-dimethoxyl benzoic acid (7) và syringic acid (8).

Bằng phương pháp quang phổ, Wu và cs (2005) đã khẳng định sự tồn tạic ủ a7 thành phần đã biết của Sâm cau là: orcinol glucoside (1), orcinol-1-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (2), curculigoside (4), curculigoside B (5),curculigoside C (6), 2,6-dimethoxyl benzoic acid (7) và syringic acid (8) Ngoài ra, nhómnghiên cứu còn xác định được thêm 1 loại glucoside mới từ rễ củ Sâmcau: orcinol-1-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (3) (Hình 1.3)[230].

Valls và cs (2006) đã phân lập được từ cây Sâm cau hai phenolic đã biết làcurculigoside A, curculigoside B và 2 phenolic mới là curculigoside C và curculigoside D[213].

Năm 2009, dẫn xuất mới của syringic acid và glycoside phenol là curculigoside Evà orchioside D đã được phân lập từ cây Sâm cau thu thập tại quận Nawalparasi (Nepal).Cấu trúc hoá học của các hợp chất này được làm sáng tỏ bằng các phương pháp quangphổ, trong đó curculigoside E có công thức hoá học là 3,5- Dimethoxy-4-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]-benzoic acid 5- methyl-2-O-β-D-glucopyr-anoside-phenyl ester [64] Tiếp đó, 4 loại glycosidephenolicmớilàorcinosideD,E,FvàGcũngđãđượcphânlậptừrễcủcủaSâmcau Dựa trên các phântích quang phổ toàn diện bao gồm: IR, FAB-MS, HR-ESI-MS, 1D-và 2D NMR (HSQC,HMBC), cấu trúc của chúng được làm sáng tỏ là: orcinol- 1-O-beta-D-xylopyranoside, orcinol-1-O-beta-D-apiofuranosyl-(1→ 2)-beta-D-glu- copyranoside, orcinol-3-O-beta-D-apiofuranosyl-1-O-beta-D-glucopyra-noside, và 1-O-beta-D-glucopyranosyl-4-ethoxyl-3-hydroxymetylphenol[257].

Trongmôitrườnginvitro,phântíchmẫurễcủcủaSâmcauđượcnuôicấylắc trong bình, Valls

và cs (2010) đã thu được glycoside mới là curculigoside C vàcurculigosideDcùngvới2hợpchấtđãbiết:curculigosideAvàcurculigosideB.Cấu trúc của chúng đãđược làm sáng tỏ trên cơ sở bằng chứng quang phổ, đặc biệt là bằng cách sử dụng phương pháp 2DNMR [213] Cũng trong năm này, Zuo và cs (2010) đã phân lập được thêm ba loại phenolicglycoside mới, curculigoside F-H Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ dựa trên các phân tíchquang phổ toàn diện bao gồm IR, MS, 1D-và 2D NMR (HSQC, COZY và HMBC)[256].