2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Lấy mẫu, chụp ,
[21], [27], giám định tên khoa học bằng phương pháp So sánh hình thái dựa vào các tài liệu Cây cỏ Việt Nam [14], Từ điển Thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc Việt Nam [5], Thực vật chí tổng quát Đông Dương (Flora Générale de l’Indochine) [44], Thực vât chí Trung Quốc [36], [45], Thực vật chí Thái Lan [33] và các mẫu tiêu bản lưu tại Phòng tiêu bản trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP).
-
o
2.2.2. Phƣơng pháp n
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN
Nghiên cứu này lựa chọn phương pháp tách bằng Kit Qiagen để tiến hành
tách chiết ADN t 40]:
Quy trình:
- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày .
- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5mL.
- Thêm 300 L dung dịch phân giải tế bào.
- Ủ ở 650
c trong 10 phút, lắc đảo ống 2-3 lần.
- Thêm 3 L enzyme Rnase (4 mg/ml)
- Lắc đảo 50 lần và ủ ở 370C trong 15 phút.
- Thêm 200 L dung dịch Protein kết tủa vào dịch tế bào. Lắc vortex trong 10
giây.
- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 5 phút.
- Chuyển dịch trong sang ống eppendoff 1,5 mL có chứa sẵn 300 L
27
- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 5 phút (các vi hạt ADN sẽ tạo thành và lắng xuống).
- Loại bỏ dịch nổi, làm khô ống bằng giấy thấm sạch.
- Thêm 500 L ethanol 700 và lắc đảo vài lần để rửa sạch hạt ADN.
- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 5 phút. Đổ từ từ dịch ethanol.
- Làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Thêm 100 L dung dịch ADN hydrat hóa
- Ủ mẫu ở 650
C trong 1h.
Bảo quản ADN ở -200 C đến -800 C
2.2.2.2. Phƣơng pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR
Muốn khuếch đại một đoạn gen nào đó bằng kỹ thuật PCR cần phải thiết lập một phản ứng gồm: ADN khuôn, dNTPs đã được hoạt hoá, enzym Taq- polymerase chịu nhiệt và mồi ITS đặc hiệu [10]. Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: + Buffer Mg2+ 25mM 1,5 µl + dNTPs 10mM 0,5 µl + Mồi xuôi (10 µM) 1,5 µ l + Mồi ngược (10 µM) 1,5 µl + ADN khuôn 2 µl + Taq-polymerase (5U/ µl) 0,5 µl + Nước cất 7,5 µl Tổng: 15 µl
Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml trên máy PCR Eppendorf MasterCycler Pro – S với chu trình nhiệt như trong bảng 2.1
Bảng 2.2. Tóm tắt chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 95 5 phút 1
2 Biến tính 95 45 giây
35
3 Bắt cặp mồi 45 1 phút 10 giây
28
5 Hoàn tất kéo dài 68 7 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 5 1
2.2.2.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp điện di trên gel agarose để phát hiện ADN gồm các bước như sau [10]:
- Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn
toàn. Để nguội 45 - 500C bổ sung 2,5µl Ethidium Bromide (EtBr), đổ vào khuôn gel
đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5 - 1 cm.
- Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 10µl loading dye và tra vào các giếng trên gel.
- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn. Đặt 50V, 90mA
- Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr.
- Chụp ảnh gel.
2.2.2.4. Phƣơng pháp thôi gel theo kit Qiagen
Để tinh sạch ADN tiến hành thôi gel bằng kit Qiagen theo các bước:
- Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml.
- Bổ sung đệm QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG : 1 thể tích gel (100 mg ~100 μl). - Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn. - Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10 μl Natri acetate 3M, pH 5.
- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút.
- Bổ sung 500 μl đệm QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa.
29
- Bổ sung 750 μl đệm PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút.
- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5ml sạch.
- Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch.
2.2.2.5. Phƣơng pháp xác định trình tự acid nucleic
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự ADN được xác định theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự [10] với bộ Kit xác định trình tự BigDye Terminator 3.1 và máy đọc trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) (http://www.macrogen.com/eng/).
2.2.2.6. Phƣơng pháp phân tích số liệu
Trình tự ADN thu được tổng hợp, phân tích so sánh với nhau trên phần mềm MEGA6 và so sánh với trình tự ADN đã công bố trên ngân hàng gen GenBank sử dụng công cụ Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
2.2
Trong 06 mẫu nghiên cứu, loài B6 không có củ và loài B16 sau khi định tính sơ bộ không có rotundin nên đề tài chỉ tiến hành định lượng hàm lượng rotundin trong 04 loài còn lại.
Quy trình tiến hành định lượng rotundin theo chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV năm 2009 [3].
Pha động: Hỗn hợp dung dịch KH2PO4 (0,05M) 62,5 ml, Acetonitril 37,5 ml, Trimethylamin 0,5 ml. Điều chỉnh pH pha động đến 4,5 bằng dung dịch acid phosphoric đặc. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, lắc siêu âm để loại hết bọt khí.
Hòa tan 0,0556 g rotundin chuẩn trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ 0,0556 mg/ ml.
Ch
30
vào bình định mức 500 ml, thêm pha dộng đến vạch, lắc đều. L
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25 cm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm) (Lichrosorb RP 18 là thích hợp).
Detector UV với bước sóng phát hiện 260 nm
Tốc độ dòng: 1 ml/ phút
Thể tích tiêm: 20 µl
Cách tiến hành:
- Tiêm mẫu chuẩn, đánh giá độ ổn định và độ thích hợp của hệ thống dựa vào
hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lặp lại của các lần tiêm mẫu.
Yêu cầu:
+ Hệ số đối xứng từ (T) 0,8 ≤ T ≤ 1,5. + Số đĩa lý thuyết (H) ≥ 3000.
+ Giá trị RSD của các lần tiêm chuẩn ≤ 2,0%.
- Tiêm dung dịch thử. Dựa vào diện tích (hay chiều cao) pic thu được của
dung dịch thử, dung dịch chuẩn và nồng độ rotundin (C21H25NO4) của dung
dịch chuẩn, tính hàm lượng rotundin (C21H25NO4) trong dược liệu.
+ Công thức tính hàm lượng rotundin:
Trong đó: C%: hàm lượng rotundin trong mẫu thử (%)
Cc : nồng độ của dung dịch chuẩn (mg/ml)
S : diện tích pic của mẫu thử Sc : diện tích pic của mẫu chuẩn
31
f : hệ số pha loãng của mẫu thử m : khối lượng của mẫu thử (g) h : độ ẩm của mẫu thử (%)
+ Mỗi mẫu nghiên cứu được định lượng 03 lần sau đó lấy giá trị trung bình của 03
32
3.1. Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của một số loài trong chi Stephania Lour. ở Việt Nam trong chi Stephania Lour. ở Việt Nam
3.1.1. Loài B1 và B2
Sau khi phân tích khảo sát thấy loài B1 và B2 có các đặc điểm tương đồng
với loài Stephania brachyandra Diels và Stephania dielsiana Y. C. Wu. như kết quả
TS. Nguyễn Quốc Huy đã công bố [15]. Do đó, đề tài tiến hành mô tả bổ sung bằng hình vẽ. 1. Cành mang hoa 2. Bộ nhị 3. Hoa đực 4. Củ 5. Hạt
Hình 3.1. Hình vẽ loài Stephania brachyandraDiels
33
Hình 3.2. Hình vẽ loài Stephania dielsianaY. C. Wu.
1. Cành mang hoa 2. Hạt 3. Củ 4. Bầu 5. Hoa đực 6. Hoa cái 1 cm
34
3.1.2. Loài B5
Rễ củ lớn, hình dạng thay đổi vỏ ngoài màu nâu đất có nốt sần màu trắng Thân leo, nhỏ toàn cây không lông.
Lá đơn nguyên, mọc cách; Cuống lá dài 4-9 cm. Phiến lá hình tròn dạng tam giác; Dài và rộng gần bằng nhau 7-12 cm. Gân 10-11, xuất phát từ chỗ đính của cuống lá.
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực xim tán kép. Cuống cụm hoa dài 2-7 cm, gồm 7-10 tán, cuống tán dài 0,5-1 cm. Đài 6, xếp 2 vòng, vòng ngoài hình thìa, cao 1,5-1,6 mm, rộng 0,4-0,6 mm, vòng trong hình trứng, cao 1-1,2 mm, rộng 0,2- 0,4 mm; cánh hoa 3, màu vàng nhạt, cao khoảng 0,7 mm, rộng khoảng 0,6 mm, cong dạng vỏ hến. Cột nhị cao 0,7-1 mm. Bao phấn 4, dính lại thành đĩa.
Cụm hoa cái xim tán kép, cuống dài khoảng 5 mm, có 7-12 tán kép; đài 1, gần như hình trứng, cao khoảng 0,3 mm, có lông mịn; cánh hoa 2, hình trứng cao 0,4-0,8 mm, rộng khoảng 0,5 mm, màu vàng đậm.
Quả hạch, dài khoảng 5 mm, rộng khoảng 4 mm. Hạt hình móng ngựa, trên lưng có 4 hàng gai, mỗi hàng gai chữa 18-19 gai dẹt, dạng móc.
Sau khi đối chiếu với các chuyên luận trong Thực vật chí tổng quát Đông Dương [44], Cây cỏ Việt Nam [14], Thực vật chí Thái Lan [33], Thực vật chí Trung
Quốc [36], [45], đã giám định được tên khoa học của loài B5 là Stephania
kwangsiensis H. S. Lo.Thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae).
Mẫu tiêu bản được lưu ở Phòng tiêu bản trường Đại học Dược Hà Nội, mã số HNIP/17793/11).
35
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
Hình 3.3. Hình ảnh loài Stephania kwangsiensis H. S. Lo.
1. Cành mang lá 5. Hoa đực 9. Tràng hoa đực
2. Củ 6. Đài hoa cái 10. Bầu
3. Cụm hoa cái 7. Đài hoa đực 11. Bộ nhị
36
Hình 3.4. Hình vẽ loài Stephania kwangsiensis H. S. Lo.
1. Cành mang hoa 2. Bầu 3. Hoa cái 4. Nhị 5. Hoa đực 6. Củ 7. Hạt 1 cm
37
3.1.3. Loài B6
Củ không có.
Dây leo, thân nhỏ, nhẵn hay hơi có lông, màu xanh.
Lá đơn, mọc so le, phiến lá hình ba cạnh, gốc lá tròn, đầu lá nhọn; Mép lá nguyên; Mặt trên màu xanh lục đậm, mặt dưới màu nhạt hơn. Gân 8-10, hình chân vịt từ đỉnh của cuống; cuống lá mảnh, dài 4 cm, nhẵn hay hơi có lông, đính ở cách mép gốc lá khoảng 1.5 cm; Gân phụ hình mạng.
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực mọc thành xim tán kép, 7-8 tán con dày đặc, có một lá bắc rất nhỏ chung màu xanh nhạt. Cuống cụm hoa dài 1.5-2 cm. Hoa có cuống dài khoảng 5 mm; đài 6, chia 2 vòng, có gai nhú ở mặt lưng, hình bầu dục; cánh hoa 2, ngắn hơn lá đài 2-3 lần, nhẵn. Nhị đính thành một đĩa có cuống, bao phấn 6.
Cụm hoa cái xim tán kép, cuống dài khoảng 2 cm, gồm 8-12 tán kép, đài 3 hình trứng cao khoảng 0,8 mm, rộng khoảng 0,6 mm; Tràng 3, hình vỏ hến cao 0.6mm, rộng 0,5 mm, màu vàng nhạt, núm nhụy 4-5, xếp thành vòng ở đỉnh bầu.
Quả chín màu đỏ tươi, hình cầu. Hạt có 9-10 đường nổi, 4 hàng u. Ra hoa tháng 4-5, có quả tháng 6-7.
Sau khi đối chiếu với các chuyên luận trong Thực vật chí tổng quát Đông Dương [44], Cây cỏ Việt Nam [14], Thực vật chí Thái Lan [33], Thực vật chí Trung
Quốc [36], [45], đã giám định được tên khoa học của loài B6 là Stephania
hernandifolia (Willd.) Walp thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae).
Mẫu tiêu bản được lưu ở Phòng tiêu bản trường Đại học Dược Hà Nội, mã số HNIP/18072/14).
38
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
Hình 3.5. Hình ảnh loài Stephania hernandifolia (Willd.) Walp
1. Cành mang lá, quả 5. Hoa cái 9. Bộ nhị
2. Quả 6. Hoa đực 10. Hạt phấn
3. Cụm hoa cái 7. Đài hoa đực 11. Hạt
39
Hình 3.6. Hình vẽ loài Stephania hernandifolia(Willd.) Walp
1. Cành mang hoa 2. Hạt
40
3.1.4. Loài B10
Rễ củ, hình cầu, màu xám hoặc màu đất, vỏ có nhiều nốt sần.
Cây leo, thân mảnh, màu tía. Lúc non màu xanh nhạt, già màu xanh đậm. Toàn cây không có lông. Toàn cây có nhựa màu đỏ.
Lá mọc so le. Cuống lá mảnh, dài 2,5-3 cm, màu đỏ tím, cuống lá đính vào khoảng 1/5-1/3 chiều dài phiến lá. Phiến lá hình tam giác rộng, nhẵn bóng hoặc có ít lông. Mép lá nguyên hơi chia thùy, ngọn lá nhọn, gốc lá bằng hoặc hơi lõm, mặt trên có màu xanh lục, mặt dưới màu nhạt hơn. Lá có 8-10 gân nổi rõ, tỏa đều xuất phát từ đỉnh cuống lá.
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa mọc ở nách lá. Cụm hoa cái xim tán kép, có 1 lá bắc chung, cuống dài khoảng 5mm, gồm 7-9 tán; tán có 1 cuống rất ngắn không có lá bắc; mỗi tán có 3 nhánh, mỗi nhánh gồm 3 hoa đều có lá bắc, cuống hoa dài 3mm. Đài 1-2, mép đài cong lên, màu vàng nhạt. Tràng 2-3 kích thước có thể giống hoặc khác nhau, màu đỏ đậm, hình hơi tròn hoặc thuôn dài; Cụm hoa đực xim tán kép, cuống cụm hoa dài 3-4 cm, tán cấp 1 có 5 nhánh dài từ 1,5-2 cm, tán cấp 2 có 5 nhánh dài từ 3-4 mm, trên mỗi nhánh có 4 hoa có cuống hoa dài 1-1,5 mm. Lá bắc màu xanh nhạt, ở mỗi nhánh và ở mỗi hoa. Đài 6, rời, xếp thành 2 vòng, 3 lá đài vòng trong lớn hơn và xếp xen kẽ 3 lá đài vòng ngoài, màu vàng nhạt. Tràng 3, màu vàng đậm hơn đài. Toàn bộ mép cánh hoa uốn cong vào trong. Bộ nhị có chỉ nhị hàn liền thành hình trụ, các bao phấn hàn liền thành hình đĩa.
Quả hình trứng ngược, khi chín có màu đỏ. Hạt hình móng ngựa, có 4 hàng gai nhọn gờ lên ở phía lưng, mỗi hàng gồm 14-18 gai nhỏ, chiều dài hạt khoảng 6-7 mm, chiều rộng 4-5 mm. Giá noãn có lỗ ở giữa. Mùa hoa: tháng 6-7, mùa quả:tháng 7-8.
Sau khi đối chiếu với các chuyên luận trong Thực vật chí tổng quát Đông Dương [44], Cây cỏ Việt Nam [14], Thực vật chí Thái Lan [33], Thực vật chí Trung
Quốc [36], [45], đã giám định được tên khoa học của loài B10 là Stephania venosa
(Bl.) Spreng, họ Tiết dê (Menispermaceae).
Mẫu tiêu bản được lưu ở Phòng tiêu bản trường Đại học Dược Hà Nội, mã số HNIP/18073/14).
41
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11 12
Hình 3.7. Hình ảnh loài Stephania venosa (Bl.) Spreng
1. Cành mang lá 5. Hoa đực 9. Đài hoa đực
2. Củ 6. Hoa cái 10. Tràng hoa cái
3. Cụm hoa đực 7. Đài hoa cái 11. Bầu
42
Hình 3.8. Hình vẽ loài Stephania venosa (Bl.)Spreng.
1. Cành mang hoa 2. Hoa đực 3. Hoa cái 4. Hạt 5. Củ 1 cm
43
3.1.6. Loài B16
Rễ củ gần như hình cầu, một nửa hoặc cả củ nổi lên trên mặt đất, màu xám, vỏ có nốt sần.
Thân leo, mảnh khảnh, màu xanh nhạt, toàn cây không có lông.
Lá mọc so le, hình tam giác gần tròn, đơn, nguyên. Lá già dài 4 - 5cm, rộng 5 -6cm, mặt trên màu xanh rất đậm, mặt dưới màu xanh nhạt hơn. Lá non dài 1.5 - 2.5cm, màu xanh nõn chuối, có đốm màu xanh đậm, cuống lá mọc ở 1/4 phiến lá tính từ gốc lá, có 8 - 9 gân tỏa tròn mọc ra từ điểm đính của cuống lá.
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực dạng tán, mọc ở kẽ lá, có một lá bắc rất nhỏ màu xanh nhạt chung cho cả cụm hoa, cuống chung dài 7mm màu xanh nhạt. mỗi hoa có cuống dài 0.8mm, cong, mọng. Đài 4 hoặc 6, hàn liền, dài 0.5- 1mm hoặc nhỏ hơn, hình móng hoặc hình trứng, màu xanh nhạt, mọng. Không có cánh hoa. Toàn bộ nhị hàn liền, bao phấn dính nhau thành hình đĩa, kích thước