Axít nucleic là phân tử phân cực nên khó hòa tan đƣợc trong các dung môi hữu cơ. Theo phƣơng pháp truyền thống, dung môi hữu cơ hay đƣợc sử dụng để loại bỏ các tạp chất ra khỏi axít nucleic là phenol và chloroform [13, 18, 37].
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 26 Khãa 2009 - 2011
Hình 1.12: Phenol giúp loại bỏ protein ra khỏi axít nucleic [12]
Bƣớc đầu tiên, các tác nhân có tác dụng phá hủy màng tế bào nhƣ Sodium Dodecyl Sunfate (SDS), Triton X-100 đƣợc sử dụng để phá vỡ mô, tế bào, lớp vỏ protein giải phóng ra axít nucleic tạo thành dịch hòa tan. Hexadecyl trimethyl amonium bromide (CTAB) cũng là sự lựa chọn ƣa thích bởi khả năng kết tủa ADN và loại bỏ polysaccharide của nó trong quá trình tách chiết axít nucleic của vi khuẩn, thực vật [16]. Ngoài ra, để ly giải tế bào đạt hiệu quả cao chúng ta có thể sử dụng protease K phân hủy glycoprotein, lysozyme để làm tan các thành phần của thành tế bào vi khuẩn gram dƣơng. Sau đó, dịch ly giải tế bào sẽ đƣợc xử lý bằng phenol để loại bỏ các tạp chất, đặc biệt là protein ra khỏi axít nucleic. Phenol có khả năng hòa tan và làm biến tính protein. Khi bổ sung phenol vào dung dịch đệm chứa axít nucleic, dung dịch sẽ bị phân tách thành hai pha, pha phenol ở dƣới sẽ chứa protein ở dạng hòa tan và pha nƣớc ở trên sẽ chứa axít nucleic. Việc hút pha nƣớc sẽ giúp tách axít nucleic ra khỏi protein. Để cô đặc axít nucleic trong pha nƣớc chúng ta sử dụng ethanol, isopropanol. Để hạn chế tối đa protein còn sót lại, bƣớc chiết xuất bằng phenol có thể đƣợc tiến hành lại nhiều lần. Phenol có khả năng hòa tan nhẹ trong pha nƣớc, nó đƣợc loại bỏ dễ dàng nhờ chloroform. Nếu muốn loại bỏ ARN để chỉ thu đƣợc ADN ta có thể sử dụng ARNase bổ sung vào dịch axit nucleic đã tinh sạch để phân giải ARN [12, 16, 30].
LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ
Khoa Sinh häc 27 Khãa 2009 - 2011
Ưu, nhược điểm của phương pháp
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, dễ tiến hành và giá thành rẻ. Tuy nhiên, nó có nhƣợc điểm là tiêu tốn rất nhiều thời gian để tiến hành các bƣớc tinh sạch, thông thƣờng sẽ mất từ 3-5 giờ thao tác. Hơn nữa, phƣơng pháp này độc hại do phenol là chất gây biến tính nặng protein nên ảnh hƣởng đến sức khỏe của ngƣời làm thí nghiệm nếu hít, chạm phải. Axít nucleic thu đƣợc thƣờng lẫn các tạp chất là các dung môi hữu cơ, chính các chất này lại ảnh hƣởng đến các thí nghiệm tiếp theo.