2.2.1. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen
*Phương pháp xử lí bằng enzym giới hạn
pBluesript II SK-GSH1sau khi kiểm tra và tinh sạch đƣợc xử lý bằng cặp enzyme SacI và XbaI để thu nhận đƣợc gen GSH1. Đồng thời vector chuyển gen pBI121 cũng đƣợc xử lý bằng cặp enzyme SacI và XbaI để loại bỏ gen GUS và tạo ra các đầu nối tƣơng ứng với gen GSH1. Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Bảng 2.2. XbaI và SacI
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ( l) 1 2 3 4 5 Nƣớc deion, khử trùng Buffer Tango 10X SacI (10U/ l) XbaI (10U/ l) DNA(100 ng/ l) 10 3 1 1 15 Tổng 30
Phản ứng đƣợc thực hiện ở 37oC ủ trong 3h. Kết quả cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. DNA ở băng điện di có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc của gen GSH1 đƣợc thu nhận bằng kỹ thuật thôi gel.
*Ghép nối gen GSH1 vào vector chuyển gen pBI121
Gen GSH1 đƣợc ghép nối vào vector pBI121 tạo thành vector tái tổ hợp nhờ enzyme nối T4 DNA ligase. Phản ứng ghép nối đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Bảng 2.3.Thành phần phản ứng ghép nối GSHI vào vector PBI121
Stt Thành phần phản ứng Thể tích(µl) 1 Vector pBI121 mở vòng
(100 ng/ l)
5
2 Gen GSH1(10U/ l) 5
3 T4 DNA ligase Buffer 10X 2
4 T4 DNA ligase 2
5 ddH2O 6
Tổng 20
- Trộn nhẹ hỗn hợp phản ứng
- Ly tâm nhanh để thu hết dịch trên thành ống xuống đáy; - Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 1-2 giờ.
*Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Tế bào E. coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
- Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5ml LB lỏng, lắc 200 v/p ở 370C, qua đêm. Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40
C).
- Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút. Thu cặn và hoà tan trong 30ml CaCl2 0,1M, để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm 4000 v/p ở 40C trong 5 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút).
- Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15-20% glycerol. Chia 50 l dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840
C. Biến nạp:
- Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ tủ -84oC và đƣợc làm tan trên đá. - Bổ sung 5 l vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.
- Hỗn hợp đƣợc đặt trong đá 10-15 phút, rồi đƣợc chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42o
C trong 1 phút 30 giây.
- Sau đó mẫu đƣợc lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong 5 phút.
- Bổ sung 500 l môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong 1 giờ.
- Sử dụng que cấy trải, trải 100-200 l dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 50mg/l kanamycin. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.
*Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR)
Để chọn đƣợc các dòng E.coli mang gen GSH1 chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng PCR.
Bảng 2.4.Thành phần phản ứng colony-PCR
Stt Thành phần Thể tích (µl)
1 Taq Master mix 2X 10
2 GSH1-F(10 pmol/µl) 1
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
4 ddH20 6
5 DNA khuẩn lạc 2
Tổng 20
Chu kỳ nhiệt phản ứng colony-PCR
Sau khi khuếch đại gen GSH1 từ plasmid bằng PCR, sản phẩm đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
*Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn
Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng chọn lọc có thể là những dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp hoặc những dòng bị nhiễm. Vậy cần phải tách chiết plasmid để kiểm tra. Chọn khuẩn lạc to, tròn nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh để tách plasmid kiểm tra.
Quy trình tách chiết plasmid theo Sambrook và Rusell (1989):
+ Nguyên tắc: Màng tế bào vi khuẩn đƣợc phá vỡ bằng dung dịch kiềm ( NaOH) và chất tẩy mạnh (SDS).Các tạp chất và DNA nhiễm sắc thể đƣợc kết tủa và tách ra bằng ly tâm.DNA plasmid còn lại đƣợc kết tủa bằng isopropanol hoặc ethanol.
+ Hóa chất Bảng 2.5 STT Sol I Sol II Sol III
50 mM glucose; 25mM tris HCl pH 8,0; 10mM EDTA pH 8,0 0,2 NaOH; SDS 1%
60ml acetat potassium 5M; 11,5 ml acid acetic; 28,5ml H2O
10 phút 1 phút ∞ 94oC 94o C 52oC 72oC 72oC 4oC 4 phút 40s 30s 30 chu kỳ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 117o 4oC.
Các hóa chất khác: Chloroform, isopropanol, ethanol 70%.
Các bước tiến hành
- Dùng tăm vô trùng lấy 2 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào 2 ống chứa 4ml LB lỏng bổ sung kanamycin 50 mg/l. Mỗi ống chứa một khuẩn lạc đem nuôi thành 1 dòng. Nuôi các dòng trong máy lắc, tốc độ 220 vòng/phút ở 37oC, qua đêm;
- Ly tâm 2ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm 10000 vòng/phút trong 2 phút; bỏ dịch trong, thu lấy cặn tế bào, để cặn khô;
- Hòa cặn trong 100 l sol I, votex, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; - Thêm 200 l sol II, đảo nhẹ, ủ trên đá 3 phút;
- Thêm 150 l sol III, ủ trên đá 5 phút;
- Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong;
- Bổ sung 1 thể tích hỗn hợp Chloroform:Isoamyl (tỷ lệ 24:1), đảo nhẹ; - Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ thƣờng, 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch pha trên;
- Bổ sung 0,6 đến 1 thể tích isopropanol 100%, ủ 20 phút trong đá; - Ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu lấy tủa DNA;
- Rửa tủa bằng cách bổ sung 0,5 ml cồn 70% lạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ dịch trong;
- Để khô tủa, hòa tan tủa trong 20-30 l nƣớc hoặc TE có bổ sung RNase đến nồng độ cuối cùng là 30 g/ml;
- Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8%. * Kiểm tra plasmid bằng cắt enzyme giới hạn
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Plasmid sau khi tách chiết sẽ đƣợc cắt đồng thời bằng 2 enzyme XbaI và
SacI để kiểm tra. Thành phần phản ứng cắt nhƣ đã mô tả ở trên. Sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
*Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens EHA105 bằng phương pháp xung điện
Nguyên lý : Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phƣơng pháp cơ học đƣợc sử dụng để đƣa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phƣơng pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép photpholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trƣờng xâm nhập vào bên trong tế bào.
Quy trình: Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ tủ -84oC và đƣợc làm tan trên đá. Bổ sung plasmid vào tế bào khả biến và mix nhẹ, sau đó chuyển vào cuvet. Tiến hành xung điện ở mức 2,5 kV; 25µF và điện trở 400 Ω. Đặt cuvet vào đá. Sau 5 phút bổ sung 1 ml LB lỏng và mix nhẹ. Ủ hỗn hợp ở 28o
C trong 1 giờ trên máy lắc. Sử dụng que cấy trải, trải 300 µl dịch khuẩn lên các đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chloramfenicol 25mg/l và rifamycin 50mg/l. Ủ đĩa ở 28oC từ 24 - 48 giờ. Các khuẩn lạc thu đƣợc đã đƣợc kiểm tra bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhƣ trình bày ở trên.
2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
*Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium
Chọn chủng khuẩn mang vector tái tổ hợp cấy vạch lên môi trƣờng LB đặc có bổ sung các kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50mg/l, rifamycine 50mg/l, chloramphenicol 25mg/l) nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C trong thời gian 48 giờ.
Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn, cấy vào 7 ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc nhƣ khi nuôi ở môi trƣờng LB đặc. Bình nuôi lỏng đƣợc đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 280
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
50 ml dung dịch LB lỏng không bổ sung kháng sinh để nuôi phục hồi trong vòng 4 giờ. Sau đó ly tâm dịch khuẩn 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40
C và hòa tan trong dung dịch ½ MS (pH 5,8). Sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens có mật độ OD600nm = 0,5 - 0,8 để biến nạp.
*Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
Chọn lá có kích thƣớc vừa phải ở các cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi. Dùng dao cắt phiến lá thành những mảnh lá nhỏ hình vuông có kích thƣớc 1cm2. Các mảnh lá sẽ đƣợc đặt lên môi trƣờng cảm ứng chồi GM (MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar + pH 5,8) trong 2 ngày.
*Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Ngâm khoảng 30 mảnh lá trong đĩa petri chứa 30 ml dung dịch huyền phù vi khuẩn. Các mảnh lá đƣợc ngâm và lắc nhẹ với dung dịch trên trong vòng 10 phút. Các mảnh lá đƣợc thấm khô trên giấy thấm khử trùng
2 ngày để đồng nuôi cấy.
*Sàng lọc vật liệu mang gen
Sau 2 ngày đồng nuôi cấy, các mảnh lá đƣợc thấm khô rồi chuyển sang môi trƣờng chọn lọc tạo chồi GM Km50
cefotaxim 5 50 mg/l và chất kích
thích tạo chồi BAP (6 - Benzylaminopurine) 1 mg/l. Sau 3-4 tuần xuất hiện các chồi nhỏ từ các mảnh lá. Tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trƣờng MS Km50 (MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH 5,8 và có chứa các kháng sinh kanamycine 50 mg/l, cefotaxime 500 mg/l).
*Ra rễ và ra cây
Khi các chồi đạt chiều cao khoảng 2-3 cm tiến hành tách các chồi này và chuyển sang môi trƣờng ra rễ RMTL (MS + 0,1 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH 5,8 và có bổ sung các kháng sinh 50 mg/l kanamycine, 500 mg/l cefotaxime). Sau 3 tuần, các cây in vitro có bộ rễ khỏe mạnh đƣợc chuyển ra trồng trên giá thể TN1 (Viện Nông hóa thổ nhƣỡng) và giữ trong
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
nhà cây có nhiệt độ 25 ± 20C. Cây phát triển với 4-5 lá thật thì chuyển ra trồng trong điều kiện nhà lƣới.
2.2.3. Các phương pháp phân tích cây chuyển gen.
*Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Bảng 2.6.Thành phần dung dịch tách chiết DNA
Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng
Tris- HCl (pH= 8) 1 M 100mM
NaCl 5 M 2M
EDTA 0,5 M 20mM
CTAB Bột 4%
Sau khi trộn lẫn các thành phần, để hỗn hợp vào bể ổn nhiệt 650 C khoảng 1 giờ, thỉnh thoảng lắc để CTAB tan hết.
Các bước tiến hành
- Lấy khoảng 0,1 g lá mỗi mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 2 bi đã đốt khử trùng rồi cho vào Nitơ lỏng. Nghiền mẫu bằng máy thành dạng bột mịn.
- Bổ sung 800 μl đệm tách, sau đó đảo nhẹ tạo thành dạng hỗn hợp đồng nhất, ủ trong bể ổn nhiệt 650
C trong 60 phút.
- Bổ sung 800 μl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl (24:1) rồi đảo đều. - Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút để tách hỗn hợp làm hai pha. Hút cẩn thận dịch nổi cho sang eppendorf mới (600 μl).
- Nếu dịch nổi vẫn còn lẫn cặn, tủa thêm một lần nữa bằng cách bổ sung 400 μl hỗn hợp C:I, sau đó đảo đều rồi ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút. Hút cẩn thận dịch nổi cho sang eppendorf mới (400 μl).
- Tủa dịch nổi bằng Isopropanol để lạnh (1:1) sau đó đảo nhẹ, để vào tủ -200C trong 30 phút.
- Ly tâm 13.000v/p trong 10 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi.
- Rủa tủa bằng Ethanol 80% (để lạnh) 2 lần. Lần 1 ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút, lần 2 ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
- Làm khô DNA trong box hoặc bằng máy Speed Vax. Sau đó hòa tan cặn DNA trong 50 μl ddH2O có bổ sung RNase 100 μg/μl.
- Để ở tủ 370C cho RNase hoạt động trong 1 giờ. Bảo quản mẫu ở tủ - 200C.
*Phương pháp PCR kiểm tra cây chuyển gen *Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzyme Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần.
Bảng 2.7.Thành phần phản ứng PCR nhân gen GSH1
Stt Thành phần Thể tích (µl) 1 Taq Master mix 2X 10 2 GSH1-F1(10 pmol/µl) 1 3 GSH1-M1(10 pmol/µl) 1
4 ddH20 6
5 DNA khuôn (100 pmol/µl) 2
Tổng 20
Thực hiện phản ứng theo chu kỳ nhiệt nhƣ sau:
10 phút 1 phút 30s ∞ 94oC 94o C 52oC 72oC 72oC 4oC 4 phút 40s 30s 30 chu kỳ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
Sau khi khuếch đại gen GSH1 từ plasmid bằng PCR, sản phẩm đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
*Điện di
Agarose 0,8-1% pha trong dung dịch đệm TAE 1X đƣợc đun sôi, để nguội khoảng 50-60oC, đổ dung dịch vào khay gel. Khi gel đông đặt khay gel vào bể điện di. Tra mẫu DNA trộn với đệm (tỉ lệ 5V mẫu : 1V đệm) vào các giếng trên bản gel. Chạy với hiệu điện thế từ 80-120V. Quan sát các dải DNA bằng cách nhuộm gel vào dung dịch Ethidium bromide (EtBr) 100 μl/l khoảng 10-15 phút. Sau đó rửa bản gel bằng nƣớc và soi dƣới ánh sáng tử ngoại 300 nm.
*Đánh giá khả năng phát triển của các dòng cây chuyển gen trên môi trường chứa As
Các dòng cây dƣơng tính với phản ứng PCR đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này, tiến hành lấy các dòng cây chuyển gen trong điều kiện in vitro
sinh trƣởng, phát triển tốt trên môi trƣờng RMTL có bổ sung kháng sinh chọn lọc để bố trí thí nghiệm. Đồng thời tiến hành song song với cây đối chứng không đƣợc chuyển gen, có cùng ngày tuổi nuôi cấy và kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau. Cắt các chồi thuốc lá khỏe mạnh, cao khoảng 3 cm đặt vào môi trƣờng ra rễ RMTL có bổ sung As (V) (Na2HAsO4) với các nồng độ khác nhau: 0 M, 50 M, 100 M, 150 M.. Sau 10 ngày, tiến hành đánh giá khả năng phát sinh rễ, khả năng sinh trƣởng, phát triển của các dòng cây này.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen
3.1.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121/GSH1
Vector pBluescript II SK-GSH1 đƣợc tinh sạch và cắt bằng cặp enzyme
giới hạn XbaI và SacI nhằm thu cấu trúc gen GSH1 có đầu so le. Tƣơng tự vector chuyển gen pBI121 cũng đƣợc xử lý bằng cùng một cặp enzyme XbaI và SacI để loại bỏ gen GUS và tạo ra đầu tƣơng ứng có thể liên kết bổ sung
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/
với hai đầu của gen GSH1. Kết quả phản ứng cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% nhƣ trên hình 3.1, 3.2 cho thấy: gen GSH1 đã đƣợc cắt ra khỏi vector pBluescript II SK-GSH1 và đồng thời vector pBI121 đƣợc mở vòng loại bỏ gen GUS. Cấu trúc gen GSH1 và vector pBI121 đã mở vòng đƣợc thu lấy bằng tinh sạch từ bản gel agarose.
Hình 3.1. Kết quả xử lý vector
pBluescript II SK-GSH1 bằng cặp enzyme giới hạn XbaI và