Dựa vào hình 3.11 và bảng phụ lục 13, ta thấy rằng, sau 4 ngày nuôi cấy, thì chủng L. lecanii N30.8 đạt hoạt tính chitinase cao nhất là 1,905 UI/ml. Sau đó các ngày tiếp theo, hoạt tính enzyme giảm dần. Theo nhƣ Nguyễn Đức Lƣợng và cs đã biết, mỗi loại có một thời gian tăng trƣởng tối ƣu khác nhau, thƣờng thi hoạt tính
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
MnCl2 MgSO4 FeSO4 CaCl2
Hoạt tí nh chit inase (UI/ ml )
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
chitinase đạt mạnh nhất ở thời điểm bào tử mới bắt đầu hình thành. Thời gian nuôi cấy càng lâu thì hoạt tính enzyme càng giảm [4].
Tuy nhiên, tại ngày thứ 8, hoạt tính enzyme đột nhiên tăng mạnh, đạt 1,723 UI/ml, tuy nhiên thấp hơn ngày thứ 4. Điều này có thể đƣợc giải thích do trong quá trình phát triển của vi sinh vật, khi đạt đến mức ổn định, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Lúc này tốc độ sinh trƣởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất giảm thì sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng giảm. Tuy nhiên trong quá trình này, vi sinh vật có thể tạo ra một số chất làm nguồn dinh dƣỡng. Từ nguồn dinh dƣỡng này, làm cho vi sinh vật bắt đầu phát triển, tạo ra các tế bào mới, làm tăng hoạt tính enzyme.
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sản xuất chitinase của chủng đột biến N30.8 chọn lọc 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Hoạt tí nh chiti nase (U/m l)
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B 3.2.10. So sánh giữa môi trƣờng tối ƣu và môi trƣờng cơ bản
Nuôi chủng L. lecanii N30.8 trong 3 loại môi trƣờng xốp bao gồm:
Môi trƣờng cơ bản: là môi trƣờng chỉ gồm có 15g cơ chất là bột ngô và cám gạo (theo tỷ lệ 6:4, w/w), bổ sung thêm 50% độ ẩm là nƣớc.
Môi trƣờng bổ sung crapek: có thành phần giống môi trƣờng cơ bản, chỉ khác là thay nƣớc bằng khoáng crapek để tạo độ ẩm.
Môi trƣờng tối ƣu: là môi trƣờng tập hợp tất cả các yếu tố đã tối ƣu nêu trên bao gồm 15g bột ngô và cám gạo (6:4, w/w), 0,1% NH4Cl, 0,1% MgSO4, bổ sung đệm citrat 50% tạo độ ẩm, chỉnh môi trƣờng về pH6.
Tất cả các môi trƣờng trên, đƣợc bổ sung 0,1% chitin, 10% giống, đem nuôi trong 4 ngày ở 260C.
Hình 3.12: Hoạt tính chitinase của Lecanicillium lecanii N30.8 ở các môi trƣờng lên men khác nhau
Chủng N30.8 đƣợc lên men ở môi trƣờng xốp tối ƣu, làm tăng hoạt tính chitinase (1,611 UI/ml) hơn 1,2 lần so với môi trƣờng xốp có khoáng Crapek (1,319 UI/ml) và hơn 1,8 lần so với môi trƣờng cơ bản (0,913 UI/ml).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Môi trƣờng cơ bản Môi trƣờng bổ sung crapek Môi trƣờng tối ƣu Hoạt tí nh chiti nase (UI/ ml )
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B 3.3. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHITINASE
3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme
Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất chitin keo đến hoạt tính chitinase, phản ứng đƣợc diễn ra ở 400C trong 2 giờ, với các nồng độ cơ chất 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%. Từ kết quả ở bảng phụ lục 15 và hình 3.13 cho thấy, ở nồng độ 0,01% và 0,5%, hoạt tính chitinase tăng dần theo việc tăng hàm lƣợng chitinase và đạt mức cao nhất ở nồng độ 0,5% (hoạt tính chitinase là 1,997 UI/ml). Tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì hoạt tính chitinase lại giảm dần. Nhƣ vậy, nồng độ cơ chất tối ƣu cho phản ứng của chitinase từ L. lecanii
N30.8 là 0,5%.
Hình 3.13: Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính chitinase
3.3.2. Nhiệt độ tối ƣu
Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính chitinase đƣợc tiến hành dựa trên cơ sở kiểm tra hoạt tính enzyme ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau. Tất cả điều kiện phản ứng là giống nhau, chỉ có sự khác biệt về nhiệt độ phản ứng.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 Hoạ t tính chiti na se (UI/m l) Nồng độ cơ chất Hoạt tính chitinase
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Kết quả ở bảng phụ lục 16 và hình 3.14 cho thấy, hoạt tính chitinase ở 300C là 1,370 UI/ml. Các nhiệt độ tiếp theo, lƣợng đƣờng khử tạo ra tăng dần làm hoạt tính tăng theo. Ở 400
C, hoạt tính chitinase tăng đến 1,563 UI/ml và đạt cao nhất ở 500C với hoạt tính là 2,025 UI/ml. Ở các nhiệt độ tiếp theo, hoạt tính chitinase giảm thấp đi. Đến 700
C hoạt tính giảm xuống chỉ còn 0,338 UI/ml.
Florido và các cs (2009) đã nghiên cứu đặc tính chitinase từ chủng L. lecanii
ATCC 26854 và chỉ ra nhiệt độ tối ƣu cho chitinase là 500C [39]. Nhiệt độ tối ƣu của chitinase từ chủng nấm A. protubeus là 550C [4].
Hình 3.14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính chitinase
3.3.3. pH tối ƣu cho hoạt động chitinase
Dựa vào kết quả ở phụ lục 17 và hình 3.15, chitinase do chủng L. lecanii
N30.8 sinh ra có hoạt tính cao nhất ở pH 5, đạt 2,071 UI/ml. Hoạt tính chitinase giảm mạnh, khi môi trƣờng có xu hƣớng kiềm hóa. Điều này phù hợp với một số nghiên cứu khác nhƣ chủng A. protubeus có pH tối ƣu cho hoạt động chitinase là 5 [4], chủng L. lecanii ATCC 26854 thì lại có pH tối ƣu là 6 [39].
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 30 40 50 55 60 65 70 Hoạt tí nh chiti nase (UI/ ml ) Nhiệt độ (0C) Hoạt tính chitinase
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Hình 3.15: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính chitinase
3.3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại
Dựa vào bảng phụ lục 18 tác động của ion kim loại đến hoạt tính của chitinase tách chiết từ L. lecanii N30.8. Ta thấy rằng, ion Ca2+ và ion K+ kích thích tăng hoạt tính chitinase từ 15% - 17% so với đối chứng. Florido và các cs (2009) cũng chỉ ra nhóm 2 ion kim loại Ca2+ và K+ có tác dụng làm tăng hoạt tính chitinase [39]. Hai ion Mg2+ và Fe2+ lại không ảnh hƣởng rõ rệt đến hoạt tính chitinase. Tỷ lệ giảm hoạt tính của 2 ion này chỉ từ 3% - 4% so với đối chứng. Trong khi đó ion Cu2+ làm giảm 12%, ion Mn2+ làm giảm đến 18% hoạt tính chitinase.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3 4 5 6 7 8 9 10 Hoạt tí nh chiti nase (µm o/m l) pH Hoạt tính chitinase
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Sau đột biến lần 2 từ chủng Le85, đã chọn và sàng lọc ngẫu nhiên ra đƣợc
61 dòng đột biến (33 dòng đột biến bởi NTG và 28 dòng đột biến bởi NTG + UV). Chọn đƣợc dòng N30.8 và 2 dòng NV60.1 và NV150.2 có hoạt tính cao hơn hẳn so với chủng gốc ban đầu (Le85) và chủng đột biến lần I (Ne180.7).
2. Chủng L. lecanii N30.8 có khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt tính cao trên môi trƣờng xốp là hỗn hợp bột ngô và cám gạo (6:4, w/w) có bổ sung chitin 0,1% ~ 0,5%, độ ẩm 50%, pH6, NH4Cl (0,1%) và MgSO4 (0,1%) trong thời gian lên men 4 ngày. Hoạt tính chitinase đạt 1,611 ± 0,115 U/ml hơn 1,8 lần so với trƣớc khi tối ƣu.
3. Chitinase cho hoạt tính cao ở 500C, pH 5 và nồng độ cơ chất chitin keo 0,5%.
4. Ion Ca2+ và ion K+ làm tăng hoạt tính chitinase từ 15% - 17%. Mg2+ và Fe2+ làm giảm hoạt tính của chitinase từ 3% - 4% so với đối chứng, trong khi đó Cu2+ làm giảm 12%, ion Mn2+ làm giảm đến 18% hoạt tính chitinase.
Kiến nghị:
1. Nghiên cứu khả năng ứng dụng của các chủng đột biến trong việc tạo thuốc trừ
sâu sinh học và sản xuất cao sản chitinase.
2. Nghiên cứu xác định điểm đột biến trên chitinase từ chủng nấm đột biến có hoạt
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
1. Lê Quỳnh Hoa, Vũ Văn Hạnh, Nguyễn Ngọc Mai, Quyền Đình Thi (2013), “Nâng cao khả năng sinh tổng hợp chitinase từ chủng nấm kí sinh Lecanicilium
lecanii trên rệp hại ngô”, Quyển 1: 223-227. Proceedings, Hội nghị KH CNSH toàn
quốc 2013.
2. Nguyễn Ngọc Mai, Vũ Văn Hạnh (2013), “Nâng cao khả năng sản xuất chitinase của chủng nấm kí sinh côn trùng bằng kỹ thuật đột biến”, Quyển 2: 364- 368. Proceedings, Hội nghị KH CNSH toàn quốc 2013.
3. Nguyễn Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Mai, Vũ Văn Hạnh (2013), “Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng
Lecanicilium đột biến”, Quyển 2: 379-383. Proceedings, Hội nghị KH CNSH toàn
quốc 2013.
4. Kim K, NM Nguyen, VH Vu, DT Quyen, TN Nguyen, HM Bach, NT Hoang, TMH Nguyen and THM Nguyen (2013), “Improvement of Chitinase Production Capacity of Entomopathogenic fungi by Mutation Techniques”, Int’l meeting of Fed. Korean Micro. Soci. Seoul, Octerber 17 -18.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng việt
1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục.
2. Hồ Văn Chiến (2013), “Một số sâu bệnh mới trên cây trồng”, Hội nghị Tình hình xuất hiện, gây hại và tiến độ nghiên cứu của một số dịch hại chính trên cây
trồng ở các tỉnh phía Nam.
3. Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế (1999), Nấm mốc và phương pháp phòng chống, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Hà (2012), “Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase đƣợc phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí Khoa học, 22 (b), tr. 26 – 35.
5. Vũ Văn Hạnh, Lê Thị Thùy Dƣơng, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Thu Thủy (2012), “Nâng cao độc lực diệt rệp đào của chủng nấm kí sinh côn trùng
Lecanicillium bằng đột biến tia cực tím (UV) và N-methyl-N’-nitro-N-
nitrosoguanidine (NTG) nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”, Tạp chí Khoa học
và Công nghệ, 50 (2), tr. 197 – 209.
6. Đinh Minh Hiệp (2004), “Nghiên cứu quy trình tách chiết và ứng dụng của nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (Coprinus fimentarius)”, Báo cáo tổng kết
nghiệm thu, Sở Khoa học và Công nghệ TP. HCM, tr 153 – 160.
7. Nguyễn Văn Mùi (2011), Thực hành hóa sinh, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. 8. Nguyễn Đinh Nga, Đinh Minh Hiệp, Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2010), “Đánh giá tác động in vivo trên nấm Trichophyton mentagrophytes và
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
từ vi nấm Tricoderma longibrachiatum”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 14 (1), tr 498 – 503.
9. Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (2007), “Đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae (METSCH.) Sorokin đối với sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.)”, Tạp
chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, 1 & 2, tr. 58 – 63.
10. Phạm Thị Đan Phƣợng, Trang Sĩ Trung (2012), “Tính chất của chitin và chitosan từ vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) khử protein bằng phƣơng pháp hóa học và sinh học”, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, 3, tr. 48 – 52. 11. Đặng Trung Thành (2008), “Bƣớc đầu nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase trong cây khoai lang (Ipomoea batatas) tại Khánh Hòa, Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản, 3.
12. Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú (2007), “Nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu vỏ tôm bằng các phƣơng pháp sinh học”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 45 (4), tr. 43 – 50.
13. Phạm Thị Thùy, Trần Văn Huy, Nguyễn Duy Mạn (2005), “Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tƣơng và đậu xanh ở Hà Tĩnh năm 2003 – 2004”, Hội nghị Công
nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội.
14. Nguyễn Thị Hồng Thƣơng, Đồng Thị Thanh Thu, Đinh Minh Hiệp (2003), “Khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzym chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma spp.”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần
thứ II nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp và y học tại Huế, NXB Khoa
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
15. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), Bảo vệ cây trồng
bằng các chế phẩm từ vi nấm, Nxb Nông Nghiệp.
16. Nguyễn Viết Tùng (1990), “Một số nhận xét về kẻ thù tự nhiên của rệp muội hại cây trồng ở vùng Đồng bằng sông Hồng”, Báo cáo khoa học Hội nghị côn trùng
lần thứ I, Hà Nội.
17. Hồ Tuyên, Nguyễn Thị Hồng Liên, Lê Gia Hy (2009), “Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng lên men sinh tổng hợp cephalosporin của biến chủng Acremonium
chrysogenum AC 880-33”, Báo cáo Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, tr.
228 – 231.
18. Nguyễn Quỳnh Uyển, Nguyễn Xuân Trƣờng, Phạm Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Trần Quốc Việt (2010), “Nghiên cứu một số tính chất và sử dụng hoá chất gây đột biến NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào của vi khuẩn Bacillus sp.”, Tạp chí khoa học Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa
học Tự nhiên và Công nghệ, 4, tr. 121 – 128.
II. Tài liệu tiếng Anh
19. Ahmad S., Khan I. A., Hussain Z., Shah S. I. A. and Ahmad M. (2007), “Comparison of a biopesticide with some synthetic pesticides against aphids in rapeseed cropp”. Sarhad Journal of Agricultural, 23 (4).
20. Akhtar L. H., Hussain M., Iqbal R. M., Amer M. and Tariq A. H. (2010), “Losses in grain yield caused by Russian wheat aphid Diuraphis noxia
(Mordvilko)”. Sarhad Journal of Agricultural, 26 (4), pp. 625 - 628.
21. Anderson C. M. T., McGee P. A., Nehl D. B. and Mensah R. K. (2007), “The fungus Lecanicillium lecanii colonises the plant Gossypium hirsutum and the aphid
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
22. Askary H., Carriere Y., Belanger R. R. and Brodeur J. (1998), “Pathogenicity of the Fungus Verticillium lecanii to Aphids and Powdery Mildew”. Biocontrol
Science and Technology, 8 (1), pp. 23 - 32.
23. Berger L. R. and Reynolds D. M. (1958), “The chitinase system of a strain of
Streptomyces griseus”, Biochimica et Biophysica Acta, 29, pp. 522 - 534.
24. Bhushan B. and Hoondal G. S. (1998), “Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus spp. BG-11”.
Biotechnology Letters, 20 (2), pp. 157 - 159.
25. Bodenheimer F. S. and Swirski E. (1957), The Aphidodea of the Middle East, The Weizmann Science Press of Israel, Jerusalem.
26. Brar K. S., Bakhetia D. R. C. and Sekhon B. S. (1987), “Estimation of losses in yield of rapeseed and mustard due to mustard aphid”. Journal of Oilseeds
Research, 4 (2), pp. 261 - 264.
27. Brisson J. A. and Stern D. L. (2006), “The pea aphid, Acyrthosiphon pisum, An emerging genomic model system for ecological, developmental, and evolutionary studies”. Faculty Publications in the Biological Sciences, 28(7), pp. 747 - 755.
28. Brust G. E. (2010), Early season aphid and thrips populations, University of Maryland, College Park.
29. Carrión G. and Rico-Gray V. (2002), “Mycoparasites on the coffee rust in Mexico”. Fungal Diversity, 11, pp. 49 - 60.
30. Chaiharn M., Lumyong S., Hasan N. and Plikomol A. (2012), “Solid-state cultivation of Bacillus thuringiensis R 176 with shrimp shells and rice straw as a substrate for chitinase production”. Annals of Microbiology, 63 (2), pp. 443 - 450.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
31. Chand P., Aruna A., Maqsood A. M. and Rao L. V. (2005), “Novel multation method for increased cellulose production”. Journal of Applied Microbiology, 98, pp. 318 - 323.
32. Chang W. T., Chen C. S. and Wang S. L. (2003), “An antifungal chitinase produced by Bacillus cereus with shrimp and crab shell powder as a carbon source”. Current Microbiology, 47 (2), pp. 102 - 108.
33. Charles J. (1963), Chitinase - Methods of enzymology, Vol. 4, pp. 644 – 650. 34. Dahiya N., Tewari R., Tiwari R. P. and Hoondal G. S. (2005), “Chitinase from Enterobacter spp. NRG4, Its purification, characterization and reaction pattern”. Electronic Journal of Biotechnology, 8 (2), pp. 134 - 145.
35. Dong J. Z. and Dunstan D. I. (1997), “Endochitinase and beta-1,3-glucanase genes are developmentally regulated during somatic embryogenesis in Picea glauca”, Planta, 201 (2), pp. 189 - 194.
36. Duo-Chuan L. I., Chen S. and Jing L. U. (2005), “Purification and partial characterization of two chitinases from the mycoparasitic fungus Talaromyces
flavus”. Mycopathologia, 159, pp. 223 - 229.
37. El-Gewely M. R. (1996), Biotechnology Annual Review, Vol. 2, Elsevier Science & Technology Rights, Amsterdam.
38. Faria M. R. D. and Wraigh S. P. (2007), “Mycoinsecticides and Mycoacaricides, A comprehensive list with worldwide coverage and international