2 .Các phản ứng thủy phân tiêu biểu trong công nghệ sản xuất nước tương
2.4 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 2.3.1.1 Môi trường dinh dưỡng
Yêu cầu cơ bản đối với thành phần ni cấy vi sinh vật là tính hồn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo amylase đều hấp thụ cacbon chủ yếu ở dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin,…) hydro ở dạng nước và của các HCHC, oxy ở trong thành phần cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.
Hàm lượng tinh bột trong môi trường nuôi cấy khơng được ít hơn 20-23%. Người ta thấy rằng khi hàm lượng tinh bột trong mơi trường giảm đi thì hoạt độ của enzyme cũng sẽ bị giảm.
2.3.1.2 Độ ẩm môi trường
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích đối với Aspergillus oryzae là 58- 70% và phải giữ cho mơi trường có độ ẩm trong suốt q trình ni. Nếu thấy độ ẩm tăng q mức này thì sẽ làm giảm độ thống khí của mơi trường, cịn thấp hơn thì sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo ra enzyme amylase. Cần nhớ rằng khi nuôi cấy trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay) thì độ ẩm của mơi trường sau khi cáy giống khơng được vượt q 60%, vì cao hơn sẽ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (nhằm phòng ngừa và hạn chế sự hong khơ của mơi trường) trong suốt q trình sinh trưởng của nấm sợi lại cịn có ý nghĩa to lớn hơn vì khi bị hong khơ thì hoạt lực của enzyme sẽ giảm đi rất nhiều. Điều đó khẳng dịnh sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thơng khi trong suốt thời kỳ sinh của vi sinh vật. Trong quá trình sinh trưởng của mình, vi sinh vật tiêu thụ khoảng 25-35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy, cần phải thải nhiệt này bằng thơng gió với khơng khí vơ trùng. Chế độ thơng khí có thể liên tục, giai đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và khay. Thường là
ởgiai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thơng khí vào phịng ni khoảng 4-5 làn thể tích khơng khí trên một thể tích phịng trong một giờ, cịn ở giai đoạn thứ hai là 30-60% thể tích khơng khí trên thể tích phịng trong 1h, cịn ở giai đoạn thứ ba giảm đi 10-12% thể tích khơng khí mà thơi.
2.3.1.3 Nhiệt độ ni
Tồn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc có thể chia làm ba chu kỳ:
+Thời kỳ trươn và nảy mầm của đính bào tử (10-11h đầu tiên). Trong thời kỳ phải đốt nóng khơng khí phịng ni không thấp hơn 23-300C. Độ ẩm thời kỳ này phải đơt khơng khí phịng ni khơng thấp hơn 23-300C, Độ ẩm tương đối khơng khí là 96- 100%.
+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4-18h). Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong lớp
sợi nấm mốc đang mọc, Nhiệt độ sẽ tăng lên đến 37-400C, đơi khi tới 470C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ khơng khí vơ trùng có nhiệt độ 28-390C và độ ẩm cao vào phịng ni.
+ Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ (kéo dài 10-20h). Trong thời gian này các quá trình trao đổi chất dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Aspergillus oryzae chỉ tạ được 7,5-8% enzyme, trong vòng 12h sau, hoạt lực của enzyme, trong vòng 12h sau, hoạt lực của α –amylase tăng 9-12 lần, hoạt lưc đường hóa tăng 2 lần và hoạt lực oligo – 1,6 – glucosidase tăng lên 10 lần. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn naỳ nên hạ nhiệt độ xuống 3-40C so với ban đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc môi trường rắn là 28-300C.
2.3.1.4 Thời gian nuôi
Thời gian nuôi để vi sinh vật tạo ra lượng enzyme cao thưởng được xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng khơng mong muốn vì thường làm giảm hoạt động của enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzyme amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử.
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 2.3.2.1 Môi trường dinh dưỡng
Khác với phươn pháp nuôi cấy bề mặt, trong phươn pháp nuôi cấy bề sâu người ta sẽ cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng. Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích hợp cho mỗi chủng vi sinh vật sẽ khác nhau.
Trong nhiều trường hợp, môi trường nuôi cấy bề sâu thường chứa tinh bột, các dạng bột, và một số vật liệu khác làm nguồn Cacbon là các đường dễ dàng đồng hóa như glucose. Thực tế, trong một số trường hợp người ta đường hóa sơ bộ tinh bột amylase (trước khi vịa thanh trùng). Khi đó maltose được tạo thành sẽ được đồng hóa tốt hơn và so với tinh bột, maltose là chất cảm ứng tốt hơn của enzyme đường hóa của
nấm mốc. Ngồi ra thể lỗng của mơi trường cung tốt hơn của nó bị giảm xuống một cách sâu sắc.
2.3.2.2 pH môi trường
Trị số pH ban đầu của mơi trường cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chi số bởi vi sinh vật. Thông thường đối với α –amylase, pH tối ưu cho sinh tổng hợp là khoảng 7-8 khác với pH tối ưu hoạt động của nó là khoảng 4,7-4,9.
2.3.2.3 Sục khí và khuấy trộn
Sự sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch ni cấy. Trong q trình sinh trưởng của mình, vi sinh vật sử dụng oxy phân tử cho hoat động sống nên lượng oxy hịa tan trong mơi trường lỏng phải ln được bổ sung. Chính vì đó, việc sục khí khuấy đâỏ mơi trường có tác dụng tốt sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp các enzyme vi sinh vật.
Nhiều cơng trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muôn nuôi vi sinh vật (gồm nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) tạo enzyme có hiệu st cao thì khuấy đảo mơi trường bằng sục khí hoặc máy khuấy làm việc liên tục trong suốt q trình ni. Việc chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh trưởng và phát triển VSV hiếu khí trong điều kiện ni chìm mà cịn sự sinh tổng hợp enzyme amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 khơng khí vơ trùng (nhiệt độ không quá 400C) trên 1m3 môi trường trong 1h vói thời gian ni trong khoảng 68- 72h. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống (48h) và trong các thùng lên men sản xuất (48-52h) thì lượng khơng khí cần sục vào mơi trường để nuôi
Aspergillus oryzae 3-9-15 phải là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và là 40m3/m3 môi trường/ giờ thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu trường để ni
Aspergillus oryzae 3-9-15 tương ứng với 180 micromol O2/lít mơi trường (nồng độ oxy hồn tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hoàn tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần
từ lúc bắt đầu pha ổn định. Ni VSV ưa nhiệt địi hỏi nhiều khơng khí hơn là ni VSV ưa ẩm. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ tương đối cao (50-650C), độ hịa tan của oxy trong mơi trường giảm xuống, mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt về oxy cho các phản ứng oxy hóa lại tăng lên.