Phản ứng màu của P2O5 chuẩn với thuốc thử- 123docz.net

 Thí nghiệm đánh giá khả năng hịa tan lân khó tan của vi khuẩn:

- Chủng vi khuẩn đã nuôi trong môi trường SW – LB vào bình tam giác chứa 50ml mơi trường Aleksandrov lỏng. Sau đó lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 15 ngày.

- Lấy mẫu vào thời điểm 5, 10, 15 ngày nuôi để xác định hàm lượng lân hòa tan bằng máy so màu theo phương pháp Oniani tiến hành theo các bước sau:

Vi khuẩn ↓

Nuôi trên môi trƣờng Aleksandrov lỏng ↓

Ly tâm nhẹ lấy phần dịch trong ↓

Trộn với thuốc thử ↓

Đo OD ở bƣớc sóng 880nm

Hình 5. Sơ đồ các bƣớc xử lí mẫu để xác định hàm lƣợng lân hòa tan

- Mẫu: chuẩn bị ống nghiệm (loại 20ml) cho mỗi mẫu, sau khi ly tâm mẫu cho vào mỗi ống nghiệm theo các bước sau:

 Cho 5ml nước khử khoáng vào ống nghiệm.

 Rút 0,5ml dung dịch mẫu đã được ly tâm.

 Thêm 4ml dung dịch B.

 Cuối cùng cho thêm 3ml nước khử khoáng.

- Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm trên máy vortex và để ở nhiệt độ phịng khoảng 20 phút, sau đó tiến hành đo hàm lượng lân hịa tan có trong mẫu dựa trên phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880nm (OD880nm).

- Kết quả đo OD của các dòng vi khuẩn sẽ dựa vào phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng lân hịa tan (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần).

b. Thử khả năng hòa tan Kali

Để đánh giá khả năng hịa tan kali khó tan của những dịng vi khuẩn, tiến hành thí nghiệm như sau:

- Sau đó lấy mẫu tiến hành xác định hàm lượng kali hòa tan theo các bước sau:

Vi khuẩn ↓

Nuôi trên môi trƣờng Aleksandrov lỏng ↓

Lọc qua giấy lọc ↓

Pha loãng 20 lần ↓

Đo hàm lƣợng K hịa tan bằng AAS ở bƣớc sóng 766,5nm

(Đo mẫu ở PNT chuyên sâu- Trường Đại Học Cần Thơ)

CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I. Kết quả phân lập vi khuẩn hịa tan lân và kali khó tan

1. Kết quả phân lập

Phân lập được 14 dòng vi khuẩn từ 13 mẫu đất ở núi Dài 5 giếng – An Giang các dòng vi khuẩn này đều phát triển tốt trên môi trường Aleksandrov đặc và môi trường NBRIP đặc định tính lân (Hình 7A và Hình 7B). Các dịng vi khuẩn này đều có khả năng hịa tan lân và kali từ dạng khó tan thành dạng dễ hấp thu.

Hình 7A và 7B. Vi khuẩn phát triển trên môi trƣờng NBRIP

6 B

2 A

Các mẫu đất đều thu được ở núi Dài Năm Giếng - An Giang. Chúng tôi tạm đặt tên dựa trên số mẫu đất. Xuất xứ của các dịng vi khuẩn này được trình bày trong Bảng 6.

Bảng 6. Xuất xứ của các dòng vi khuẩn hòa tan lân và kali đã phân lập STT Dòng vi khuẩn Vị trí lấy mẫu Địa điểm thu mẫu STT Dòng vi khuẩn Vị trí lấy mẫu Địa điểm thu mẫu

01 1 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 02 2 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 03 3 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 04 4A Đất chưa mọc cây Núi Dài 5 Giếng-AG

05 4B Đất chưa mọc cây Núi Dài 5 Giếng-AG

06 5 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 07 6 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 08 7 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 09 8 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 10 9 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 11 10 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 12 11 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 13 12 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG 14 13 Đất vùng rễ cây Núi Dài 5 Giếng-AG

2. Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập

a. Đặc điểm khuẩn lạc của các dịng vi khuẩn phân lập (Hình 8)

Khi quan sát các khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn sau 3 ngày nuôi trên môi trường phân lập thu được kết quả như sau: Các khuẩn lạc có dạng trịn đều và khơng đều; bìa ngun và gợn sóng; màu trắng đục, trắng sữa, trắng trong; độ nổi và phẳng cụ thể:

o Hình dạng khuẩn lạc: khuẩn lạc có dạng trịn đều là 8/14 dịng, chiếm tỉ lệ 57,14%; 6/14 dịng vi khuẩn có dạng khơng đều, chiếm tỉ lệ 42,86%.

o Dạng bìa khuẩn lạc: vi khuẩn có dạng khuẩn lạc bìa ngun là 8/14 dịng, chiếm tỉ lệ 57,14%, 6/14 dịng khuẩn lạc có dạng bìa gợn sóng, chiếm tỉ lệ 42,86%.

o Độ nổi khuẩn lạc: 9/14 dịng vi khuẩn có độ nổi mơ, chiếm tỉ lệ 64,29%; 5/14 dịng vi khuẩn có khuẩn lạc phẳng, chiếm tỉ lệ 35,71%.

o Màu sắc khuẩn lạc: 9/14 dịng vi khuẩn có lạc trắng trong, chiếm tỉ lệ 64,29%; 1/14 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc trắng sữa, chiếm tỉ lệ 7,14%; 4/14 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc trắng đục, chiếm tỉ lệ 28,57%.

b. Hình thái tế bào vi khuẩn

Sau khi quan sát hình thái tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi phóng đại 1000 lần ta thấy: Hình dạng tế bào vi khuẩn phân lập được có 2 dạng chủ yếu: có 11/14 dịng có dạng hình que ngắn, chiếm tỉ lệ 78,57% và 3/14 dòng que dài, chiếm tỉ lệ 21,43%.

Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng chuyển động, chiếm tỉ lệ 100%. Kết quả nhuộm Gram cho thấy 14 dòng vi khuẩn phân lập được đều là vi khuẩn Gram âm chiếm tỉ lệ 100%. (Hình 9)

Bảng 7. Một số đặc điểm khuẩn lạc và vi khuẩn hòa tan lân và kali khó tan

STT TÊN

DỊNG

Đặc điểm tế bào Đặc điểm vi khuẩn

Hình Chuyển Hình Màu Dạng Độ Kích Dạng động Gram dạng sắc bìa nổi thƣớc 01 1 Que ngắn + - Tròn Trắng đục Nguyên Mô 2,0

02 2 Que ngắn + - Tròn Trắng đục Nguyên Mô 2,0

03 3 Que ngắn + - Trịn Trắng Trong Ngun Mơ 2,0

04 4A Que ngắn + - Không đều Trắng Trong Gợn sóng

Phẳng 2,0

05 4B Que ngắn + - Không đều Trắng đục Gợn sóng

Phẳng 2,0

06 5 Que ngắn + - Không đều Trắng Trong Gợn sóng

Mơ 2,0

07 6 Que ngắn + - Trịn Trắng Trong Ngun Mơ 3,0

08 7 Que ngắn + - Tròn Trắng Trong Nguyên Phẳng 2,0

09 8 Que ngắn + - Không đều Trắng đục Gợn sóng

Mơ 3,0

10 9 Que dài + - Tròn Trắng Trong Nguyên Mô 3,0

11 10 Que dài + - Không đều Trắng Trong Gợn sóng

Mơ 3,0

12 11 Que ngắn + - Tròn Trắng Trong Nguyên Mô 2,0

13 12 Que ngắn + - Không đều Trắng sữa Gợn sóng

Phẳng 3,0

14 13 Que dài + - Tròn Trắng Trong Nguyên Mô 2,0

Ghi Chú: +: có di dộng

Kết quả các dòng vi khuẩn phân lập được phù hợp với một số nghiên cứu trước về vi khuẩn hòa tan kali và lân: vi khuẩn hình que, Gram âm, khả năng chuyển động và hình dạng khuẩn lạc (Avakyan et al., 1986; Weber et al., 1999; Cruz et al., 2001; Rosenblueth và Martinez-Romero, 2006; Nguyễn Thị Thu Hà, 2008; Xiufang Hu et al., 2006, Phan Thị Nhã, 2009).

38 Dòng 5 Dòng 12 Dịng 13 Dịng 2 Dịng AG6

Hình 8. Hình dạng khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn Aleksandrov

Hình 9B. Hình dạng vi khuẩn hịa tan lân và kali với độ phóng đại 400

Dịng 9 A

Dòng 9 B

3. Kết quả kiểm tra khả năng hịa tan lân và kali khó tan

a. Kết quả đo khả năng hòa tan lân

Lượng lân hòa tan được vi khuẩn chuyển từ dạng khó tan trong mơi trường Alaksandrov lỏng phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu xanh dương, lượng lân được vi khuẩn hịa tan càng nhiều thì màu xanh của dung dịch phản ứng càng đậm. (Hình 10A và Hình 10B). OD 8 8 0 n m P2O5 chuẩn (mg/l) Hình 11. Đồ thị phƣơng trình đƣờng chuẩn B Hình 10B. Phản ứng màu của lƣợng lân hịa tan với

thuốc thử Oniani 3 4 5 2 1 0 A

Hình 10A. Phản ứng màu của P2O5

chuẩn với thuốc thử Oniani ở ngày đo thứ 5

Bảng 8. Khả năng hòa tan lân (mg/l) của các dòng vi khuẩn theo thời gian

Dòng 5 ngày 10 ngày 15 ngày

1 62,29 92,08 116,33 2 39,38 151,57 201,35 3 69,37 69,80 75,34 4A 35,47 51,87 33,92 4B 74,47 174,50 214,19 5 42,52 80,18 51,62 6 116,92 249,32 118,94 7 51,49 32,91e 9,50 8 76,95 168,06 91,76 9 56,92 32,28 32,48 10 73,23 88,68 68,95 11 62,65 57,79 29,08 12 65,89 173,52 168,72 13 132,84 108,48 70,53 ĐC 0,62 5,61 0,3

Ghi chú: Các giá trị trung bình của các dịng vi khuẩn ở các ngày đo Trong bảng số liệu giá trị so sánh chỉ đúng cho từng ngày riêng biệt.

Hình 12. Hàm lƣợng lân hịa tan của các dịng vi khuẩn ở ngày đo thứ 5 N ồn g độ P (mg/ l) Dòng vi khuẩn

Sau 5 ngày lượng lân hòa tan của các dịng vi khuẩn khác biệt có nghĩa so với đối chứng (0,62mg/l). Có 2/14 dịng vi khuẩn (14,28%) (dòng 6 và 13) cho kết quả hòa tan lân cao hơn 100mg/l, với dịng 13 có hàm lượng lân cao nhất là 132,84mg/l; có 9/14 dòng vi khuẩn (64,29%) (dòng 1, 3, 4B, 7, 8, 9, 10, 11 và 12) cho kết quả hòa tan lân cao hơn 50mg/l; còn lại 3/14 dòng vi khuẩn (21,43%) (dịng 2, 4A và 5) có hàm lượng lân hòa tan dưới 50mg/l.

Theo kết quả nghiên cứu của Islam và Hoque (1983) ở ngày thứ 3 trên các dịng vi khuẩn phân lập có hàm lượng lân hòa tan từ 10mg/l đến dưới 30mg/l.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Nhung (2010) trên 24 dòng vi khuẩn phân lập trên núi đá vơi ở ngày đo thứ 5, thì các dịng vi khuẩn có lượng lân hịa tan thấp hơn 20mg/l. Kết phân lập ở núi Dài 5 giếng có hàm lượng lân cao hơn.

Ở ngày đo thứ 10, hàm lượng lân hòa tan của các dòng vi khuẩn đều khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Có 5 dịng vi khuẩn (35,71%) với hàm lượng lân hòa tan cao trên 150mg/l, cao nhất là dòng 6 với 249,32mg/l các dòng vi khuẩn này khác biệt có ý nghĩa so với các dịng khác; có 1/14 dịng vi khuẩn (7,14%) (dịng 13) có lượng lân hịa tan lớn hơn 100mg/l; có 6/14 dịng vi khuẩn (42,86%) (1, 3, 4A, 5, 10 và 11) có hàm lượng hịa tan cao hơn 50mg/l; còn lại 2 dòng (7 và 9) có hàm lượng thấp hơn 50mg/l, chiếm tỉ lệ 14,29%.

Hình 13. Hàm lƣợng lân hịa tan của các dòng vi khuẩn ở ngày đo thứ 10 Dòng vi khuẩn N ồn g độ P (mg/ l)

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Nhung (2010) trên 24 dòng vi khuẩn phân lập ở núi đá vơi trong ngày đo thứ 10, thì lượng lân hịa tan cao nhất là 21,52mg/l và 20,88mg/l thì các dịng vi khuẩn chúng tơi phân lập được có lượng lân hòa tan cao hơn.

Theo kết quả của Nguyễn Thị Ngọc Trúc (2006) trên 20 dòng vi khuẩn phân lập trong ngày ủ thứ 2 thì lượng lân hịa tan cao hơn 200mg/l, thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với tác giả.

Ở ngày đo thứ 15, lượng lân hòa tan của các dòng vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Trong đó, có 5/14 dịng vi khuẩn (35,71%) (dịng1, 2, 4B, 6 và 12) có hàm lượng lân cao hơn 100mg/l cao nhất là dòng 2 là 201,35mg/l và dòng 4B là 214,19 mg/l, cả 5 dịng vi khuẩn này khác biệt có ý nghĩa so với các dòng cong lại. Các dòng 3, 5, 8, 10 và 13 có lượng lân hòa tan lớn hơn 50mg/l, chiếm tỉ lệ 35,71%; còn lại 4 dịng (4A, 7, 9 và 11) có hàm lượng thấp hơn 50mg/l, chiếm tỉ lệ 28,58%.

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Trúc (2006) trên 20 dòng vi khuẩn phân lập được có hàm lượng lân hịa tan cao hơn 200mg/l trong ngày ủ thứ 3, thì kết quả hịa tan lân của 14 dòng vi khuẩn này đều thấp hơn.

Sau 15 ngày đo, hàm lượng lân hòa tan trong dịch nuôi vi khuẩn cao hơn ngày thứ 10 và 15 do vi khuẩn tăng sinh khối đồng thời hòa tan lân được nhiều hơn. Bên cạnh đó, có một số mẫu có lượng lân hịa tan ở ngày thứ 5 và ngày 10 cao (dòng 4A, 5, 6, 8, 10, 12) sau đó thì giảm ở ngày 15; một số mẫu có lượng

Hình 14. Hàm lƣợng lân hòa tan của các dòng vi khuẩn ở ngày đo thứ 15

N ồn g độ P (mg/ l) Dòng vi khuẩn

lân hòa tan ở ngày thứ 5 cao (7, 9, 11, 13) sau đó thì giảm xuống ở ngày thứ 10 và 15, có thể do vi khuẩn phát triển mạnh ở những ngày đầu, nên lượng lân hịa tan nhiều nhưng sau đó thì phát triển yếu (vì mơi trường cạn kiệt dinh dưỡng hay do ngộ độc) nên hoạt động kém và lượng lân tạo ra ít hơn.

Kết quả đo hàm lượng lân hòa tan ở 5, 10 và 15 ngày: dịng 6 có lượng lân hòa tan cao nhất ở ngày 10 nên dịng này thể hiện hoạt tính cao ở 10 ngày đo và có hàm lượng lân cao nhất trong các dịng vi khuẩn nên dịng này có khả năng được ứng dụng hiệu quả ở ngày 10. Còn các dịng 2 và 4B có lượng lân hịa tan cao nhất ở ngày thứ 15 với hàm lượng lân lớn hơn 200mg/l và khơng có khác biệt với ngày 10 chỉ khác biệt có ý nghĩa so với ngày 5, như vậy 2 dịng này thể hiện hoạt tính tốt ở từ ngày 10 nên 2 dịng này có khả năng ứng dụng hiệu quả ở 10 ngày đo. Dịng 8 và 12 có hàm lượng lân hịa tan cao ở 10 ngày đo với hàm lượng lân cao hơn 100mg/l và khác biệt khơng có ý nghĩa so với ngày 5 và 15. Dịng 13 có hàm lượng lân hịa tan cao ở ngày đo thứ 5 và không khác biệt với ngày 10 nhưng khác biệt với ngày 15, như vậy dịng này thể hiện hoạt tính sớm nên dịng này có khả năng ứng dụng thực tế. Dịng 1 có hàm lượng lân hịa tan cao vào ngày đo thứ 15 với hàm lượng lân hòa tan cao hơn 100mg/l và khơng khác biệt có ý nghĩa so với ngày 10 nhưng khác biệt có ý nghĩa với ngày 5. Cón lại dịng 3, 4A, 5, 7, 9, 10 và 11 có hàm lượng lân thấp hơn 100mg/l và khác biệt có ý nghĩa với các dịng khác nên các dòng này hiệu quả ứng dụng khơng cao.

Hình 15. Biểu đồ nồng độ lân hịa tan của các dòng vi khuẩn ở ngày 5, ngày 10 và ngày 15

N ồn g độ P ( m g /l ) Dòng vi khuẩn

Qua hình 16: dịng 6 có hàm lượng lân hịa tan cao nhất trong các dòng, cho hàm lượng lân tăng từ ngày 5 đến ngày 10, sau đó thì giảm xuống ở ngày 15, nhưn vậy dòng này cho hiệu quả ở ngày 10. Dịng số 13 có hàm lượng lân hịa tan cao ở ngày thứ 5, sau đó thì giảm xuống ở ngày 10 và 15, như vậy dịng 13 thể hiện hoạt tính sớm với mơi trường, có thể ứng dụng thực thế. Dịng 2 và dịng 4B có lượng lân hịa tan cao hơn 200mg/l, hàm lượng lân tăng từ ngày 5 đến ngày 10 và 15 nên 2 dòng này ứng dụng hiệu quả ở 15 ngày

Qua kết quả đo ở 3 ngày (5, 10, 15): chúng tôi thấy có 7 dịng (1, 2, 4B, 6, 8, 12 và 13) cho kết quả lân cao hơn 100mg/l: Dòng 1 với 116,33mg/l ở ngày thứ 15; dòng 2 với 201,35mg/l ở ngày thứ 15; dòng 4B với 214,19mg/l ở ngày thứ 15; dòng 6 với 249,32mg/l ở ngày thứ 10; dòng 8 với 168,06mg/l; dòng 12 với 173,52mg/l ở trong ngày thứ 10 và dòng 13 với 132,84mg/l ở ngày thứ 5.

b. Kết quả đo khả năng hòa tan kali

Kết quả đo khả năng kali của các dòng vi khuẩn tương đối thấp, được thể hiện ở Bảng 9.