3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: Từ 11/2010 – 4/2011
- Địa điểm: Phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Bộ môn Sinh học, Khoa
Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ
3.1.2.1 Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng (Laminar low, Việt Nam) - Nồi khử trùng nhiệt ướt Hirayama (Nhật) - Tủ sấy (Memmer, Đức)
- Tủ ủ (Memmer, Đức)
- Cân phân tích (Mettle Toler, Switzerland) - Kính hiển vi (Olympus, Japan)
- Tủ lạnh (Sanyo) - Máy chụp ảnh
- Hệ thống tách chiết Soxhlet (Trung quốc)
- Bộ dụng cụ cô quay (EYELA Oil Bath OSB – 2000, Japan) - Buồng đếm hồng cầu (NEUBAWER IMPROVED – Hirshmann) - Micropipette 3.1.2.2 Dụng cụ - Đĩa Petri - Que cấy - Đèn cồn - Ống đong (25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml)
- Chai nhựa nắp xanh (500 ml, 1000 ml) - Bình tam giác (50 ml, 250 ml) - Cốc thủy tinh (50 ml, 100 ml, 500 ml) - Ống nghiệm - Ống hút - Lame và Lamelle - Bình cầu cổ nhám thể tích (100 ml, 500 ml) - Giấy lọc - Các dụng cần thiết khác 3.1.3 Hóa chất - Nước cất
- Hexane (Trung Quốc) - Ethanol ( Việt Nam) - Môi trường Czapek: + Sucrose 30,0 g + NaNO3 3,0 g + K2HPO4 1,0 g + MgSO4 0,5 g + FeSO4 0,1 g + Agar 20,0 g + Nước cất 1000 ml 3.1.4 Vật liệu thí nghiệm
- Bã cà phê thu gom ở các quán giải khát tại TP. Cần Thơ. - Dầu nhớt cặn mua tại cơ sở sửa chữa xe máy.
- Chủng nấm mốc Aspergillus niger được cung cấp từ phịng thí nghiệm Sinh
hóa, bộ môn Khoa học Sinh học và Công nghệ Sinh học, khoa Nông Nghiệp, trường đại học Kyushu, Nhật Bản.
- Chủng N4 do học viên cao học Phan Thị Ngọc Thi, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ phân lập từ bã đậu nành trên địa bàn Thành phố Cần
Thơ. Chủng này chưa được định danh.
- Hai nguồn giống được lưu giữ trong ống nghiệm chứa môi trường Czapek dạng thạch nghiêng.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Chuẩn bị giống và chủng vào môi trường ni cấy
Mục đích: Chuẩn bị nguồn giống và xác định mật số bào tử nấm mốc chủng vào các nghiệm thức đã bố trí trong thí nghiệm.
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường Czapek trong các đĩa petri, khử trùng nhiệt
ướt ở 1210C, 1 atm, trong 20 phút. Cấy chủng Aspergillus niger và chủng N4 vào các đĩa petri. Ni mốc ở nhiệt độ phịng trong 5 ngày. Cho nước cất vô trùng
vào đĩa petri, dùng mặt dưới của muỗng nhựa chà nhẹ lên đĩa cho bào tử bung ra,
được dịch trích bào tử, tiến hành pha loãng và đếm mật số bào tử trong dịch trích
sao cho trong 1ml dịch trích này có chứa khoảng 106 bào tử nấm mốc. Hút 1 ml dịch trích cho vào các bình tam giác đã bố trí trong thí nghiệm.
3.2.2 Cấy điểm và cấy lame
Mục đích: Quan sát cấu trúc đại thể và vi thể của Aspergillus niger và N4.
Sau đó phân loại N4 đến mức độ giống. Tiến hành:
- Cấy điểm: Chuẩn bị môi trường Czapek trong đĩa petri, khử trùng nhiệt ướt ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. Dùng que cấy đầu tròn cấy một điểm lên đĩa
petri để tạo khuẩn lạc nấm mốc, sau 5 ngày quan sát cấu trúc đại thể của chúng
- Cấy lame: Chuẩn bị môi trường Czapek trong một đĩa petri sao cho đĩa
môi trường này thật mỏng, khử trùng nhiệt ướt ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. Dùng kim mũi giáo cắt đĩa môi trường thành các miếng hình chữ nhật có kích
thước 5x10 mm. Để một miếng môi trường đã cắt lên lame, dùng que cấy cấy
theo các mép ngồi của hình chữ nhật, đậy lamelle lại. Sau 1-3 ngày, quan sát cấu trúc vi thể của chúng dưới kính hiển vi điện tử.
3.2.3 Thí nghiệm định lượng khả năng phân hủy dầu nhớt cặn của hai chủng nấm Aspergillus niger và N4 trên giá thể là bã cà phê
Mục đích: xác định khả năng phân hủy dầu nhớt của chủng nấm mốc A.
niger và chủng nấm mốc N4. Qua đó, so sánh khả năng phân hủy giữa hai chủng
nấm mốc này.
Tiến hành: thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, một nhân tố, 3
nghiệm thức và 3 lần lặp lại, trong đó mỗi lần lặp lại là 1 đơn vị thí nghiệm
chủng tách riêng trong các bình tam giác, gồm có 40 g bã cà phê đã tách dầu, 45 g nước cất vô trùng, 4 g dầu nhớt cặn đã lọc. Trong 3 nghiệm thức thí nghiệm,
ngồi nghiệm thức đối chứng không chủng nấm mốc thì 2 nghiệm thức cịn lại đều chủng vào 1 ml dịch trích bào tử của chủng nấm Aspergillus niger và chủng
N4 đã chuẩn bị ở thí nghiệm 3.2.1. Các nghiệm thức sẽ được kiểm tra vào các
ngày 0 (bắt đầu thí nghiệm), ngày thứ 5, ngày thứ 10, ngày thứ 15 và ngày thứ 20 của thí nghiệm.
Qui trình tiến hành định lượng khả năng phân hủy dầu nhớt cặn của hai
chủng nấm mốc Aspergillus niger và N4.
Bã cà phê sấy khô
Tách dầu bằng hệ thống chiết Soxhlet với dung môi n – Hexane
Khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút và sấy khô Môi trường Czapek trong
đĩa petri
Nuôi nấm mốc ở nhiệt
độ phòng trong 5 ngày
Nguồn giống trong đĩa petri
Cân 40 g vào bình tam giác và khử trùng lần 2 Nước cất vô trùng Chủng nấm mốc A.niger hoặc nấm mốc N4 Dịch trích bào tử
Cho nước cất vô trùng vào tạo ẩm độ 52,94% + 4 g dầu nhớt cặn đã qua lọc
Nuôi trong (5, 10, 15 và 20 ngày)
ở nhiệt độ phòng
Cô cạn dịch chiết và thu hồi dung môi n – Hexane bằng hệ thống
máy cô quay
Tách dầu bằng hệ thống chiết Soxhlet với dung môi n – Hexane
Cân lượng dầu nhớt cịn lại trong bình chứa
Hình 3.1 Quy trình định lượng khả năng phân hủy dầu nhớt cặn của hai chủng nấm mốc A. niger và N4