Cấu trúc phân tử do sự kết hợp giữa tinh bột (amylose và amylopectin) và I3− (starch–Iodine complex):
Tinh bột (amylose và amylopectin) có khả năng tạo vòng xoắn I3− làm cho dung dịch có màu xanh đen (blue-black). Phân tử mới được hình thành này có khả năng hấp thu ánh sáng có bước sóng 660 nm rất cao.
2.5 Dây khổ qua
Cây khổ qua (mướp đắng) có tên khoa học là Momordica charantina (Linn.). Khổ qua là cây nhất niên, thân leo nhờ vịi đoan, thân có 5 cạnh, trên thân có lơng trắng mịn. Cuống lá khổ qua dẹp, có lơng, phiến lá có gân dạng chân vịt, có lơng thưa. Khổ qua là cây đồng chu, hoa cô độc có cọng dài, có lá hoa hình tim, lá đài 5, xanh dợt, cao 5-7 mm. Hoa 5 cánh màu vàng, tiểu nhụy 3, bao phấn vàng đậm hình chữ S, nỗn sào có lơng mịn. Trái khổ qua thuộc dạng phì quả vàng đậm, hột trong nạc đỏ, quả bì rất đắng, chống đái tháo đường (Phạm Hoàng Hộ, 2003). Quả hình thoi dài, gốc và đầu thuôn nhọn, mặt ngồi có nhiều u lồi khơng bằng nhau, khi chín màu vàng hồng, hạt dẹp có màng đỏ bao quanh. Quả khổ qua được dùng làm thuốc mát, chữa ho, sốt, đái nhắt, đái buốt, bệnh phù thũng, do gan nhiệt, chữa đái tháo đường không phụ thuộc insulin, chốc đầu trẻ em, chữa thấp khớp… (Đỗ Huy Bích
et al., 2004).
Theo Đỗ Huy Bích et al. (2004), quả khổ qua chứa các chất như sau các glucosid triterpennic như charantin và hỗn hợp các chất thuộc nhóm stigmastadtenol, các glucosylsterol, pyrimidin arabinosit charin và vicim. Bên cạnh đó quả khổ qua còn chứa các chất như các chất hạ đường huyết (kakara), các axit amin và các lipid gồm lipid không phân cực, glucolipid, phospholipid. Trong trái khổ qua còn chứa các sắc tố và vitamin chủ yếu là vitamin B1, B2, P.P, E, β carotene. Ngồi ra cịn có cyrpoto xanthin và zeaxanthin, các chất khoáng Ca, Mg, Cu, Fe, Zn.
* Hạt khổ qua chứa các chất như bao gồm các glucosid, β - D- glucosid của β sitosterol, các terpenglucosid, các momorcharasid, các hợp chất lectin: protein như globulin, lectin. Ngoài ra, hạt khổ qua còn chứa các chất béo như acid oleostearic; acid stearic
* Lá và thân khổ qua chứa các chất như momordicin, sterol, chitinase. Công dụng của trái khổ qua cũng đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới với nhiều phương pháp tách chiết khác nhau và cho các kết quả rất khả quan về tiềm năng chữa bệnh tiểu đường (Welihinda, 1986).
Chuyên ngành Sinh Học 22 Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Cao chiết nước và cao chiết ethanol khổ qua có tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây tiểu đường bởi alloxan, kết quả hạ đường huyết này giống như việc điều trị chuột tiểu đường bằng gliclazide (Kameswara Rao et al., 2001). Theo Ahmed et al. (1998), nước ép trái khổ qua ảnh hưởng đến sự phân
bố của một số tế bào anpha (α), beta (β) và delta (γ) của tuyến tụy ở chuột bị bệnh tiểu đường bởi streptozotocin. Kết quả làm tăng số lượng tế bào beta, kết quả này cho thấy uống nước ép trái khổ qua có thể có vai trị tạo mới các tế bào beta hoặc phục hồi các tế bào beta bị phá hủy. Quả và lá mướp đắng có vị đắng, tính lạnh. Hạt đắng hơi ngọt, tính ấm, có tác dụng thanh nhiệt, nhuận tràng, bổ thận, giải phiền khát và lợi tiểu.
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
- Thời gian: từ tháng 11/2010 đến 5/2011.
- Địa điểm thu mẫu thí nghiệm: Rẫy rau màu ở ấp 6 xã Hậu Lộc, huyện Tam Bình, Thành phố Vĩnh Long.
- Địa điểm thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Sinh Học, Phịng thí nghiệm Hóa Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên và Phịng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và thiết bị
- Tủ lạnh trữ mẫu Hitachi (Nhật)
- Máy đo quang phổ Beckman Coulter DU 640B (Đức) - Tủ sấy Memmer (Đức)
- Máy cô quay chân không EYELA (Nhật) - Máy ổn nhiệt
- Micropipette 50, 100, 200, 1000 µl (Gibson, Đức) - Máy khuấy từ SM1 (UK)
- pH kế Thermo Orion (Belgium)
- Cân phân tích Mettler Toler (Switzerland) - Máy tesch
- Ống nghiệm, ống đong, eppendorf, đầu col, găng tay, giấy lọc, phiểu thủy tinh, đũa thủy tinh, giấy bạc, becher, giá đựng ống nghiệm, giá đựng eppendorf, pipet…và một số thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm khác
3.2.2 Hóa chất
Các hóa chất pha mơi trường đệm gồm KH2PO4, K2HPO4, nước cất. Các hóa chất pha dung dịch iod như KI, I2 dạng tinh thể, nước cất. Các hóa chất pha hồ tinh bột là tinh bột tinh thể, dung dịch đệm. Hóa chất dùng để ngâm mẫu: Etanol 99,6%.
Chuyên ngành Sinh Học 24 Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Tinh thể enzyme γ-amylase trích từ giống nấm sợi Aspergillus.
Hóa chất dùng để pha thuốc DMSO, thuốc glucobay (acarbose, 50 mg) (sản xuất bởi Bayer HealthCare AG, D-51368 Leverkusen, CHLB Đức).
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thu mẫu khổ qua
Mẫu dây khổ qua được thu lấy khi dây khổ qua đã được thu hoạch trái hoàn toàn. Rễ và thân của dây khổ qua được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế sự thủy phân tinh bột của enzyme γ-amylase. Mẫu sau khi thu được định danh dựa vào các đặc điểm hình thái của thực vật như thân, lá, hoa, trái,…và tham khảo tài liệu từ bộ sách Cây Cỏ Việt Nam của giáo sư Phạm Hoàng Hộ (2003). Mẫu sau khi thu về được rửa sạch, 2 kg mẫu được phơi khô dưới ánh nắng mặt trời cho tới khi trọng lượng không thay đổi. Mẫu sau khi phơi khô đem cân trọng lượng được 300 g. Cho mẫu vào túi nylon sạch, ghi nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phịng.
Hình 3.1: Mẫu thân và rễ khổ qua trước và sau khi phơi khô
Độ ẩm của ngun liệu được tính tốn theo cơng thức:
Trọng lượng tươi
Trọng lượng tươi – trọng lượng khô
3.3.2 Tách chiết các chất từ trong rễ và thân khổ qua
Mẫu rễ và thân khổ qua sau khi đã được xử lí và bảo quản được nghiền nhỏ và cho vào các túi vải trắng cột chặt túi vải sau đó cho vào keo thủy tinh có thể tích 10 lít. Cho ethanol 99,6% vào keo thủy tinh sao cho vừa ngập mẫu. 300 g mẫu khổ qua thì ngâm tương ứng với 2 lít ethanol 99,6%.
Hình 3.2: Mẫu thân và rễ khổ qua được nghiền, cắt nhỏ
Hình 3.3: Mẫu khổ qua được ngâm trong Etanol 99,6 %
Sau 48 giờ ở nhiệt độ phịng, dung dịch chiết được cơ quay để thu hồi dung môi ethanol dưới áp suất thấp (200-300 mmHg). Sau khi cơ quay, các chất hịa tan trong dung môi ethanol được thu gọi là cao ethanol, mẫu cao chiết
Chuyên ngành Sinh Học 26 Khoa Khoa Học Tự Nhiên
3.3.3 Phản ứng khảo sát bước sóng tối ưu cho phản ứng thủy phân tinh bột
Tinh bột được pha trong 0,25 M dung dịch đệm phosphate pH 7 ở các nồng độ 5 mg/ml và 2,5 mg/ml.
Hỗn hợp phản ứng gồm 450 µl dung dịch tinh bột ở các nồng độ khác nhau (như trình bày ở trên) và 550 µ l của 5 mM dung dịch iod. Sự kết hợp giữa các phân tử amylose trong tinh bột và iod được phát hiện lần lượt ở các bước sóng 380, 480, 580, 600, 660, 680 và 780 nm.
3.3.4 Phản ứng khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột và pH lên hoạt
động của enzyme γ-amylase
Tinh bột được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M ở các giá trị pH lần lượt là pH 3, 4, 5, 6, 7, 8. Tinh bột được sử dụng ở các nồng độ lần lượt là 1,25 mg/ml, 2,5 mg/ml, 5 mg/ml và 10 mg/ml.
Phản ứng được thực hiện như sau: 450 µl tinh bột được ủ với 100 µl enzyme (nồng độ enzyme 2 mg/ml) ở 37°C trong thời gian 7 phút. Sau khi phản ứng thủy phân xảy ra 100 µ l của 10% HCl được sử dụng để dừng phản ứng. Lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng được phát hiện bằng 550 µl của 5 mM iod ở bước sóng 660 nm. Hiệu suất phản ứng được tính tốn dựa trên lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng.
% tinh bột bị thủy phân = 100% × (ATBX − ASPXY) / ATBX
ATBX: mật độ quang 660 nm đo được của hợp chất tinh bột-iod khi khơng có enzyme γ-amylase ở nồng độ tinh bột X tương ứng. ASPXY: mật độ quang 660 nm đo được của hợp chất tinh bột-iod khi có enzyme γ-amylase ở nồng độ tinh bột X tương ứng và tại các giá trị pH Y được bố trí trong thí nghiệm.
3.3.5 Phản ứng khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian ủ enzyme lên phản ứng lên phản ứng
Tinh bột, enzyme γ-amylase được pha trong 0,25 M dung dịch đệm phosphate pH 5 tinh bột ở nồng độ 5 mg/ml, enzyme ở nồng độ giảm dần từ 3 mg/ml đến 0,5 mg/ml.
Phản ứng được thực hiện như sau: 450 µl tinh bột (nồng độ cố định 5mg/ ml) được ủ với 100 µ l enzyme (nồng độ enzyme 3 mg/ml giảm dần đến 0,5 mg/ml) ở 37°C trong thời gian 4, 5, 6, 7, 8, 9 phút. Sau khi phản ứng thủy phân xảy ra 100 µl của 10% HCl được sử dụng để dừng phản ứng. Lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng được phát hiện bằng 550 µl của 5 mM iod ở bước sóng 660 nm. Hiệu suất phản ứng được tính tốn dựa trên lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng.
% tinh bột bị thủy phân = 100% × (ATB − ASPXZ) / ATB
ATB: mật độ quang 660 nm đo được của hợp chất tinh bột-iod khi khơng có enzyme γ-amylase.
ASPXZ: mật độ quang 660 nm đo được của hợp chất tinh bột-iod khi có enzyme γ-amylase tại các nồng độ enzyme γ-amylase X tương ứng và tại các mốc thời gian Z tương ứng được bố trí trong thí nghiệm.
3.3.6 Phản ứng khảo sát sự ức chế của thuốc glucobay lên sự thủy phân tinh bột của enzyme γ-amylase bột của enzyme γ-amylase
Thuốc glucobay có hoạt chất là acarbose được biết là ức chế enzyme thủy phân tinh bột, và được dùng như các đối chứng dương trong các thí nghiệm khảo sát sự ức chế của các enzyme thủy phân tinh bột (Đỗ Trung Quân, 2001). Sự ức chế hoạt động thủy phân tinh bột của glucobay đối với enzyme γ-amylase được khảo sát trong thí nghiệm của chúng tơi.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: tinh bột, enzyme γ-amylase được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M ở giá trị pH 5 với nồng độ tinh bột là 5 mg/ml, enzyme γ-amylase là 2 mg/ml.
Hỗn hợp phản ứng gồm 450 µ l tinh bột nồng độ 5 mg/ml được ủ với 100 µ l thuốc glucobay với các nồng độ tăng dần từ 4, 8, 16, 32, 64, 128 mg/ml.
Chuyên ngành Sinh Học 28 Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Sau đó 100 µl enzyme γ-amylase nồng độ 2 mg/ml được thêm vào hổn hợp phản ứng ủ ở 37°C trong thời gian 7 phút. Cuối cùng 100 µ l của 10% HCl được sử dụng để dừng phản ứng. Lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng được phát hiện bằng 550 µl của 5 mM iod ở bước sóng 660 nm. Mẫu đối chứng không enzyme được thực hiện trong điều kiện 100 µl thuốc glucobay được thay bằng 100 µl dung dịch đệm và 100 µl enzyme cũng được thay bằng 100 µ l đệm.
Tuy nhiên do thuốc glucobay được pha trong DMSO nên ảnh hưởng của DMSO lên sự thủy phân tinh bột của enzyme γ-amylase được đánh giá như sau 100 µl DMSO với các nồng độ được tính tốn tương ứng với nồng độ của DMSO có trong thuốc glucobay sau khi pha với các nồng độ được sử dụng trong thí nghiệm trình bày ở trên. Khảo sát này được đánh giá độc lập với thí nghiệm khảo sát sự ức chế của thuốc glucobay lên sự thủy phân tinh bột của enzyme γ-amylase.
3.3.7 Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme γ-amylase của cao chiết khổ qua khổ qua
Thí nghiệm được tiến hành như sau: tinh bột, enzyme γ-amylase được pha trong dung dịch đệm phosphate 0,25 M ở giá trị pH 5 với nồng độ tinh bột là 5 mg/ml, enzyme γ-amylase là 2 mg/ml.
Cao chiết khổ qua được pha trong DMSO tương tự như thuốc glucobay với các nồng độ tăng dần như sau 4, 8, 16, 32, 64, 128 mg/ml.
Hỗn hợp phản ứng gồm 450 µ l tinh bột nồng độ 5 mg/ml được ủ với 100 µ l với cao chiết khổ qua với các nồng độ tăng dần từ 4, 8, 16, 32, 64, 128 mg/ml. Sau đó 100 µl enzyme γ-amylase nồng độ 2 mg/ml được thêm vào hổn hợp phản ứng ủ ở 37°C trong thời gian 7 phút. Cuối cùng 100 µ l của 10% HCl được sử dụng để dừng phản ứng. Lượng tinh bột còn thừa sau phản ứng được phát hiện bằng 550 µl của 5 mM iod ở bước sóng 660 nm. Mẫu đối chứng không enzyme được thực hiện trong điều kiện 100 µl cao chiết khổ qua được thay bằng 100 µl dung dịch đệm và 100 µl enzyme cũng được thay bằng 100 µl dung dịch đệm.
Phần trăm enzyme γ-amylase bị ức chế trong phản ứng được tính tốn theo cơng thức sau:
% enzyme γ-amylase bị ức chế = (Amẫu/Ađối chứng) × 100%
Amẫu: mật độ quang ở bước sóng 660 nm của mẫu ở các nồng độ thuốc glucobay hoặc cao chiết khổ qua trong thí nghiệm
Ađối chứng: mật độ quang ở bước sóng 660 nm của mẫu đối chứng (không sử dụng thuốc glucobay hay cao chiết và cũng không sử dụng enzyme).
Hiệu suất phản ứng = [(Ađối chứng - Amẫu)/Ađối chứng] × 100%
3.3.8 Phân tích số liệu
Số liệu được phân tích trong phần mềm Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MINITAB 14.
Chuyên ngành Sinh Học 30 Khoa Khoa Học Tự Nhiên
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu
Độ ẩm trong rễ và thân khổ qua được tính như sau: 100% 2000 300 2000 × − = 85%
Kết quả cho thấy nước chiếm 85% trọng lượng của thân và rễ dây khổ
qua (Momordica charantia (Linn.).
4.2 Khảo sát bước sóng tối ưu cho phản ứng thủy phân tinh bột
Sự kết hợp giữa iod và tinh bột để khảo sát phản ứng thủy phân tinh bột bởi enzyme γ-amylase được đánh giá bằng cách 450 µl tinh bột tại các nồng độ 5 mg/ml và 2,5 mg/ml kết hợp với 550 µl iod 5 mM được phát hiện tại các bước sóng 380, 480, 580, 600, 660, 680, 780 nm.
Kết quả khảo sát bước sóng tối ưu cho phản ứng thủy phân tinh bột được tóm tắt và trình bày trong Bảng 4.1 và Hình 4.1.
Kết quả thí nghiệm cho thấy tại nồng độ tinh bột 5 mg/ml mật độ quang của hợp chất tinh bột-iod cao gần gấp đôi tại nồng độ 2,5 mg/ml ở tất cả các bước sóng (Bảng 4.1). Tại bước sóng 660 nm mật độ quang của hợp chất tinh bột-iod cao hơn so với tại 380, 480, 680, 780 nm (Bảng 4.1 và Hình 4.1), so với 600 và 580 nm thì mật độ quang tại 660 nm nhỏ hơn. Tuy nhiên, tại 600
Bảng 4.1: Mật độ quang của hợp chất tinh bột-iod tại các bước sóng, nồng độ tinh bột khác nhau
λ 380 480 580 600 660 680 780
TB
2,5 0,40 b 0,45 cb 0,71 c 0,65 cb 0,55 cb 0,52 cba 0,15 a
5 0,60 e 0,84 fe 1,42 f 1,34 fe 1,03 fe 0,87 fed 0,32 d
Ghi chú: các chữ số theo sau khác nhau trong cùng một cột, một hàng khác biệt có ý nghĩa thống kê 95%. Số liệu trong bảng là giá trị mật độ quang trung bình của ba lần lặp lại.
và 580 nm iod hấp thụ được ánh sáng còn tại bước sóng 660 nm thì iod khơng bị hấp thu (kết quả khơng trình bày ở đây), nên ta chọn bước sóng 660 nm làm bước sóng cố định cho phản ứng thủy phân tinh bột. Kết quả khảo sát này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Yu et al. (1996).
Hình 4.1: Mật độ quang của hợp chất tinh bột-iod tại các
bước sóng và nồng độ tinh bột khác nhau
4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột và pH lên hoạt động của enzyme γ-amylase