Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 17
Silica gel - tạo nối dùng cho pha thƣờng
Các nhà sản xuất cũng điều chế loại silica gel chế hóa nhƣng dùng cho pha thƣờng. Thực hiện phản ứng điều chế tƣơng tự nhƣ trên nhƣng nhóm chức cuối dây thƣờng là: phenyl, cyano, amino, diol,...
Hình 3.4 Cấu trúc và tên gọi một số loại silica gel – tạo nối dùng cho pha thƣờng Bảng 3.1 So sánh giữa silica gel pha thƣờng và silica gel chế hóa
Silicagel pha thƣờng Silicagel chế hóa
- Giá tƣơng đối rẻ
- Chỉ bền trong dung mơi kém phân cực và dung mơi có mức phân cực trung bình - Khả năng giữ các hợp chất phân cực ở lại trong cột rất mạnh, nhiều khi hợp chất dính ln trong cột, khơng thể giải ly ra khỏi cột
- Giá rất đắt
- Bền đối với tất cả các dung môi. Kể cả nƣớc - Có thể giải ly tất cả các hợp chất có tính phân cực mạnh ra khỏi cột Si OH Si Si Si Si O O O O Si Si Si Si Me Me Me Me Me Me Me Me (CH2)3 CH2 CH2 Si CH CH2 Si CH2CH2CH2 C N NH2 CH2 CH2 O CH2 CH OH CH2 OH
Silica gel phenyl
Alcenphenyl Cyanopropyl Aminopropyl Diol O Me Me
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 18
c) Một số loại pha tĩnh khác đƣợc sử dụng trong sắc ký cột hở
- Alumina: Alumina là oxyd aluminium Al2O3, đƣợc điều chế với quy trình
tƣơng tự nhƣ silica gel nhƣng trên nguyên liệu là hydroxyd aluminium, hơn thế nữa có thể điều chỉnh độ pH của dung dịch phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính bazơ hay trung tính. Nhiệt độ hoạt hóa trong quy trình điều chế là điểm khác nhau giữa alumina và silica gel. Muốn có alumina hoạt tính mạnh,
cần phải đun nóng alumina ở 400 ÷ 450oC trong 12 ÷ 16 giờ. Muốn làm giảm hoạt
tính của alumina thì thêm nƣớc vào.
- Gel: Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh đƣợc điều chế từ tinh bột,
agar (polysaccarid) hoặc polyacrylamid, trong đó các chuỗi dây dài đƣợc nối mạng ngang để tạo thành mạng không gian ba chiều. Nhiều nhà sản xuất đã đƣa ra các sản phẩm thƣơng mại với tên gọi khác nhau.
3.2.2.2. Pha động
Trong loại sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly ra khỏi cột trƣớc, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly ra sau. Do đó, dung môi giải ly cũng tăng dần về mức độ phân cực.
Trong quá trình giải ly cột, ta có thể sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi. Nhƣng trong hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn tất.
Bảng 3.2 Các dung môi thƣờng dùng trong sắc ký cột, đƣợc sắp xếp theo chỉ số phân cực tăng dần
Dung môi Chỉ số phân cực Nhiệt độ sôi (oC)
Hexane 0,0 69 Chloroform 4,1 61 Ethyl acetate 4,4 77 Acetone 5,1 56 Methanol 5,1 65 Ethanol 5,2 78 Water 9,0 100
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 19
3.2.3. Triển khai sắc ký cột
3.2.3.1. Chọn dung mơi bắt đầu cho q trình sắc ký cột
Trƣớc khi sắc ký cột, trƣớc hết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dị tìm hệ dung mơi cho phù hợp trong quá trình giải ly cột, các bƣớc lần lƣợt nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Mẫu cần đƣợc sắc ký phải hòa tan hồn tồn trong một dung mơi
và với nồng độ phù hợp.
- Bƣớc 2: Chuẩn bị 4 ÷ 6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm. Chấm mẫu lên những
tấm bản này.
- Bƣớc 3: Mỗi bản mỏng đƣợc giải ly với hệ dung mơi có độ phân cực khác
nhau. Tiếp theo hiện hình mẫu chất bằng thuốc hiện hình H2SO4 20% trong
methanol về khối lƣợng.
- Bƣớc 4:
+ Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của quá trình tổng hợp hữu cơ, hãy
chọn hệ dung mơi nào mà có thể đẩy đƣợc chất cần quan tâm lên vị trí có
Rf = 0,2 ÷ 0,3.
+ Với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ, chọn hệ dung mơi nào có thể đẩy đƣợc
vết ít phân cực nhất lên vị trí có Rf = 0,5.
3.2.3.2. Tỉ lệ mẫu chất cần phân tách với kích thƣớc cột
Sắc ký cột là sắc ký mà chất hấp thu đƣợc nạp vào trong một cột bằng thủy tinh. Kích cỡ cột tùy thuộc vào mẫu cần phân tách.
Thực nghiệm cho thấy, muốn tách chất tốt thì trọng lƣợng chất hấp thu phải
lớn hơn 25 ÷ 50 lần trọng lƣợng của mẫu chất cần sắc ký. Tuy nhiên, nếu mẫu chất
khó tách riêng thì có thể sử dụng lƣợng chất hấp thu gấp 100 ÷ 200 lần trọng lƣợng chất cần phân tách.
Thực nghiệm cũng cho thấy, muốn tách chất tốt thì chiều cao của chất hấp thu cần đạt đƣợc tỷ lệ:
Chiều cao chất hấp thu trong cột
Đƣờng kính trong của cột =
8 ÷ 10 1
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 20
3.2.3.3. Nạp chất hấp thu vào cột
Có hai cách nạp chất hấp thu vào cột: nạp sệt và nạp khô.
a) Nạp sệt
Dùng kẹp để giữ cột thẳng đứng trên giá. Phần đầu ra của cột có thể lót một miếng thủy tinh xốp, bơng thủy tinh hay bơng gịn để chặn.
Rót một cách thật từ từ và đều đặn hỗn hợp dung môi giải ly và chất hấp thu vào đầu cột. Phần đầu ra của cột đƣợc bố trí một becher để hứng dung môi.
Chú ý:
- Trong q trình rót hỗn hợp chất hấp thu và dung mơi vào cột thì ta phải khuấy cho thật đều.
- Lƣợng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp khơng đƣợc q sệt để tránh tình trạng bọt khí nằm lại ở trong cột, dễ làm gãy cột và cũng không đƣợc quá lỏng.
- Đối với chất hấp thu có thể trƣơng nở trong dung mơi thì phải ngâm chất hấp thu trong dung môi một khoảng thời gian trƣớc khi nạp cột.
- Trong quá trình nạp cột, dung mơi vẫn chảy một cách liên tục qua cột, không để đầu cột bị khô, làm hƣ bề mặt cột hoặc có thể làm gãy cột.
b) Nạp khô
Dùng kẹp để giữ cột thẳng đứng trên giá, cho dung mơi kém phân cực nhất có thể vào khoảng 2/3 chiều cao của cột. Ngang qua phễu lọc có đi dài, cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ thành cột. Khi chất hấp phụ đạt chiều cao khoảng 2 cm trong cột thì mở nhẹ khóa ở bên dƣới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dƣới cột, dung môi này đƣợc sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.
Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Kết luận: Cả hai cách đều cho kết quả tốt nếu nạp cột một cách cẩn thận. Trong trƣờng hợp cột nạp xong, quan sát thấy có nhiều bọt khí, có những bất thƣờng trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ đầu.
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 21
3.2.3.4. Nạp chất cần tách lên đầu cột
a) Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch
Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột. Nếu mẫu ở dạng khơ thì hịa tan mẫu bằng lƣợng nhỏ dung môi, dung môi khởi đầu cho việc sắc ký cột. Dung dịch mẫu càng đậm đặc càng tốt.
b) Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Nếu mẫu chất không tan trong dung môi đƣợc lựa chọn để khởi đầu giải ly cột, vì đây là dung mơi kém phân cực, thay vì mẫu chất tan trong dung mơi khá phân cực có thể ảnh hƣởng đến q trình giải ly cột. Vì thế ta có thể nạp mẫu khơ.
Mẫu chất sau khi hịa tan, có thể đƣợc thổi khơ bằng máy thổi khơng khí hồ cá hoặc cho vào bình cầu cô quay để cô quay chân không cho đến khi có bột silica gel khơ, lúc này mẫu chất cần sắc ký đã đƣợc tẩm lên bề mặt những hạt silica gel.
Dùng một ít dung mơi hịa tan lại bột silica gel khô và cho dịch này vào đầu cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu cột để bắt đầu quá trình giải ly.
3.2.3.5. Theo dõi quá trình giải ly cột
Có thể giải ly cột nhờ vào trọng lực, nhờ vào một dịng khí nén phía trên đầu cột hoặc nhờ vào lực hút ở đầu ra của cột.
Dung mơi giải ly cột có tính phân cực tăng dần nếu sử dụng silica gel cho pha thƣờng hoặc giảm dần khi chất hấp thụ là silica gel pha đảo.
Trong quá trình giải ly cột, ta sử dụng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly cột mà điều chỉnh hệ dung môi giải ly cột cho phù hợp.
Quá trình giải ly cột kết thúc khi tổng khối lƣợng chất của các giai đoạn giải ly ra khỏi cột bằng 70 ÷ 80% lƣợng cao ban đầu.
3.3. Sắc ký lớp mỏng[3] 3.3.1. Định nghĩa 3.3.1. Định nghĩa
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào các hiện tƣợng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ nhƣ silica gel, hoặc oxyd alumin. Pha tĩnh này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu đƣợc tráng thành lớp mỏng nên phƣơng pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 22
3.3.2. Các dụng cụ sử dụng
Bình sắc ký: Có thể là một chậu, hũ, lọ,...bằng thủy tinh có nắp đậy, hình dạng đa dạng.
Bản mỏng: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu nhƣ: silica gel, alumin,...đƣợc tráng thành lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc plastic.
Dung mơi giải ly bản mỏng, có thể là đơn dung mơi hoặc hỗn hợp nhiều dung mơi để có đƣợc dung mơi giải ly bản mỏng với độ phân cực nhƣ ý muốn.
Thuốc hiện hình đa năng: tỷ lệ 80 : 20 phần trăm khối lƣợng của methanol và sulfuric acid.
Ống vi quản để chấm chất lên bảng mỏng. Bếp điện và các dụng cụ cần thiết khác.
3.3.3. Triển khai sắc ký lớp mỏng
3.3.3.1. Nguyên tắc
Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng, cho mẫu cần phân tách hịa tan vào một dung mơi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất này lên bản mỏng đã chuẩn bị sẵn (kích thƣớc 2 x 4 cm) thành một vết nhỏ gọn. Để vết chấm khơ dung mơi trong mơi trƣờng khí quyển.
Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng trong một bình có chứa sẵn dung mơi giải ly phù hợp. Dung môi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên cao trong tấm bảng, mẫu chất sẽ bị phân chia thành những vết riêng biệt.
Các vết sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp vật lý: nhìn trực tiếp bằng mắt, soi dƣới đèn tử ngoại,… hoặc bằng phƣơng pháp hóa học: phun lên bản mỏng các loại dung dịch thuốc thử.
Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết trịn, có giá trị Rf không đổi trong một
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 23
Giá trị Rf đƣợc tính nhƣ sau:
Hình 3.5 Cách tính giá trị Rf
3.3.3.2. Giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình giải có kích thƣớc lớn hơn một chút so với kích thƣớc của bản mỏng. Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung mơi vào bình. Mực dung mơi khơng đƣợc cao hơn vị trí chấm mẫu trên bản mỏng.
Tiền tuyến dung môi Mức xuất phát a = 3.75 cm b = 8.5 c m Rf = b a = Rf 0.4411 5 . 8 75 . 3 b a
Đoạn đƣờng di chuyển của hợp chất Đoạn đƣờng di chuyển của dung môi
. . . Mặt kính đồng hồ để đậy bình giải ly Bình giải ly Tấm giấy lọc Bản mỏng Vết chấm chất trên bản mỏng Hình 3.6 Triển khai sắc ký lớp mỏng Vạch dung môi
Chƣơng 3: SƠ LƢỢC VỀ KỸ THUẬT CHIẾT - TÁCH
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 24
3.3.3.3. Hiện hình các vết sau khi giải ly bản mỏng
Sử dụng máy soi UV ở các bƣớc sóng 254 nm và 365 nm.
Nhúng bản mỏng trong thuốc hiện hình đa năng. Sau đó hơ nóng trên bếp điện đến khi các vết hiện rõ.
Ngồi ra chúng ta có thể sử dụng các thuốc thử khác.
3.3.4. Ƣu điểm và ứng dụng của sắc ký lớp mỏng
3.3.4.1. Ƣu điểm sắc ký lớp mỏng
Hiệu ứng tách tốt, nhạy hơn các phƣơng pháp khác (nhạy hơn 20 lần so với sắc ký giấy).
Thời gian tiến hành nhanh. Lƣợng mẫu phân tích nhanh.
Có thể phân tích đồng thời mẫu chất và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích.
Dụng cụ đơn giản.
3.3.4.1. Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng
Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiện nay vẫn là công cụ rất đắc lực trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt trong hóa học hợp chất thiên nhiên nhƣ:
- Cho biết đặc điểm của hợp chất vừa trích ly, cô lập đƣợc (một chất tinh
khiết sẽ có giá trị Rf khơng đổi trong hệ dung môi xác định).
- Có thể tiên đốn sơ bộ là trong hỗn hợp chiết xuất ban đầu có bao nhiêu hợp chất và tính phân cực của hỗn hợp mẫu chiết.
- Để định hƣớng loại dung môi phù hợp cho sắc ký cột. Trƣớc khi dùng sắc ký cột để tách một lƣợng lớn mẫu chất, các nhà nghiên cứu thƣờng hay sử dụng sắc ký lớp mỏng để thăm dị tìm hệ dung mơi thích hợp cho q trình sắc ký cột.
- Sắc ký lớp mỏng đƣợc sử dụng để theo dõi quá trình sắc ký cột, để nhận định các phân đoạn thu đƣợc từ sắc ký cột. Việc quan sát các vết trên bản mỏng rất quan trọng để có thể nhận định rằng phân đoạn đó là hỗn hợp hay tinh khiết hoặc để
gom các phân đoạn có cùng Rf với nhau.
Chƣơng 4: ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 25
Chƣơng 4: ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
4.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Phịng thí nghiệm hữu cơ chun sâu, bộ mơn Hóa, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trƣờng Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: 03/01/2011 – 17/04/2011
4.2. Phƣơng tiện thí nghiệm 4.2.1. Dụng cụ 4.2.1. Dụng cụ
Máy cô quay: Dùng để thu hồi dung mơi dƣới áp suất thấp trong q trình điều chế các loại cao và sắc ký cột.
Tủ sấy: Dùng để sấy dụng cụ nhƣ cốc, lọ bi, silicagel, cột thủy tinh sử dụng trong sắc ký cột, bình cơ quay, sấy bản mỏng,...
Một số dụng cụ khác nhƣ bình tam giác, chai đựng dung dịch, lọ bi, cốc becher các loại, bình chiết, đũa thủy tinh, bếp điện, cân điện tử, ống mao quản, ống đong,...
Cột sắc ký có đƣờng kính (D), chiều dài (l) nhƣ sau: - D = 5 cm, l = 80 cm - D = 5 cm, l = 55 cm - D = 2,8 cm, l = 40 cm - D = 2 cm, l = 40 cm - D = 0,9 cm, l = 45 cm - D = 0,7 cm, l = 30 cm 4.2.2. Hóa chất
Dung mơi: Petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, butanol.
H2SO4 đậm đặc dùng để pha thuốc hiện hình.
Silica gel 60 (0,04 ÷ 0,06 mm) và bản mỏng tráng sẵn (Merck). Nƣớc cất và một số hóa chất khác.
Chƣơng 4: ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
SVTH: Nguyễn Văn Chắc 26
4.3. Phƣơng pháp thực nghiệm 4.3.1. Phƣơng pháp chiết tách 4.3.1. Phƣơng pháp chiết tách
Rau má nguyên liệu đƣợc loại bỏ lá úa, tạp chất cơ học. Sau đó, đƣợc sấy hoặc phơi khô và đƣợc xay thành bột.