a. Xác định hàm lượng nitơ amoniac Nguyên tắc
Trong nguyên liệu chứa nitơ thường chưa nitơ vô cơ ở dạng muối amonium hay các hợp chất amin dễ bay hơi. Các trường hợp này có thể được tạo thành do sự phân hủy protein. Vì thế sự hiện diện của các hợp chất này dùng để đánh giá chất lượng thực
phẩm.
Các hợp chất nitơ vơ cơ thường có tính kiềm yếu, do đó có thể dùng dung dịch kiềm mạnh để đuổi chúng ra khỏi dung dịch ở nhiệt độ cao:
NH4+ + OH- → NH4OH→ NH3+H2O
NH3 tạo thành được thu ở bình hứng có chứa axit boric tạo thành các muối amoni
tetraborat:
2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
Sau đó định lượng dung dịch amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0.1N: (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3
Tiến hành
Cho vào ống Kjeldahl 1ml mẫu, lắp bình vào hệ thống cất đạm.
Hút 20ml axit boric 2% cho vào bình tam giác 100ml (bình hứng), đặt vào vị trí thu mẫu.
Cài đặt trên máy các thông số:
Lượng NaOH 30% cho vào hệ thống: 20ml Thời gian lôi cuốn: 3 phút
Sau khi kết thúc q trình lơi cuốn amoniac, thu mẫu ở bình hứng (mẫu có màu xanh), chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0.1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng.
Tính tốn kết quả
Hàm lượng nitơ amoniac trong 1 lít mẫu được tính theo cơng thức sau:
N (g/l)= V a 1000* * 0014 , 0 Trong đó:
0,0014: Số gam nitơ ứng với 1ml dung dịch H2SO4 0,1N 1000: Hệ số tính cho 1 lít (1000ml)
a: Thể tích dung dịch H2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) V: Thể tích mẫu dùng phân tích (ml)
b. Xác định hàm lượng nitơ formol bằng phương pháp Sorensen Nguyên tắc
Các axit amin hào tan trong nước có tính chất muối nội phân tử d nhom amino và nhóm carboxyl trung hịa lẫn nhau. Để xác định hàm lượng nitơ amin trong mẫu,
người ta tiến hành “khóa” nhóm amin bằng cách cho tác dụng với aldehyde formic, khi đó nhóm carboxyl trở nên tự do, có thể được chuẩn độ bằng dung dịch NaOH
chuẩn 0,1N với phenolphtalein làm chỉ thị màu.
R CH COOH + HCHO → R CH COOH + H2O NH2
N=CH2
R CH COOH + NaOH → R CH COONa + H2O NH2
N=CH2
Các muối amoni, thí dụ NH4Cl ở trong dung dịch trung tính, khi gặp formol cũng làm cho dung dịch trở thành axit, do hình thành hexametylen tetramin và HCl, theo phản
ứng
4NH4Cl + 6CH2O → (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl Do đó cũng định lượng bằng một chất kiềm
Tóm lại:
Nếu trong chất thử chỉ có axit amin thì nitơ formol là nitơ amin.
Nếu trong chất thử có cả axit amin lẫn muối amoni thì nitơ formol là tổng của nitơ amin và nitơ amoni. Muốn có nitơ axit amin, phải lấy nitơ formol trừ đi nitơ amoni.
Đây là trường hợp một axit yếu được định lượng bằng một chất kiềm mạnh, nên điểm
tương đương phải ở pH kiềm 9,0 – 9,5.
Tiến hành
Cân chính xác P gam chất thử đã xay nhuyễn (hoặc V ml chất thử là chất lỏng) cho
vào bình định mức 100ml, với 50ml nước cất, lắc mạnh trong 10 phút để hòa tan. Cho thêm 0,5ml dung dịch phenolphtalein.
Lấy 25 ml dịch lọc, cho vào bình nón với 20ml dung dịch formol trung tinh. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến màu đỏ tươi (pH = 9.3)
Tính tốn kết quả
Số gam nitơ formol có trong một 100g mẫu được tính theo cơng thức sau:
Nitoformol (g/100g)=0,0014*n* 25 100 * P 100 Trong đó:
0,0014: Số gam nitơ ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N
n: Thể tích dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích (ml) P: Số gam chất thử
c. Xác định hàm lượng nước trong thực phẩm
Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Nguyên lý
Dùng nhiệt làm bay hơi nước nguyên liệu. Cân trọng lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô (bằng cân phân tích), sau đó tính ra phần trăm nước có trong nguyên liệu. Sử dụng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi.
Tiến hành
Cân chính xác khoảng 5 gam mẫu được nghiền nhỏ bằng cân phân tích, cho mẫu vào cốc sứ (đã biết khối lượng).
Đem cốc chứa mẫu sấy ở nhiệt độ 1050C đến khi khối lượng cốc không đổi, thường
tối thiểu là 6 giờ.
Sau khi sấy xong, đem làm nguội mẫu trong bình hút ẩm, đem cân xác định khối
lượng.
Tiếp tục sấy ở 1050C trong 30 phút rồi để nguội ở bình hút ẩm, cân xác định khối
lượng bằng cân phân tích. Tiếp tục tiến hành tương tự cho đến khi khối lượng mẫu
không đổi.
Kết quả giữa hai lần nung và cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,0005 gam cho một mẫu thử.
Tính kết quả theo cơng thức:
X = m G G )*100 ( 2− 1 Trong đó:
G1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) G2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g) m: Khối lượng nguyên liệu (g)
Sai lệch kết quả giữa hai lần xác định song song không được lớn hơn 0,5%. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của kết quả hai lần xác định song song.
d. Phương pháp xác định NaCl Nguyên lý
Áp dụng phản ứng:
NaCl + AgNO3 → AgCl + NaNO3
Cho dung dịch chuẩn AgNO3 vào dung dịch trung tính có chứa NaCl, phản ứng trên sẽ xảy ra. Khi NaCl trong dung dịch đã kết hợp với AgNO3, một giọt thừa AgNO3 sẽ kết hợp với K2CrO4 (dùng làm chỉ thị màu) cho Ag2CrO4 màu đỏ gạch (phản ứng đã kết
thúc).
2AgNO3 + K2CrO4 → Ag2CrO4↓ + 2KNO3
Từ lượng AgNO3, ta có thể tính ra hàm lượng NaCl trong 100g thực phẩm. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
Bình nón 200 – 250ml Bình định mức 100ml Phễu
Buret
Pipet có bầu 10ml, một hoặc hai vạch Giấy lọc
Dung dịch AgNO3 0,1N CaCO3
HNO3 loãng
K2CrO4 10% trong nước trung tính
Dung dịch NaHCO3 0,01N và dung dịch para-nitrophenol 0,15% Chuẩn bị mẫu thử
Tùy theo loại thực phẩm có nhiều hay ít muối, mà định cách pha loãng
Đối với thực phẩm đặc: cắt nhỏ hay xay nhỏ, lắc với nước nóng khoảng 1 – 2 giờ. Lọc
và chuẩn độ. Kết quả tính ra NaCl (g/100g).
Đối với thực phẩm khó chiết xuất, thì nung thành tro trắng, hịa tan trong nước cất và
chuẩn độ.
Trường hợp những dung dịch đục (thí dụ như sữa) khử tạp chất bằng dung dịch kiềm chì acetate, lọc và chuẩn độ trên dung dịch lọc.
Tiến hành thử
Sau khi đã chuẩn bị mẫu thử, cho vào bình định mức với nước cất gần đủ 100ml.
Kiểm tra lại xem dung dịch có trung tính hay khơng, nếu khơng thì phải tiến hành trung hịa. Sau đó cho nước cất vào đủ 100ml.
Lấy 10ml cho vào bình nón với 3 giọt K2CrO4. Chuẩn độ từ từ (rỏ từng giọt một) dung dịch AgNO3 0,1N cho đến khi xuất hiện màu đỏ gạch bền vững.
Tính tốn kết quả:
Hàm lượng muối NaCl theo phần trăm, tính bằng cơng thức: (%)
X = m V 100* * 00585 , 0 * 10 100 (%) Trong đó:
V: thể tích AgNO3 0,1N đã dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) m: khối lượng mẫu thử (g)
0,00585: hệ số tương đương
10 100
: tỷ lệ pha lỗng
Chú ý:
Dung dịch thử khơng được chứa các halogennua. Ba2+ và Sr2+ vì K2CrO4 có thể kết tủa màu với các muối này.
Dung dịch thử và dubg dịch chuẩn AgNO3 phải trung tính vì Ag2CrO4 tan trong mơi trường axit và kiềm. Do đó phải thử bằng giấy quì trước khi chuẩn độ. Nếu dịch thử
có tính axit thì dùng CaCO3 kết tinh hoặc dung dịch bicarbonate natri 0,01N với chỉ thị màu phenolphtalein cho đến khi có phản ứng trung tính. Nếu dịch thử có tính kiềm cho HNO3 lỗng từng giọt hoặc dung dịch axit acetic 0,01N với chỉ thị màu para- nitrophenol 0,05% cho đến khi axit nhẹ rồi trung hòa lại bằng CaCO3.
Phải làm ở nhiệt độ thường vì Ag2CrO4 hơi tan khi nóng.
e. Xác định độ acid toàn phần Nguyên lý
Dùng một dung dịch kiềm chuẩn để trung hòa hết các acid trong thực phẩm với
phenolphtalein làm chỉ thị màu.
Tiến hành
Chuẩn bị mẫu thử
Cân thật chính xác khoảng 10g mẫu phân tích. Nghiền nhỏ, lắc với nước cất trong 1 giờ. Sau đó thêm nước cất đến 50ml. Lắc kỹ, để lắng, lấy 25ml nước trong ở trên để định lượng.
Nếu thực phẩm là dạng lỏng, lấy Vml và định lượng trực tiếp.
Định lượng
Cho 25ml dung dịch ở phần chuẩn bị cho vào bình tam giác 100ml, thêm 5 giọt
phenolphtalein 1%. Dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn độ cho đến khi dung dịch
chuyển sang màu hồng nhạt bền vững. Đọc thể tích dung dịch NaOH đã dùng.
Tính tốn kết quả
Độ acid tồn phần theo phần trăm (X) được tính theo cơng thức:
P n K X *100 25 50 * * (%)= Trong đó: n: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ 25ml dịch thử P: trọng lượng mẫu thử (g)
K: hệ số ứng với từng loại acid. (Đối với mắm cá lóc K = 0,009, acid lactic) Nếu thực phẩm dạng lỏng, kết quả được tính tốn như sau:
V n K X(%)= * *100 Với: n: số ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ 25ml dịch thử V: thể tích mẫu thử (ml)
f. Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Kunitz Nguyên tắc
Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein (casein hoặc
hemoglobin) bởi enzyme.
Đối tượng thí nghiệm: enzym papain thương mại và cơ chất là casein
Phản ứng này sẽ kết thúc tại một thời điểm nhất định bằng trichloroacetic acid amine sinh ra (chủ yếu là tyrosine) đo ở bước sống 280 nm.
Đơn vị đo hoạt tính của papain: được thể hiện qua đơn vị tyrosine (TU: tyrosine unit).
1TU: là lượng sản phẩm sinh ra tương đương với số µmol tyrosine do sự thủy phân
casein của enzym có trong 1ml dung dịch trong thời gian 1 phút ở điều kiện nhiệt độ
và pH môi trường nhất định.
Hoạt tính đặc hiệu của enzym: là số đơn vị hoạt tính enzym có trong 1 mg protein
(TU/mg)
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị hóa chất
Chất hoạt hóa cysteine 0,02M
Dung dịch axit trichloroacetic (TCA) 15% (w/v): cân 15g TCA hòa tan với nước cất, sau đó thêm nước cất vào vừa đủ đến 100ml
Casein 1%: hòa tan 1g casein với 100ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH=7,5 có bổ sung 0,005M EDTA. Dung dịch này được hòa tan bằng cách đun cách thủy ở nhiệt
độ 95oC khoảng 1 giờ cho đến khi hịa tan hồn tồn. Bảo quản ở 40C. Trước khi sử dụng, dung dịch phải được ủ ấm ở 370C khoảng 30 phút.
Các bước thực hiện
Làm hai mẫu thí nghiệm song song, trong đó có một mẫu đối chứng. Các bước thực hiện theo sơ đồ.
Mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng cho dd TCA vào trước, casein vào sau.
Tính tốn kết quả
Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml dung dịch enzyme được tính theo cơng thức sau:
Tu = E hh V T V x * 1000 * * *k Trong đó:
Tu: hoạt tính enzyme (Tu/ml) x: nồng độ tyrosine (µmol/ml) * Vhh: thể tích tổng của dung dịch phản ứng (4ml) T: thời gian phản ứng (10 phút) VE: thể tích enzyme (100 µl) k: hệ số pha lỗng (l) Mẫu 1 (đối chứng) 100 µl enzyme papain 200 µl dd cystein 700 µl dd đệm phosphate pH = Cn Bổ sung 3000 µl dd casein 1% Lọc Đo độ hấp thu ở 280nm Ủ 20 phút, T0C Lắc ủ 10 phút, T0 C Ổn định 10 phút Bổ sung 3000 µl dd TCA 15% Mẫu 2 100 µl enzyme papain 200 µl dd cystein 700 µl dd đệm phosphate pH = Cn Bổ sung 3000 µl dd TCA 15% Lọc Đo độ hấp thu ở 280nm Ủ 20 phút, T0 C Lắc ủ 10 phút, T0 C Ổn định 10 phút Bổ sung 3000 µl dd casein 1%
* Nồng độ tyrosine (x) trong công thức trên được xác định dựa vào đường chuẩn
tyrosine.