- Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khơ tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp
1. Dụng cụ hĩa chất
a) Dụng cụ
- Máy đo quang phổ -Ống nghiệm (14)
- Pipette 5ml, 1ml (cĩ thể thay bằng pipetteman) - Đồng hồ bấm giây - Giấy thấm - Giá để ốngnghiệm - Bình tiađựng cồn b) Hĩa chất - Cồn 900
- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1
ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha lỗng ra 100 lần, được dung dịch cĩ nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử cĩ thành phần trong 1 l
như sau:
Coomassie Brilliant Blue: 0,05g Methanol: 50 ml
Phosphoric acid 85%: 100 ml
Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1 g được làm tan trong 50 ml methanol, pha
lõang với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1)đựng trong chai màu tối cĩ nắp, 100 ml H3PO4 85% pha lõang thành 500 mlđược dung dịch (2).Khi cần sử dụng hịa 1 V (1) và 1V (2) rồi lọc lấy dịch trong.
2. Tiến hành
- Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (10 g malt trích ly bằng nước
thu được V = 100 ml). Pha lõang mẫu với hệ số pha lõang n lần để được mẫu phân tích (mẫu X) (n=1, 2 đối với malt).
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứamẫu cần phân tíchX
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 X Nước cất, ml 1 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 - Albumin chuẩn (0,1mg/ml), ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 - TT Bradford, ml 5 5 5 5 5 5 5 Nồng độ Albumin (µg/ml) ? OD595nm
(Sinh viên điền nồng độalbumin (µg/ml) vào bảng trên)
- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở
bước sĩng 595 nm. Ta cĩ giá trị OD0,ở thời điểm 21 phút đo ống1 (OD1),... tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
3. Tính kết quả:
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 - Dựa vào phương trìnhđường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595ở trên ta tính được hàm lượng proteinPở trong mẫu phân tích X.
P = X*n
Để tính tĩan hàm lượng protein trong 1g mẫu cân:
Protein (mg/g) = P x V/m
V = thể tích dung dịch trích ly, ml m = khối lượng mẫu, g.
III. Bài nộp
1. Vẽ đường chuẩn protein theo Bradford 2. Tìm phương trìnhđường chuẩn y = ax +b
3. Tính R2 =