Để khuếch đại đƣợc gen prion từ bộ gen DNA của bò Hanwoo, các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự gen prion (GeneBank số NM_181015). Kết quả gradient PCR cho thấy phổ của nhiệt độ ủ bắt cặp của mồi rất rộng, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độ bắt cặp ở 58oC (Hình 4.1).
Hình 4.1: Gradient PCR. Băng M: Thang chuẩn DNA 1Kb , 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 55 oC, 2: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 60 oC, 3: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 59 oC, 4: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 60 oC, 5: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 61 oC, 6: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 62 oC, 7: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 63 oC, 8: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 64 o
C.
Đoạn gen prion đã đƣợc khuếch đại thành công (Hình 4.2). Trọng lƣợng phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 650 bp.
Hình 4.2: Sản phẩm PCR của gen prion
M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 58 o
C
4.1.2. Tinh sạch đoạn DNA từ sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc cho vào giếng của thạch tinh sạch và có kết quả nhƣ Hình 4.3.
Hình 4.3 : Thạch tinh sạch DNA
M: Thang chuẩn DNA 1 Kb, 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 58 o
Sau đó DNA đƣợc tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction. DNA tinh khiết đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di với thạch agarose 0,8% (Hình 4.4), sản phẩm thu đƣợc sử dụng cho bƣớc tiếp theo.
Hình 4.4: Sản phẩm sau tinh sạch
M: Thang chuẩn DNA 1 Kb, 1: Sản phẩm sau quá trình tinh sạch sản phẩm PCR của gen prion
4.1.3. Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy
Sau khi tinh sạch đoạn PrP thành công, đoạn DNA đƣợc gắn vào véc tơ pGEM-T easy (Real Biotech Corp).
4.1.4. Biến nạp vào vi khuẩn E. coli
Véc tơ tái tổ hợp đã đƣợc biến nạp thành công vào vi khuẩn E. coli. Sau quá trình
nuôi cấy và thu hoạch các khuẩn lạc, véc tơ tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ vi khuẩn bằng tinh sạch plasmid.
Véc tơ pGEM-T easy có chứa gen prion đƣợc cắt bởi EcoR I và đƣợc ghi nhận ở
hình 4.5. Theo đó ta thấy véc tơ tái tổ hợp đã bị enzyme EcoR I cắt tại 2 vị trí tạo thành 2 vạch trên thạch điện di. Vạch đầu tiên 3 Kbp là véc tơ pGEM-T easy ở dạng thẳng, vạch thứ hai khoảng 650 bp là gen prion.
Hình 4.5: Véc tơ pGEM-T easy + gen prion đƣợc cắt bởi EcoRI
M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; 1: véc tơ pGEM-T easy 3,6 Kbp + gen prion không cắt;
2: véc tơ pGEM-T easy dạng thẳng 3 Kbp và gen prion 650 bp
4.1.5. Giải trình tự sản phẩm
Kết quả giải trình tự đƣợc trình bày ở Hình B.4. Kết quả cho thấy trình tự base và acid amin của prion bò Hàn Quốc giống 99% trình tự prion của giống bò ở châu Âu, chỉ khác nhau ở hai cặp base.
4.2. THẢO LUẬN
Chúng tôi đã thành công việc nhân dòng và giải trình tự gen prion. Trƣớc khi tiến
hành giải trình tự chúng tôi đã cắt plasmid tái tổ hợp bằng emzyme cắt EcoR I. Kết quả
cho thấy đoạn gen có kích thƣớc khoảng 650 bp bằng kích thƣớc mong muốn. Plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc gởi đến công ty Macrogen để giải trình tự. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình B.4. Theo kết quả trên ta thấy trình tự giống nhau đến 99% chỉ có 2 bp khác biệt ở vị trí 162 và 580 sau khi dịch mã sang acid amin ta thấy không có sự khác biệt, có thể xem sự sai khác của các base không ảnh hƣởng đến gen prion vì không làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide quy định cấu trúc protein. Theo chúng tôi sự sai khác này xảy ra có thể do các yếu tố không thể kiểm soát đƣợc trong quá trình thí nghiệm khi thực hiện các kỹ thuật nhƣ PCR, ligase, giải trình tự. Điều này nên đƣợc khảo sát kỹ hơn trong các thí
nghiệm sau. Từ đó chúng tôi cho rằng cấu trúc gen prion của bò Hàn Quốc và bò Châu Âu không khác nhau.
Trên thế giới, việc nhân dòng prion khá phổ biến và đã thành công ở hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên chúng tôi vẫn thực hiện nhân dòng vì một số lý do. Trƣớc hết để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu về sau. Hơn nữa, việc nhân dòng và giải trình tự thành công còn cho thấy sự giống nhau của bò Hanwoo và các dòng bò khác, điều này khẳng định khả năng lây nhiễm prion từ các dòng khác cho bò Hanwoo là hoàn toàn có thể xảy ra.
Việc nhân dòng thành công gen prion này tạo cơ sở và nguyên liệu cho các nghiên cứu xa hơn về cấu trúc protein. Gen prion đƣợc chèn trong véc tơ pGEM-T easy tái tổ hợp và đƣợc trữ lạnh ở -80oC. Trong quá trình nghiên cứu, plasmid tái tổ hợp đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn gen nguyên liệu thay vì phải trực tiếp tiến hành PCR để thu đƣợc đoạn gen mong muốn.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Sau thời gian thực hiện, chúng tôi đã thành công trong việc nhân dòng gen prion. Gen prion có 651 bp mã hoá 217 acid amin. Trình tự gen prion của bò Hawoo Hàn Quốc giống với giống bò khác châu Âu.
Véc tơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α thành công và
đƣợc giữ lạnh ở -80oC.
5.2. Đề nghị
- Thực hiện lại quá trình nhân dòng để kiểm tra kỹ sự khác biệt trình tự gen prion giữa bò Hanwoo của Hàn Quốc và bò châu Âu.
- Trữ giống và cấy chuyển sau một thời gian trữ lạnh để đảm bảo hoạt lực của vi khuẩn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
Nguyễn Bá Sửu. 2004; Từ điển giải thích thuật ngữ Công nghệ sinh học lương thực và
nông nghiệp; Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật, 304 trang
Nguyễn Ngọc Tuân. 2002; Vệ sinh thịt; Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 163-200
TIẾNG ANH
Anderson R. M., Donnelly C. A., Ferguson N. M., Woolhouse M. E. J., Watt C. J., Udy H. J., MaWhinney S., Dunstan S. P., Southwood T. R. E., Wilesmith J. W., et al., 1996; Transmission dynamics and epidemiology of BSE in British cattle; Nature (London) 382: 779–788.
Brown T. A., 2005; Gene cloning and DNA analysis; 4th edition;Blackwell Pusblishing;
p: 123-210.
Corsaro A., Thellung S., Russo C., Villa V., Arena S., D'Adamo MC., Paludi D., Rossi Principe D., Damonte G., Benatti U., Aceto A., Tagliavini F., Schettini G., Florio
T., 2002; Expression in E. coli and purification of recombinant fragments of wild
type and mutant human prion protein; Neurochem Int., 41(1):55-63.
Chesebro B., Race R., Wehrly K., Nishio J., Bloom M.,Lechner D., Bergstrom S., Robbins K., Mayer L., Keith J. M., et al., 1985; Identification of scrapie prion
protein-specific mRNA in scrapie-infected and uninfected brain Nature (London)
315: 331–333.
Diedrich J. F., Carp R. I. & Haase A. T., 1993; Increased expression of heat shock protein, transferrin, and beta 2-microglobulin in astrocytes during scrapie; Microb. Pathog.15:1–6.
Kang San-Gyun, Sung Keun Kang, Deog-Yong Lee, Yong-Ho Pack, Woo-Suk Hwan, and Han-Sang Yoo; 2004; Cloning, sequencing, and expression for DNA encoding bovine prion protein; J.Microbiol. Biotechnol. 14(2): 417-421
Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 2000; Molercular cell biology; 4th edition; Freeman Publishing; p: 375-377; 580-612
Nathanson N., Wilesmith J. & Griot C., 1997; A new variant of Creutzfeld-Jakob disease;
Pan K.-M., Baldwin, M., Nguyen J., Gasset M., Serban A.,Groth D., Mehlhorn I., Huang Z., Fletterick R. J., Cohen F. E. & Prusiner, S. B., 1993; Conversion of alpha- helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10962–10966.
Pergami P., Jaffe H. & Safar J., 1996; Semipreparative chromatographic method to purify the normal cellular isoform of the prion protein in nondenatured form; Anal. Biochem. 236: 63–73
Prusiner S. B. 1982; Novel Proteinaceous Infectious Particles Cause Scrapie; Sciene;
216: 136–144.
Prusiner, 1998; Prion; Pro. Nalt. Acad. Sci. USA Vol. 95: 13363-13383.
Prusiner, 2004; Prion biology and diseases 2nd Ed, CSHL press: 1-87.
Prusiner, 1991; Molecular biology of prion diseases Science 252: 1515–1522
Sambrook J. G., Russell R., et al., 2002; Fugu orthologues of human major
histocompatibility complex genes: a genome survey; Immunogenetics 54(6): 367-
80.
Sandy Primrose, Sandy Primrose, Richard Twyman and Bob Old, 2004; Principle of
Gene Manipulation; 4th edition;Blackwell Pusblishing; p: 319
Kim T. Y., Kim Y. S., Kim J. K., Shon H. J., Lee Y. H., Kang C. B., Park J. S., Kang K. S. and Lee Y. S., 2005; Rist analysis of BSE in Korea; J.Vet. Med. Sin. 67(8): 743- 752.
Wilesmith J. W., Ryan J. B. M. & Atkinson M. J.; 1991; Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies on the origin; Vet.Rec. 128: 199–203.
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A
Bảng A.1. Các bệnh do prion
Kuru Ngƣời tiền sử Lây nhiễm do tục lệ ăn thịt ngƣời
iCJD Ngƣời Lây nhiễm do prion
vCJD Ngƣời Lây nhiễm do prion từ bò?
fCJD Ngƣời Đột biến trong giai đoạn phôi ở gen prion
GSS Ngƣời Đột biến trong giai đoạn phôi ở gen prion
FFI Ngƣời Đột biến trong giai đoạn phôi ở gen prion
(D178N, M129)
sCJD Ngƣời Đột biến tế bào sinh dƣỡng hoặc do chuyển
đổi cấu trúc PrPc thành PrPSc?
FSI Ngƣời Đột biến tế bào sinh dƣỡng hoặc do chuyển
đổi cấu trúc PrPc thành PrPSc?
Scrapie Cừu Thƣờng gây bệnh di truyền trên cừu
BSE Bò Lây nhiễm do prion có trong MBM
TME Chồn Lây nhiễm do prion từ bò hoặc cừu
CWD La, hƣơu,nai Không rõ
FSE Mèo Lây nhiễm do prion có trong mô bò hoặc
MBM
Exotic ungulate Greater kudu, Cảm nhiễm do prion gây bệnh từ MBM
Encephalopathy nyala, oryx
iCJD, iatrogenic CJD; vCJD, variant CJD; fCJD, familial CJD; sCJD, sporadic CJD; GSS, Gerstmann–Stra¨ussler–Sheinker disease; FFI, fatal familial insomnia; FSI, fatal sporadic insomnia; BSE, bovine spongiform encephalopathy; TME, transmissible mink encephalopathy; CWD, chronic wasting disease; FSE, feline spongiform encephalopathy; HGH, human growth hormone; MBM, meat and bone meal.
PHỤ LỤC B
A B
Hình B.1: Cấu trúc protein PrP và vị trí của đoạn mồi trên gen prion
A: Cấu trúc của polypeptide PrP, protein PrPc và PrPsc; B: vị trí đoạn mồi trên gen prion.
Bo-F : 5’- aag aag cga cca aaa cct gga gga – 3’ K K R P K P G G Bo-R : 5’ - tgc ccc tcg ttg gta ata agc ctg – 3’
Q A Y Y Q R G A
26
Hình B.4: Phân tích trình tự gen prion của bò Hanwoo và dòng bò của châu Âu
PHỤ LỤC C
C.I. Qui trình C.I: QIAquick Kit ly trích DNA từ thạch agarose
1. Cắt đoạn DNA từ thạch agarose với dao sạch và bén. Chú ý cắt càng nhỏ càng tốt
sao cho không dính phần agarose không cần thiết.
2. Bỏ vào tube và cân miếng thạch vừa đƣợc cắt. Thêm 3 đơn vị dung dịch đệm QG
vào 1 đơn vị thạch (100 mg = 100 µl)
Ví dụ: Thêm thêm 300 µl dung dịch đệm QG vào mỗi 100 µl thạch
3. Ủ ở 500C trong vòng 10 phút cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Để tăng khả năng
tan của thạch, vortex mỗi 2 - 3 phút trong suốt quá trình ủ.
4. Sau quá trình ủ, thạch phải tan hoàn toàn và có màu vàng nhạt (cùng màu với dung
dịch đệm QG khi chƣa có thạch).
5. Thêm 1 đơn vị isopropanol vào mẫu và trộn.
Ví dụ: nếu mẫu thạch agarose có khối lƣợng 100 mg, thêm 100 µl isopropanol. Bƣớc này có thể ảnh hƣởng lên DNA có chiều dài dƣới 500 bp hoặc trên 4 Kbp, đối với mẫu nằm giữa hai độ dài trên thì ảnh hƣởng không đáng kể. Cần chú ý không ly tâm trong suốt quá trình này.
6. Đặt cột quay QIAquick vào tube thu DNA 2 ml.
7. Để thu nhận DNA, cho mẫu vào cột quay và thực hiện ly tâm ở 12000 vòng/phút
(rpm) trong 1 phút. Tối đa chỉ có thể cho 800 µl vào một cột quay, đối với mẫu nhiều hơn phải ly tâm thêm 1 lần.
8. Bỏ phần dung dịch và đặt cột quay QIAquick trở lại tube thu DNA
9. (Không bắt buộc) thêm 0,5 ml dung dịch đệm QG vào cột quay và ly tâm ở 12000
rpm trong 1 phút.
Bƣớc này sẽ loại bỏ tất cả agarose. Bƣớc này chỉ bắt buộc khi DNA đƣợc sử dụng trực tiếp cho việc giải trình tự, dịch mã in vitro hoặc vi tiêm.
10. Để rửa sạch isopropanol, thêm 0,75 ml dung dịch đệm PE vào cột quay QIAquick
và ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút.
Chú ý: Nếu DNA sẽ đƣợc sử dụng cho ứng dụng nhạy với muối, nhƣ kết buộc với đầu bằng và giải trình tự trực tiếp, để yên cột trong vòng 2-5 phút và thêm dung dịch đệm PE trƣớc khi ly tâm.
11.Đổ bỏ phần dịch nổi và ly tâm cột QIAquick thêm 1 phút ở tốc độ trên 10000 rpm
Chú ý: ethanol trong dung dịch đệm PE sẽ không đƣợc loại bỏ hoàn toàn nếu không đổ bỏ phần dịch nổi trƣớc khi ly tâm.
12.Đặt cột QIAquick vào tube sạch 1,5ml
13.Để hoà tan DNA, thêm 20 µl dung dịch đệm EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) hoặc nƣớc vào giữa màng QIAquick và ly tâm trong 1 phút ở tốc độ tối đa. Để tăng nồng độ DNA, thêm 30 µl dung dịch hoà tan vào giữa màng QIAquick và để yên trong khoảng 1 phút trƣớc khi tiến hành ly tâm.
Chú ý: chắc chắn rằng dung dịch hoà tan đƣợc cho vào trực tiếp lên màng cột QIAquick để DNA có thể bám vào. Trung bình lƣợng hoà tan thu đƣợc là 48 µl từ
50 µl dung dịch hoà tan hoặc 28 µl từ 30 µl.
Hiệu quả của quá trình tinh sạch phụ thuộc vào pH. Quá trình này hoạt động tốt nhất ở pH từ 7,0 đến 8,5. Khi sử dụng nƣớc, đảm bảo rằng pH phải đƣợc ổn định,
và không nên trữ lạnh ở -20oC vì có thể làm thái hoá DNA khi không có một số
tác nhân trong dung dịch đệm. DNA tinh khiết có thể hoà tan trong TE (10 mM Tris-Cl; 1 mM EDTA, pH 8,0) tuy nhiên EDTA có thể làm mất hoạt tính của phản ứng enzyme.
C.II. Qui trình C.II: Chuẩn bị plasmid (Phƣơng pháp kiềm)
1. Chuyển khuẩn lạc vào 5 ml môi trƣờng LB có chứa chất kháng sinh thích hợp. Ủ
mẫu để nuôi cấy ở 37oC qua đêm trong máy ủ lắc.
2. Cho 1,5 ml dịch nuôi cấy vào tube. Ly tâm ở 12000 rpm trong 30 giây ở 4oC.
3. Loại bỏ phần nổi, làm khô phần tủa càng khô càng tốt.
4. Cho vào phần tủa 100 µl dung dịch 1 đƣợc giữ lạnh và vortex mạnh.
5. Thêm 200 µl dung dịch 2 vừa đƣợc chuẩn bị. Trộn hỗn hợp bằng cách đảo nhanh
tube 5 lần.
6. Thêm 150µl dung dịch 3 đƣợc giữ lạnh. Trộn hỗn hợp bằng cách đảo nhanh tube 5
lần. Để tube trong vòng 3-5 phút.
7. Ly tâm ở 12000 rpm trong 15 phút ở 4oC. Chuyển phần dịch nổi sang tube mới.
8. Kết tủa DNA bằng 2 phần EtOH, vortex. Bỏ hỗn hợp vào trữ lạnh ở -20oC trong
20 phút.
9. Ly tâm ở 12000 rpm trong 15 phút ở 4oC.
10.Nhẹ nhàng loại bỏ phần dịch nổi, để yên tube, mở nắp và đậy bằng giấy thấm cho
đến khi tube khô hoàn toàn.
11.Rửa DNA với 1ml EtOH ở 4oC. Loại bỏ phần dịch nổi nhƣ ở bƣớc 10, để phẩn kết
tủa trong không khí cho đến khi không còn mùi cồn (thƣờng 10 phút).
12.Hoà tan DNA với 50µl TE hoặc nƣớc cất, vortex.
Dung dịch 1 50 mM đƣờng glucose 25 mM Tris-Cl (pH 8,0) 10 mM EDTA (pH 8,0) Dung dịch 2 0,2N NaOH 1% SDS Dung dịch 3 5M potassium acetate 60 ml glacial acetic acid 11,5 ml