Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.1 Chất liệu nghiên cứu trên thực nghiệm
Rễ cây Ba bét lùn (BBL) được thu hái tại vùng rừng núi huyện Easup tỉnh
Đăklăk vào tháng 11-12/2014. Cây Ba bét lùn được thẩm định tên khoa học tại
2 nơi: (1) Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; (2) giáo sư Trần Văn Ơn, bộ môn thực vật trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 2.1, 2.2).
Mẫu rễ cây Ba bét lùn (M. nanus) 4kg, sau khi thu hái được rửa sạch, thái mỏng, phơi khơ trong bóng râm rồi sấy ở nhiệt độ 55-60oC đến khơ, sau đó xay thành bột. Mẫu rễ cây dạng bột được chiết bằng ethanol 96% theo phương pháp chiết Soxhlet đến hết hoạt chất. Dịch chiết ethanol được cất loại bớt dung mơi xuống cịn khoảng 1/15 thể tích ban đầu bằng phương pháp cơ cách thuỷ. Lấy dịch ethanol cô đặc bằng cất quay (chân khơng) loại hết dung mơi thu được cặn chiết tồn phần của rễ cây ba bét lùn.
Cặn chiết rễ cây Ba bét lùn: 1 gam tương đương 22,7g dược liệu.
2.1.1.1 Chất liệu nghiên cứu độc tính cấp
Cân 1 gam cặn chiết từ rễ BBL, thêm vừa đủ dung môi cồn 20% ethanol
được 20ml dùng trong nghiên cứu độc tính cấp.
2.1.1.2 Chất liệu nghiên cứu kích ứng da
Đánh giá kích ứng da ở 2 nồng độ:
+ Nồng độ 1: Cân 1 gam cặn chiết từ rễ BBL pha với cồn 20% ethanol tạo thành dịch chiết có nồng độ 2,2 mg cặn/ 0,5 mL (tương đương 0,05 g dược
+ Nồng độ 2: Cân 1 gam cặn chiết từ rễ BBL pha với cồn 20% ethanol tạo thành dung dịch có nồng độ 8,8 mg cặn/ 0,5 mL (tương đương 0,2 g dược
liệu/0,5 mL).
- Dụng cụ phục vụ nghiên cứu: Gạc vô khuẩn cắt miếng hình vng diện tích 2,5cm x 2,5cm, gạc băng, kính lúp, nước sạch để rửa sạch vùng bơi thuốc.
2.1.1.3 Chất liệu nghiên cứu kích ứng mắt
Dịch chiết rễ cây BBL nồng độ 2,2 mg cặn/ 0,5 mL (tương đương 0,05 g dược liệu/0,5 mL).
Hóa chất, dụng cụ phục vụ nghiên cứu: Proparacain hydrochlorid 0,5%, kính lúp.
2.1.1.4 Chất liệu nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Dịch chiết rễ cây BBL nồng độ 2,2 mg cặn/ 0,5 mL (tương đương 0,05 g dược liệu/0,5 mL).
Hoá chất:
Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: ALT (alanin
aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol, creatinin và glucose của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy).
Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX - Diagnostics, định lượng trên máy Vet abcTM
Animal Blood Counter. Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
2.1.1.5 Chất liệu nghiên cứu hoạt tính kháng P. acnes - Vật liệu cho nuôi cấy chủng P. acnes từ bệnh nhân:
+ Nước muối sinh lý NaCl 0,9%.
+ Hệ thống nuôi cấy kị khí: máy VAC, (của hãng Don Whitley Scientific Limiteted - Anh).
+ Bình khí carbon dioxid, air, hydro, nitrogen (đi kèm theo máy) hoặc bình khí trộn (10% H2, 10% CO2, 80% N2), áp suất điều chỉnh 2 – 4 bar;
+ Chất xúc tác anotox, catalyst;
+ Môi trường nuôi cấy: Thạch máu với 5% máu cừu, thạch So-co-la.
- Vật liệu cho định danh P. acnes
+ Bộ thuốc nhuộm Gram. + Oxy già
+ Bruker α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix: + Bruker Bacterial Test Standard (BTS)
+ Acetonitrile (ACN) tinh khiết 99-100% (Sigma Aldrich)
+ Acid trifluoroacetic (TFA) tinh khiết 99-100% (Sigma Aldrich) + Ethanol tinh khiết 99-100% (Sigma Aldrich)
+ Nước siêu tinh khiết
- Vật liệu cho xác định mức độ nhạy cảm của chủng Propionibacterium acness với dịch chiết từ rễ cây BBL
+ Môi trường lỏng BDTM Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
+ Dịch chiết rễ cây BBL ở các nồng độ: 0,2mg/mL, 2,2mg/mL, 4,4mg/mL, 8,8mg/mL, 17,6mg/mL.
+ Môi trường ni cấy đặc hiệu cho vi khuẩn kỵ khí: thạch máu với 5% máu cừu, thạch Chocolate, GC, KK.
2.1.1.6 Chất liệu nghiên cứu tác dụng của dịch chiết BBL trên trên động vật thí nghiệm
Thuốc dùng trong nghiên cứu:
- Thuốc thử mẫu 1 (BBL 10%): dịch chiết BBL 4,4mg/mL (0,05 g dược liệu/0,5 mL);
- Thuốc thử mẫu 2 (BBL 20%): dịch chiết BBL 8,8mg/mL (0,1g dược liệu/0,5 mL);
- Thuốc thử mẫu 3 (BBL 40%): dịch chiết BBL 17,6mg/mL (0,2g dược liệu/0,5 mL);
Hóa chất, dụng cụ phục vụ nghiên cứu
- Vi khuẩn P. acnes, mã vi khuẩn ATCC® 6919 nhập từ công ty
Microbiologics – Hoa Kỳ.
- Acid oleic 98%: Cơng ty hóa chất Xilong – Trung Quốc. Acid oleic được pha loãng hàng ngày với dầu parafin để được dung dịch 50%. Dung môi
parafin: cơng ty hóa chất Handan Tianmu – Trung Quốc.
- Locacid (tretinoin 0,05%): Dạng kem bôi da tuýp 30g của hãng Laboratories Biogra – Pháp. Oxy-5 (benzoyl peroxid): kem bôi da tuýp 10g hãng Rohto - Mentholatum (Việt Nam). Tetracyclin 1% dạng kem bôi da tuýp 5g của Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung Ương 2.
- Dung môi muối đêm phốt phát - Phosphate Buffered Saline (PBS) do
Công ty Bio-Rad Singapore cung cấp. Cồn 20%: pha lỗng từ cồn 70% do Cơng ty Cổ phần TW 1 cung cấp. Dung môi là nước cất.
- Các hóa chất làm tiêu bản mơ bệnh học vi thể tổ chức da ống tai ngoài thỏ của Trung tâm Phát hiện và Chẩn đoán sớm Ung thư. Kết quả vi thể do
PGS.TS. Lê Đình Roanh đánh giá và nhận định.
- Compa điện tử đo ngoài Model 2132-20 của hãng Insize, Áo. - Ống so nồng độ Macphalan 0,5 (10 mL) của hãng Medix – Hoa Kỳ.