Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Đối tượng nghiờn cứu
2.1.2. Đối tượng nghiờn cứu can thiệp lõm sàng
Đối tượng trong nghiờn cứu của chỳng tụi là những bệnh nhõn cú răng nhạy cảm ngà đến khỏm tại Trung tõm kỹ thuật cao khỏm chữa bệnh Răng- Hàm-Mặt, Viện Đào tạo Răng Hàm Mặt –trường Đại học Y Hà Nội được lựa chọn theo những tiờn chuẩn sau:
- Tiờu chuẩn lựa chọn:
+ Bệnh nhõn từ 18 tuổi trở lờn tự nguyện đồng ý hợp tỏc trong quỏ trỡnh điều trị và nghiờn cứu.
+ Bệnh nhõn cú ớt nhất hai răng nhạy cảm ngà với mức độ nhạy cảm gần tương đương nhau và ở vị trớ tương đồng (cổ răng, mặt nhai). Cỏc răng nhạy cảm ngà khụng cú chỉđịnh điều trị phục hồi.
- Tiờu chuẩn loại trừ:
+ Loại trừ bệnh nhõn [37], [41], [99].
* Những bệnh nhõn đang được điều trị y khoa, bao gồm cảđiều trị tõm lý * Bệnh nhõn sử dụng thuốc giảm đau, chống viờm, an thần trong vũng 72 giờtrước.
* Phụ nữ cú thai.
* Bệnh nhõn cú hội chứng trào ngược dạ dày – thực quản chưa được điều trịổn định
* Bệnh nhõn đang cú nhiễm trựng cấp tớnh hay cú bệnh lý ỏc tớnh trong miệng.
* Bệnh nhõn đang làm việc trong mụi trường acid .
* Bệnh nhõn được điều trị phẫu thuật nha chu hay chỉnh hỡnh răng mặt trong thời gian chưa đến sỏu thỏng.
* Bệnh nhõn đó điều trị nhạy cảm ngà hoặc tẩy trắng răng trong vũng sỏu thỏng trước.
+ Loại trừrăng:
* Những răng cú bất kỳ bệnh lý hay khiếm khuyết khỏc.
* Những răng mang chụp hay được sử dụng làm trụ trong răng giả cố định, thỏo lắp.
* Những răng cú nhiều hơn một vị trớ nhạy cảm ( vựng nhạy cảm).
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Phương phỏp nghiờn cứu thực nghiệm in vitro
2.2.1.1. Phương tiện nghiờn cứu
+ Mỏy nha khoa, mỏy hỳt di động.
+ Tay khoan high speed, low speed với cỏc mũi khoan trũn, trụ nhỏ. + Mỏy AMD laser, model: Picasso Lite, bước súng 810 nm, cụng suất đầu ra tối đa 2,5W, do cụng ty Dentsply International cung cấp.
+ Kớnh hiển vi điện tử quột SEM (Scanning electron microscope) + Kớnh hiển vi quang học.
+ Bộ cắm mini vis và mini vis đường kớnh 1,5mm, chiều dài 10 mm. + Bộ kỡm, bẩy nhổrăng.
+ Dao phẫu thuật số15, cõy búc tỏch, mũi khoan xương. + Đĩa cắt kim loại, dao Stainless Steel.
+ Thỡa lấy dấu răng cửa, chất lấy dấu, thạch cao đỏ, thạch cao thường.
2.2.1.2. Cỏc bước tiến hành
Nghiờn cứu thực nghiệm (TN) của chỳng tụi bao gồm 2 giai đoạn, trong đú cỏc nghiờn cứu giai đoạn 1 được thực hiện để làm cơ sở cho cỏc nghiờn cứu giai đoạn 2 (bảng 2.1).
Bảng 2.1: Bảng túm tắt quỏ trỡnh nghiờn cứu thực nghiệm Giai đoạn Giai đoạn nghiờn cứu Tờn (mục tiờu) nghiờn cứu Đối tƣợng nghiờn cứu Cỏch thức tiến hành Đọc kết quả Tỡm liều chiếu tia tối ưu.
6 con thỏ trưởng thành
Cỏc răng cửa được tạo “cửa sổ men” tại vị trớ cổ răng và nhận cỏc liều chiếu laser khỏc nhau: + Chiếu 5 giõy (5J/mm2) + Chiếu 10 giõy (10J/mm2) + Chiếu 15 giõy (15Jm/2 ) Sau đú cỏc mẫu răng được soi trờn SEM. Đỏnh giỏ HQ bịt ON của từng liều laser. Mụ tả đặc điểm mụ học tủy răng. 2 con thỏ trưởng thành và 2 con thỏ chưa trưởng thành
Mỗi chiếc răng cửa được cắt lấy một mẫu răng dài 2mm tớnh từ đường viền lợi về phớa chõn răng. Mẫu răng đươc cắt lỏt và soi trờn kớnh hiển vi quang học. Mụ tả đặc điểm mụ học của tủy răng cửa của thỏ. GI AI ĐO Ạ N 1
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu của giai đoạn 1 chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu giai đoạn 2
Mụ tảđặc điểm mụ học tủy răng sau chiếu laser.
3 con thỏ chưa trưởng thành.
Cỏc răng cửa được tạo “cửa sổ men” ở vị trớ dưới lợi 2mm và nhận liều chiếu laser tối ưu.
Sau đú cỏc răng được nhổ, cắt lỏt soi trờn kớnh hiển vi quang học Mụ tảđặc điểm mụ học của tủy răng thỏ sau chiếu laser. Đỏnh giỏ hiệu quả bịt ống ngà của laser diode. 10 con thỏ trưởng thành.
Cỏc răng cửa được tạo “cửa sổ men” tại vị trớ cổ răng và nhận liều chiếu laser tối ưu (10 giõy, tương đương 10J/mm2)
Sau đú cỏc mẫu răng được soi trờn SEM. Đỏnh giỏ HQ bịt ON của laser diode liều chiếu tối ưu tại thời điểm tức thỡ và sau 3 thỏng. Nghiờn cứu tỡm liều chiếu tia tối ưu
Nghiờn cứu được tiến hành qua cỏc bước sau [31], [86], [100], [101] -Phõn nhúm đối tượng nghiờn cứu: sỏu con thỏ được chia ngẫu nhiờn thành 3 nhúm nghiờn cứu là nhúm TN1, nhúm TN2 và nhúm TN3.
-Bắt cặp răng: cứ hai răng trờn cựng một hàm của một con thỏđược bắt thành cặp, một răng chứng và một răng nhận ỏnh sỏng laser.
-Gõy mờ thỏ: Ketamine tiờm tĩnh mạch, 100mg/1kg cõn nặng
-Tạo “cửa sổ men”: mỗi chiếc răng cửa của thỏ được mở một “cửa sổ men” vựng cổ răng sỏt lợi kớch thước 2 x 2 mm, sõu 0,5 mm bằng mũi khoan cú phun nước liờn tục.
- Etching vựng “cửa sổmen” bằng axit phosphoric 37% trong 10 giõy, sau đú rửa sạch. GI AI ĐO Ạ N 2
-Chiếu laser: chiếu laser lờn vựng “cửa sổmen” của cỏc răng nhận ỏnh sỏng laser với mức cụng suất 0,5W, chế độ súng liờn tục, khụng tiếp xỳc, khoảng cỏch từđầu tip đến bề mặt răng 1 mm.
+ Hai con thỏ nhúm TN1 nhận liều chiếu 5 giõy liờn tục- nghỉ 5 giõy tại một điểm bề mặt (tổng liều 5 J/ mm2).
+ Hai con thỏ nhúm TN2 nhận liều chiếu 10 giõy liờn tục- nghỉ 10 giõy tại một điểm bề mặt (tổng liều 10 J/ mm2).
+ Hai con thỏ nhúm TN3 nhận liều chiếu 15 giõy liờn tục-nghỉ 15 giõy tại một điểm bề mặt (tổng liều 15 J/ mm2).
Sử dụng một lỏ chắn thộp để ỏnh sỏng laser khụng tỏc động đến răng chứng bờn cạnh. Giữ cho bề mặt răng hơi ẩm bằng một miếng bụng ẩm.
Cỏc răng được chiếu 3 lần với cựng một cỏch thức, khoảng cỏc giữa cỏc lần chiếu tia là 7 ngày.
-Thu hoạch răng: sau 1 tuần từ khi chiếu tia lần 3 tiến hành nhổ tất cả cỏc răng. Cỏc răng sau khi nhổ được cắt bỏ phần thõn răng phớa trờn và chõn răng phớa dưới tại vịtrớ cỏch “cửa sổmen” 1 mm.
Mẫu răng được cho vào cỏc lọ riờng theo từng nhúm, cố định bằng dung dịch glutaraldehyd 2,5% ở 40C ớt nhất trong 24 giờ.
-Xử lý mẫu: cỏc mẫu răng được rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M- 1,5M và hỳt nước bằng cồn cỏc nồng độ 500-1000. Sau đú, mẫu được gắn lờn đế và phủ một lớp dẫn điện Pt-Pd.
-Soi mẫu trờn kớnh hiển vi điện tử quột (SEM): đỏnh giỏ hiệu quả bịt ống ngà của từng nhúm nghiờn cứu và quan sỏt những thay đổi ở bề mặt ngà răng khi chiếu cỏc liều laser khỏc nhau. Mẫu răng được quan sỏt tồn bộ vựng “ cửu sổmen” đó tạo bằng cỏch điều chỉnh cỏc thanh trượt của mỏy. Mỗi mẫu răng được chụp 5 ảnh tại 5 vịtrớ tương tự nhau ở cả răng chứng và răng laser: 4 vị trớ ngoại vi và 1 vị trớ trung tõm (hỡnh 2.1). Ảnh chụp của mỗi nhúm răng
được lưu vào từng file riờng và được mó húa để việc đọc kết quả là hoàn toàn khỏch quan.
Đỏnh giỏ hiệu quả bịt ống ngà: dựa theo tiờu chớ của West cú sửa đổi [102]. Ống ngà bịt hoàn toàn là những ống ngà được bịt toàn bộ bề mặt hoặc chỉ cũn lại một khe hẹp < ẳ đường kớnh ống ngà (ĐKON).
Ống ngà bịt một phần là những ống ngà khụng được bịt hoàn toàn nhưng được bịt ẳ ĐKON.
Ống ngà khụng được bịt là những ống ngà được bịt < ẳ ĐKON.
Đỏnh giỏ tỏc động gõy nứt miệng ống ngà của răng laser và răng chứng. Từ kết quả nghiờn cứu, tiến hành so sỏnh hiệu quả bịt ống ngà và tỏc động gõy nứt miệng ống ngà của 3 nhúm laser để rỳt ra phương thức chiếu tia hợp lý nhất, gọi là liều chiếu tia tối ƣu.
Hỡnh 2.1. Vị trớ vựng chụp ảnh khi phõn tớch mẫu trờn SEM
Nghiờn cứu mụ tảđặc điểm mụ học của tủy răng thỏ
Nghiờn cứu được tiến hành qua cỏc bước sau
- Đỏnh dấu vị trớ cổ răng sỏt lợi của 4 răng cửa ( 2 răng cửa trờn và 2 răng cửa dưới) của mỗi con thỏ bằng một mũi khoan trụ nhỏ đường kớnh
-Nhổcỏc răng cửa của thỏ (gồm cả hàm trờn và hàm dưới).
-Mỗi chiếc răng được cắt bỏ phần thõn răng phớa trờn và chõn răng phớa dưới lấy một mẫu răng dài 2 mm tớnh từ đường đỏnh dấu về phớa chõn răng (hỡnh 2.3).
-Cỏc mẫu răng được ngõm trong dung dịch Bouin để cố định và khử khoỏng bằng dung dịch axit nitric. Sau đú mẫu được đỳc trong khối sỏp.
-Cắt lỏt ngang mẫu răng: độ dày mỗi lỏt 3 – 5 m. -Nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin.
-Soi mẫu trờn kớnh hiển vi quang học ở cỏc độ phúng đại 250, 500 và 1000 lần để tỡm hiểu cỏc vấn đề sau:
Đặc điểm mụ học của tủy răng của thỏ, đặc biệt là lớp nguyờn bào tạo ngà.
Sự khỏc nhau về đặc điểm mụ học của tủy răng tại vựng lấy mẫu nghiờn cứu (từ vị trớ cổ răng sinh lý xuống dưới cổ răng 2 mm) ở thỏ trưởng thành và thỏchưa trưởng thành.
Từ kết quả nghiờn cứu giỳp lựa chọn đối tượng hợp lý cho nghiờn cứu mụ tả dặc điểm mụ học của tủy răng thỏ sau chiếu laser.
Hỡnh 2.3. Mẫu răng thỏ dài 2mm sau khi cắt bỏ phần thõn răng phớa trờn và chõn răng phớa dưới.
Nghiờn cứu mụ tảđặc điểm mụ học của tủy răng thỏ sau chiếu laser
Nghiờn cứu được tiến hành qua cỏc bước sau -Bước 1: Gõy mờ thỏ
Sử dụng thuốc ketamine tiờm tĩnh mạch, liều 100 mg/ 1kg cõn nặng. -Bước 2: Bộc lộ vựng cổrăng dưới lợi
Đỏnh dấu vị trớ cổrăng sỏt lợi của hai răng cửa trờn bằng một mũi khoan trụ nhỏ.
Bộc lộ cổ răng dưới lợi ở mặt trước (mặt mụi) hai răng cửa trờn bằng hai đường rạch song song ở phớa xa hai răng cửa (đường rạch hướng về phớa chõn răng, hơi mở rộng về phớa trờn để vạt được nuụi dưỡng tốt). Búc tỏch vạt toàn phần.
Dựng mũi khoan xương mài thấp phần mào xương ổ răng ở mặt trước (mặt mụi) hai răng cửa hàm trờn để phần mào xương cỏch đường đỏnh dấu vị trớ cổrăng 2 mm.
- Bước 3: Tạo “cửa sổmen” (hỡnh 2.4)
Cỏc răng cửu trờn của mỗi con thỏ được tạo một “cửa sổ men” tương tự
- Bước 4: Chiếu laser (hỡnh 2.5)
Hai răng cửa trờn của mỗi con thỏ được chia thành 2 nhúm gồm nhúm TN5 và nhúm TN6 nhận liều chiếu laser với 2 phương thức chiếu tia khỏc nhau tại vịtrớ “cửa sổmen”.
Nhúm TN5 bao gồm cỏc răng cửa trờn bờn phải của mỗi con thỏ nhận
liều chiếu tia tối ƣu: chiếu 10 giõy liờn tục- nghỉ 10 giõy tại một điểm bề mặt, tổng thời gian chiếu 20 giõy/mm2tương đương liều 10J/ mm2.
Nhúm TN6 bao gồm cỏc răng cửa trờn bờn trỏi của mỗi con thỏ: chiếu liờn tục 20 giõy/mm2 (khụng cú khoảng nghỉ nhiệt) tương đương liều 10J/ mm2.
Sử dụng mỏy laser diode với mức cụng suất và cỏc chếđộcài đặt tương tự
nghiờn cứu tỡm liều chiếu tia tối ưu. Một lỏ chắn thộp được đặt giữa hai răng đểỏnh sỏng laser khụng tỏc động đến răng cũn lại trong quỏ trỡnh chiếu tia.
Mỗi chiếc răng được chiếu laser 3 lần với cựng một phương thức, khoảng cỏch giữa cỏc lần chiếu tia là 7 ngày.
- Bước 5: Cốđịnh hai răng cửa của thỏ (hỡnh 2.6)
Sau lần chiếu tia thứ 3, lấy mẫu hai răng cửa trờn của thỏ, đổ mẫu và gửi xưởng đỳc hai chiếc chụp thộp (liền nhau) theo thiết kế.
Gắn chụp thộp lờn hai răng cửa của thỏ bằng Fuji Plus.
Cắm hai mini vis vào hai bờn sống hàm hàm trờn của thỏ cỏch vị trớ răng cửa 1 – 2 cm.
Buộc chỉ thộp từ hai chiếc múc của chụp thộp đến mini vis để hạn chế sự mọc dài ra của răng.
-Bước 6: Hậu phẫu
Thỏ được chăm súc kỹ bằng chế độ ăn mềm, tiờm khỏng sinh 1ml/ ngày/ 1 con thỏ trong 3 ngày, bụi Chlohexidine 0,12% hàng ngày tại vựng phẫu thuật trong 7 ngày.
- Bước 7: Thu hoạch mẫu
Sau ba thỏng tớnh từ lần chiếu laser thứ ba, thỏ được gõy mờ và nhổ 2 răng cửa hàm trờn. Cỏc răng được nhổ bằng bẩy rất nhẹ nhàng để khụng làm tổn thương mẫu. Khi răng đó lung lay dựng kỡm lắc nhẹ từ từrỳt răng ra.
Răng sau khi nhổđược rửa sạch bằng nước muối sinh lý. Cắt bỏ phần thõn răng phớa trờn và chõn răng phớa dưới tại vị trớ cỏch “cửa sổmen” đó tạo 1mm.
- Bước 8: Xử lý mẫu
Ngõm mẫu trong dung dịch, cốđịnh Bouin ớt nhất 24 giờ. Khử khoỏng bằng dung dịch axit nitric, sau đú mẫu được đỳc trong khối sỏp.
Cắt lỏt ngang cỏc mẫu răng, độ dày mỗi lỏt 3 – 5 m. Cỏc lỏt cắt được gắn trờn lam kớnh và nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin.
- Bước 9: Soi mẫu
Mẫu được soi bằng kớnh hiển vi quang học ở cỏc độ phúng đại 250, 500 và 1000 lần để đỏnh giỏ sựthay đổi của mụ tủy và lớp nguyờn bào tạo ngà sau chiếu tia laser với cỏc phương thức khỏc nhau.
-Bước 10: Ghi nhận kết quả
Nghiờn cứu này chỉ nhằm mục đớch mụ tả đặc điểm mụ tủy và lớp nguyờn bào tạo ngà sau chiếu laser (định tớnh) mà khụng tớnh khối lượng lớp nguyờn bào tạo ngà (định lượng).
Hỡnh 2.4. “Cửa sổmen” được tạo trờn răng cửa của thỏ.
Hỡnh 2.5. Chiếu laser tại vựng “cửa sổ men” răng cửa trờn của thỏ.
Nghiờn cứu đỏnh giỏ hiệu quả bịt ống ngà của laser diode (phục vụ mục tiờu nghiờn cứu)
Nghiờn cứu được tiến hành qua cỏc bước sau - Bƣớc 1: Phõn nhúm đối tƣợng nghiờn cứu
10 con thỏđược chia ngẫu nhiờn thành 2 nhúm (mỗi nhúm 5 con) + Nhúm TN7: Thu hoạch răng ở thời điểm tức thỡ sau chiếu laser. + Nhúm TN8: Thu hoạch răng ở thời điểm 3 thỏng sau chiếu laser. - Bƣớc 2: Chuẩn bị thỏ
Gõy mờ thỏ bằng thuốc ketamine tiờm tĩnh mạch, liều 100 mg/1kg cõn nặng Đỏnh dấu một vựng kớch thước 2 x 2mm tại vị trớ cổrăng sỏt lợi của cỏc răng cửa mỗi con bằng bỳt sơn màu (hỡnh 2.7).
- Bƣớc 3: Tạo “cửa sổmen” và etching
Thực hiện tương tự nghiờn cứu tỡm liều chiếu tia tối ưu.
- Bƣớc 4: Bắt cặp răng
Cứ hai răng trờn cựng một cung hàm của mỗi con thỏ được bắt thành cặp, một răng chứng và một răng nhận ỏnh sỏng laser. Cỏc cặp răng của từng con thỏđều được ghi đầy đủ vào sổ theo dừi nghiờn cứu.
- Bƣớc 5: Chiếu laser
Chiếu laser tại vị trớ “cửa sổ men” với liều chiếu tia tối ƣu.
Sử dụng một lỏ chắn thộp giữa hai răng để ỏnh sỏng laser khụng tỏc động đến răng chứng bờn cạnh. Giữ cho bề mặt răng luụn hơi ẩm bằng một miếng bụng ẩm, quột lờn bề mặt răng ở những khoảng nghỉ.
- Bƣớc 6: Thu hoạch răng nhúm TN 7và cốđịnh răng nhúm TN8
Tiến hành nhổ răng của 5 con thỏ nhúm TN7. Cỏc răng sau khi nhổ được cắt bỏ phần thõn răng phớa trờn và chõn răng phớa dưới tại vị trớ cỏch cửa sổ men 1 mm. Sau đú cỏc mẫu răng được làm sạch bằng cỏch ngõm trong dung dịch nước muối sinh lý và rung bằng mỏy rung siờu õm hai lần, mỗi lần 20 phỳt [31].
Cỏc con thỏnhúm TN8 được cốđịnh răng tương tự bước 5 của nghiờn cứu thực nghiệm thứ hai.
- Bƣớc7: Xử lý mẫu nhúm TN7
Cỏc mẫu sau khi làm sạch được cố định bằng dung dịch glutaraldehyd