CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE
Sau khi xác định được thời gian nhân giống thích hợp, cần xác định thời gian kết thúc quá trình lên men cho các thí nghiệm sao cho phù hợp. Do đĩ, chúng tơi thực hiện khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum nhằm chọn thời điểm kết thúc q trình lên men một cách thích hợp nhất.
Sử dụng dịch giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy là 10% để nuơi cấy thu nhận cellulose trên mơi trường cơ bản HS trong bình erlen 250 ml chứa 100 ml dịch lên men, nhiệt độ nuơi cấy là 280C. Trong quá trình nuơi cấy, khảo sát hàm lượng cellulose được được tổng hợp trong các khoảng thời gian khác nhau, đồng thời xác định pH của dịch lên men.
Kết quả thu được cho thấy, trong suốt quá trình lên men, A. xylinum liên tục tổng hợp cellulose, tương ứng với quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
Ở ngày đầu tiên, do vừa chuyển từ mơi trường nhân giống sang mơi trường lên men nên cĩ sự thay đổi đột ngột về mơi trường, số lượng tế bào trong mơi trường chưa đủ
lớn nên sự tạo thành cellulose hầu như chưa cĩ. Sau 2 ngày xuất hiện những sợi cellulose mảnh lơ lửng trong mơi trường và trên bề mặt bắt đầu xuất hiện một lớp màng cellulose mỏng, màu trắng. Sang ngày thứ 3 tốc độ tạo cellulose tăng lên đáng kể khi bề mặt bình lên men cĩ một lớp màng cellulose khá dày. Tuy nhiên, lượng cellulose tạo ra sau 3 ngày lên men vẫn rất ít nên chưa thể xác định được khối lượng. Lượng cellulose tăng nhanh từ ngày lên men thứ tư đến ngày thứ sáu. Đây là thời gian vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose mạnh nhất sau khi đã thích nghi với mơi trường và số lượng tế bào đã đủ lớn. Lượng cellulose thu được tăng lên từ 4,9 ± 0,3 gl-1 lên 7,4 ± 0,3 gl-1. Sang ngày thứ sáu thì tốc độ tăng lên của cellulose được sinh tổng hợp ra đã giảm dần, sự chênh lệch là 0,6 gl-1/ngày thay vì 1,19 gl-1/ngày như sự chênh lệch giữa ngày thứ tư và ngày thứ năm. Đến ngày thứ bảy thì lượng cellulose thu được hầu như khơng tăng hơn so với ngày lên men thứ sáu, đạt 7,5 ± 0,4 gl-1. Sự tăng lên này là khơng đáng kể. (P = 0,21 > 0,05).
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7
Mặt khác, trong quá trình lên men, pH của dịch lên men giảm dần từ pH ban đầu là 5 tới pH sau ngày thứ bảy là 3,52. Kết quả cho thấy, song song với sự tổng hợp cellulose, lượng cellulose càng tăng lên thì pH của dịch lên men giảm. Sự giảm pH này cĩ nguyên nhân được xác định rằng trong quá trình sinh trưởng và phát triển, A. xylinum đã sử dụng
đường để tạo ra acid gluconic (Tahara et al., 1997). Tuy nhiên, đến ngày thứ 6 thì pH bắt đầu trở nên ổn định, ít thay đổi. Q trình chuyển hố đường thành acid gluconic đã giảm. Cũng khảo sát biến động của pH trong quá trình tổng hợp cellulose, trong nghiên cứu của mình, Vandame et al. (1998) thấy rằng, pH dịch lên men giảm rõ rệt vào ngày thứ tư và thứ năm của q trình lên men, đĩ cũng là khoảng thời gian cellulose được vi khuẩn tổng hợp mạnh nhất. Khảo sát sự chuyển hố của đường, Vandame et al. (1998) thấy rằng A.
xylinum sử dụng gần 50% lượng glucose trong mơi trường chỉ sau ngày lên men thứ hai, và
phần lớn lượng glucose này được chuyển hố thành gluconate và acid gluconic. Bên cạnh đĩ, Hai-Peng et al. (2002) nghiên cứu trên chủng A. xylinum sucrofermentans BPR2001
cũng cho thấy, sau giai đoạn thích nghi, glucose được chuyển thành acid gluconic rất mạnh và pH dịch lên men giảm rõ rệt. Mặt khác, sự oxy hĩa glucose, acid gluconic được tạo ra và giải phĩng ra trong mơi trường ni cấy. Nếu q trình này xảy ra mạnh sẽ là nguyên nhân làm cho pH mơi trường giảm từ 1 tới 3 đơn vị trong q trình ni cấy, và kiềm chế sự tạo thành cellulose (Krystynowicz et al., 2002). Do đĩ, khi pH ổn định cũng cĩ thể là dấu hiệu kết thúc quá trình lên men.
Kết quả cho thấy, tuy trọng lượng cellulose thu được sau 7 ngày lên men là cao nhất nhưng so với ngày thứ sáu thì sự chênh lệch đĩ khơng đáng kể (P > 0,05). Do đĩ, để rút ngắn thời gian lên men, chọn thời gian kết thúc lên men thống nhất cho các thí nghiệm tiếp theo là sau 6 ngày lên men.