CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM
NỘI DUNG THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm 1: Khảo sát q trình phát triển của chủng vi khuẩn A. xylinum
trên mơi trường HS.
Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến quá trình sinh tổng
hợp cellulose của A. xylinum.
Thí nghiệm 6: Tối ưu hĩa mơi trường bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum
trên mơi trường HS.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose trên
mơi trường HS.
Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp
2.5.1 Khảo sát quá trình nhân giống.
Chủng A. xylinum từ ống nghiệm thạch nghiêng được bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị mơi trường HS vào các hộp Petri. Cấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng lên các hộp Petri đĩ nhằm phân lập, đảm bảo nguồn giống đưa vào sử dụng được phát triển từ một khuẩn lạc. Sau khoảng 30 ngày tiến hành phân lập lại một lần nhằm đảm bảo giống cĩ hoạt tính sinh học cao nhất.
Sau 2 ngày, các khuẩn lạc đã phát triển trên hộp Petri thành từng khuẩn lạc riêng rẽ. Từ một khuẩn lạc đĩ, cấy lên các ống nghiệm chứa 10 ml mơi trường nhân giống cấp 1, nuơi cấy trong tủ ấm tại nhiệt độ 280C, thời gian 3 ngày. Sau thời gian 3 ngày, lọc dịch nhân giống trong điều kiện vơ trùng để tách các sợi cellulose, thu dịch giống cấp 1 . Sau đĩ dùng dịch giống đĩ tiến hành nhân giống cấp 2.
Chuẩn bị 90 ml mơi trường HS đã tiệt trùng vào erlen 250 ml, cho 10 ml dịch giống cấp 1 vào, lắc đều và để ở nhiệt độ 280C, khơng khuấy đảo. Tiến hành xác định mật độ tế bào ngay sau khi bắt đầu nhân giống cấp 2 và sau mỗi khoảng thời gian 24 giờ.
Mục đích của thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng phát triển của chủng A. xylinum
hiện cĩ trong điều kiện mơi trường hố học, từ đĩ chọn thời gian lên men cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.5.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose.
Nuơi cấy thu nhận cellulose từ với chủng vi khuẩn đã được nhân giống cấp 2, xây dựng thí nghiệm như sau:
Cho 10ml dịch giống cấp 2 vào erlen 250 ml chứa 90 ml mơi trường HS đã thanh trùng ở nhiệt độ 1000C, thời gian 20 phút. Sau khi cấy giống, để ở nhiệt độ 280C, khơng lắc đảo. Đến ngày thứ 5 thì bắt đầu thu cellulose, khảo sát khối lượng cellulose thu được tại các ngày thứ 4, thứ 5, thứ 6, thứ 7.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Khối lượng cellulose thu được ở các ngày thứ 4, 5, 6, 7. - pH của mơi trường trong thời gian 4, 5, 6, 7 ngày.
2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum khuẩn A. xylinum
Nhằm đánh giá tác động của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của chủng A.
xylinum hiện tại, chúng tơi tiến hành nuơi cấy thu cellulose tại các giá trị pH ban đầu khác
nhau, từ đĩ rút ra khoảng pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulose của chủng vi khuẩn này. Phương pháp thí nghiệm như sau: ni cấy A. xylinum trên mơi trường cơ bản HS trong erlen 250 ml, tỉ lệ giống cấy là 10%, thay đổi pH ban đầu từ 3 đến 7, nuơi cấy ở nhiệt độ 280C. Sau khi kết thúc quá trình lên men, thu nhận cellulose và nhận xét ảnh hưởng của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của chủng vi khuẩn A. xylinum.
2.5.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum
Sau khi đã xác định được thời gian nhân giống cho chủng vi khuẩn A. xylinum, thực hiện khảo sát tác động độc lập của nguồn carbon và nitơ đến hiệu suất sinh tổng hợp cellulose. Đây là thí nghiệm nhằm chọn lựa nguồn carbon và nitơ tốt nhất cho chủng A.
xylinum hiện tại.
Dịch giống sau khi nhân giống cấp 2 sẽ được lên men trong các mơi trường được chuẩn bị với các thành phần như mơi trường HS nhưng nguồn carbon và nguồn nitơ được thay đổi, các thành phần khác của mơi trường được giữ nguyên. Cụ thể, nguồn carbon được thay đổi giữa các chất sau: mannitol, glucose, fructose, sucrose. Nguồn nitơ được sử dụng gồm: cao nấm men, cao thịt, peptone, tryptone, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4. Sau khi thu nhận cellulose, so sánh kết quả, đánh giá hiệu suất của các nguồn cơ chất trên đối với khả năng sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum.
2.5.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum
Sau khi đã xác định được nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp nhất làm thành phần cho mơi trường cho chủng A. xylinum này tổng hợp cellulose, chúng tơi khảo sát ảnh
hưởng đồng thời của hai nguồn cơ chất carbon và nitơ lên khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum.
Nguồn carbon thích hợp nhất và nguồn nitơ thích hợp nhất theo kết quả của thí nghiệm trên sẽ được khảo sát tại nhiều hàm lượng khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận cellulose tại các hàm lượng đĩ, từ các số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy, rút ra hàm lượng nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho A. xylinum tổng hợp cellulose.
Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần mơi trường lên men. Thiết kế thí nghiệm như bảng 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ
TN Biến y y* x1 x2 1 -1 0 2 -1 +1 3 0 -1 4 0 +1 5 +1 0 6 +1 +1 7 -1 -1 8 +1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0
Trong đĩ, y là hàm lượng cellulose trung bình thực tế thu được trong các thí nghiệm, y* là hàm lượng cellulose thu được theo phương trình hồi quy trong các thí nghiệm, x1 là yếu tố ảnh hưởng thứ nhất (nguồn carbon), x2 là yếu tố ảnh hưởng thứ hai (nguồn nitơ).
Các biến độc lập sẽ được tiến hành thu số liệu ở 3 giá trị nồng độ: mức trên (+) và mức dưới (-) và mức trung bình (0).
Đối với nguồn nitơ:
- Nếu peptone được sử dụng làm nguồn nitơ thì hàm lượng được cho ở mức 8 gl-1. - Nếu peptone và cao nấm men cùng được sử dụng làm nguồn nitơ thì chọn tổng hàm lượng là 8 gl-1 với tỉ lệ 1:1
Bảng 3.2: Bảng mã hố các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát
Kí hiệu Nguồn carbon x1 (gl-1) Nguồn nitơ x2 (gl-1) 0 25 8 -1 20 6 +1 30 10 2.6 Các phương pháp phân tích. 2.6.1 Số lượng vi khuẩn
Số vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Dịch
lên men được pha lỗng với 0,1% peptone (pH 5). Cho 0,1 ml dịch lên men đã pha lỗng lên đĩa chứa mơi trường agar HS, nuơi cấy ở 280C. Số khuẩn lạc được xác định sau 3 ngày nuơi cấy (Koula et al., 1997).
2.6.2 Hàm lượng cellulose
Cellulose ướt thu được từ bình lên men được rửa với nước cất để loại bỏ các thành phần mơi trường cịn sĩt lại. Sau đĩ, khối cellulose ướt được xử lý với dung dịch NaOH
0,5M ở 90oC trong thời gian 1 giờ để loại bỏ hồn tồn các tế bào vi khuẩn cịn sĩt. Sau đĩ, khối cellulose được rửa lại bằng nước cất đến khi pH dung dịch nước rửa về trung tính. Sấy cellulose sạch thu được ở 1050C đến khi khối lượng khơng đổi. Cân xác định khối lượng của cellulose thu được (Son et al., 2001).
2.6.3 Phân tích thống kê
Số liệu nghiên cứu được biểu diễn bằng trung bình kết quả của 3 lần lặp lại với sai số tương đối. Sự khác nhau của các giá trị riêng lẻ được kiểm định bằng t – test bằng phần mềm R cho Windows® với mức ý nghĩa 5% (P < 0,05).
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN LUẬN
3.1 Khảo sát quá trình nhân giống vi khuẩn A. xylinum
Nhân giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy cấp 1 là 10%, trong mơi trường cơ bản HS trong bình erlen 250 ml chứa 90 ml mơi trường, nhiệt độ nuơi cấy 280C, thời gian 7 ngày. Mật độ tế bào vi khuẩn A. xylinum được xác định ngay từ khi bắt đầu tính thời gian nhân giống.
Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn A. xylinum đang sử dụng trong thí nghiệm này thu được như sau.
Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum
Thời gian 24 giờ đầu của quá trình nhân giống, dưới đáy erlen bắt đầu xuất hiện những sợi nhỏ, mỏng, lơ lửng, đĩ là những dải sợi cellulose đầu tiên do A. xylinum tạo ra trong mơi trường, sau đĩ các dải cellulose này sẽ chồng chập, xoắn lại với nhau, bắt đầu tạo thành lớp màng cellulose mỏng, màu trắng đục trên bề mặt mơi trường sau ngày thứ ba, thứ tư của quá trình nhân giống.
Thời gian tổng hợp cellulose và khả năng tổng hợp cellulose cĩ liên quan đến số lượng tế bào vi khuẩn A. xylinum. Mật độ tế bào ban đầu được xác định ngay khi dịch giống được lắc đều trong bình nhân giống (7,39 ± 0,05 log cfu ml-1) và tại các thời điểm xác định sau mỗi 24 giờ. Mật độ này liên tục tăng lên trong quá trình nhân giống, đạt số lượng 8,73 ± 0,06 (log cfu ml-1) sau 96 giờ phát triển.
Mật độ tế bào tăng nhanh trong 24 giờ đầu của quá trình ni cấy, tương ứng với thời gian tế bào đang ở pha thích nghi. Đến giai đoạn pha sinh trưởng thì mật độ tế bào bắt đầu tăng chậm lại, sự tăng chậm lại này diễn ra vào khoảng thời gian từ 24 giờ đến 96 giờ nhân giống. Mật độ tế bào đạt số lượng lớn nhất tại 96 giờ, sau đĩ giữ ổn định ở pha cân bằng rồi giảm dần khi vào pha suy vong. Từ đường cong sinh trưởng, ta sử dụng dịch giống sau 96h nhân giống để tiến hành lên men thu cellulose là tốt nhất.
Vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy, trên mơi trường hố học, chủng A. xylinum này cũng cĩ khả năng phát triển tốt như trên mơi trường tự nhiên với thành phần chính là nước dừa.
3.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose.
Sau khi xác định được thời gian nhân giống thích hợp, cần xác định thời gian kết thúc quá trình lên men cho các thí nghiệm sao cho phù hợp. Do đĩ, chúng tơi thực hiện khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum nhằm chọn thời điểm kết thúc q trình lên men một cách thích hợp nhất.
Sử dụng dịch giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy là 10% để nuơi cấy thu nhận cellulose trên mơi trường cơ bản HS trong bình erlen 250 ml chứa 100 ml dịch lên men, nhiệt độ nuơi cấy là 280C. Trong quá trình nuơi cấy, khảo sát hàm lượng cellulose được được tổng hợp trong các khoảng thời gian khác nhau, đồng thời xác định pH của dịch lên men.
Kết quả thu được cho thấy, trong suốt quá trình lên men, A. xylinum liên tục tổng hợp cellulose, tương ứng với quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
Ở ngày đầu tiên, do vừa chuyển từ mơi trường nhân giống sang mơi trường lên men nên cĩ sự thay đổi đột ngột về mơi trường, số lượng tế bào trong mơi trường chưa đủ
lớn nên sự tạo thành cellulose hầu như chưa cĩ. Sau 2 ngày xuất hiện những sợi cellulose mảnh lơ lửng trong mơi trường và trên bề mặt bắt đầu xuất hiện một lớp màng cellulose mỏng, màu trắng. Sang ngày thứ 3 tốc độ tạo cellulose tăng lên đáng kể khi bề mặt bình lên men cĩ một lớp màng cellulose khá dày. Tuy nhiên, lượng cellulose tạo ra sau 3 ngày lên men vẫn rất ít nên chưa thể xác định được khối lượng. Lượng cellulose tăng nhanh từ ngày lên men thứ tư đến ngày thứ sáu. Đây là thời gian vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose mạnh nhất sau khi đã thích nghi với mơi trường và số lượng tế bào đã đủ lớn. Lượng cellulose thu được tăng lên từ 4,9 ± 0,3 gl-1 lên 7,4 ± 0,3 gl-1. Sang ngày thứ sáu thì tốc độ tăng lên của cellulose được sinh tổng hợp ra đã giảm dần, sự chênh lệch là 0,6 gl-1/ngày thay vì 1,19 gl-1/ngày như sự chênh lệch giữa ngày thứ tư và ngày thứ năm. Đến ngày thứ bảy thì lượng cellulose thu được hầu như khơng tăng hơn so với ngày lên men thứ sáu, đạt 7,5 ± 0,4 gl-1. Sự tăng lên này là khơng đáng kể. (P = 0,21 > 0,05).
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7
Mặt khác, trong quá trình lên men, pH của dịch lên men giảm dần từ pH ban đầu là 5 tới pH sau ngày thứ bảy là 3,52. Kết quả cho thấy, song song với sự tổng hợp cellulose, lượng cellulose càng tăng lên thì pH của dịch lên men giảm. Sự giảm pH này cĩ nguyên nhân được xác định rằng trong quá trình sinh trưởng và phát triển, A. xylinum đã sử dụng
đường để tạo ra acid gluconic (Tahara et al., 1997). Tuy nhiên, đến ngày thứ 6 thì pH bắt đầu trở nên ổn định, ít thay đổi. Q trình chuyển hố đường thành acid gluconic đã giảm. Cũng khảo sát biến động của pH trong quá trình tổng hợp cellulose, trong nghiên cứu của mình, Vandame et al. (1998) thấy rằng, pH dịch lên men giảm rõ rệt vào ngày thứ tư và thứ năm của q trình lên men, đĩ cũng là khoảng thời gian cellulose được vi khuẩn tổng hợp mạnh nhất. Khảo sát sự chuyển hố của đường, Vandame et al. (1998) thấy rằng A.
xylinum sử dụng gần 50% lượng glucose trong mơi trường chỉ sau ngày lên men thứ hai, và
phần lớn lượng glucose này được chuyển hố thành gluconate và acid gluconic. Bên cạnh đĩ, Hai-Peng et al. (2002) nghiên cứu trên chủng A. xylinum sucrofermentans BPR2001
cũng cho thấy, sau giai đoạn thích nghi, glucose được chuyển thành acid gluconic rất mạnh và pH dịch lên men giảm rõ rệt. Mặt khác, sự oxy hĩa glucose, acid gluconic được tạo ra và giải phĩng ra trong mơi trường ni cấy. Nếu q trình này xảy ra mạnh sẽ là nguyên nhân làm cho pH mơi trường giảm từ 1 tới 3 đơn vị trong q trình ni cấy, và kiềm chế sự tạo thành cellulose (Krystynowicz et al., 2002). Do đĩ, khi pH ổn định cũng cĩ thể là dấu hiệu kết thúc quá trình lên men.
Kết quả cho thấy, tuy trọng lượng cellulose thu được sau 7 ngày lên men là cao nhất nhưng so với ngày thứ sáu thì sự chênh lệch đĩ khơng đáng kể (P > 0,05). Do đĩ, để rút ngắn thời gian lên men, chọn thời gian kết thúc lên men thống nhất cho các thí nghiệm tiếp theo là sau 6 ngày lên men.
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum cellulose của vi khuẩn A. xylinum
Tiến hành lên men thu nhận cellulose khi nuơi cấy vi khuẩn A. xylinum trên mơi
trường HS như thí nghiệm trên tại các điểm pH ban đầu khác nhau. Các giá trị pH được khảo sát là 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 và 7. Khảo sát hàm lượng cellulose thu được, đánh giá ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo cellulose của vi khuẩn. Từ đĩ chọn pH tốt nhất cho mơi trường lên men.
Kết quả thu được cho thấy, tại các giá trị pH khác nhau lượng cellulose thu được là khác nhau, điều này chứng tỏ pH là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose của A. xylinum.
Khoảng pH cho chủng A. xylinum trong thí nghiệm này là khoảng từ 4 – 5,5, lượng cellulose thu được ~5,1 gl-1. Lượng cellulose tạo ra tại các giá trị pH khác nhau trong khoảng trên thì sự khác biệt khơng rõ ràng (P > 0,05). Ngồi khoảng pH trên thì khả năng tổng hợp cellulose của A. xylinum giảm chỉ đạt từ 3,5 gl-1 đến 4,6 gl-1.
Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, xem hình 4.3
Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum
Song song với quá trình tổng hợp cellulose, A. xylinum cịn tổng hợp cả cellulase. Khi cellulase được tạo ra nhiều thì khả năng polymer hĩa tạo cellulose của vi khuẩn giảm,