CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.7. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học
2.3.7.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase
Axit uric là sản phẩm cuối của q trình chuyển hóa purin trong cơ thể. Đây là một axit yếu, nên thường được ion hóa thành muối urat hịa tan trong huyết tương và dịch ngoại bào. Việc sản xuất axit uric được xúc tác bởi enzyme xanthine oxidase (XO) ở gan, nó đóng vai trị quan trọng trong q trình oxy hố hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá xanthine thành axit uric. Dựa vào mối liên quan mật thiết giữa nồng độ axit uric máu và enzym XO đối với bệnh gút, nên ức chế enzym XO là một trong những cơ chế chính mà các thuốc phòng và điều trị gút đang hướng tới.
Nguyên lý
Xanthin oxidase (XO) xúc tác cho q trình oxy hóa xanthin thành axit uric:
Phương pháp đánh giá tác dụng ̣ức chế xanthin oxidase được triển khai theo phương pháp của Noro trên đĩa 96 giếng và được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm
Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm có: Hỗn hợp phản ứng ban đầu gồm 200 µL chứa XO 0,0125 U và các nồng độ khác nhau của chất thử, được ủ ở nhiệt độ phịng (25ºC) trong 30 phút. Sau đó, phản ứng được bổ sung 100 µL xanthine 0,5 mM và được tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Dừng phản ứng bằng HCl 1N. Hỗn hợp phản ứng sau cùng được đo độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 290 nm. Allopurinol được dùng là chất tham chiếu. Phép thử được lặp lại 3 lần.
Axit uric tạo thành sau phản ứng được đánh giá thông qua đo độ hấp thụ quang (OD). Sự giảm gía trị OD ở giếng có mẫu thử so với giếng đối chứng phản ánh mức độ ức chế hoat động của enzym XO.
Đánh giá kết quả: Tính I (% ức chế) theo công thức: I (%) = (∆ODc - ∆ODt)/ ∆ODc x 100
trong đó: ∆ODc = ODchứng – ODtrắng; ∆ODt = ODthử - ODtrắng
Giá trị phần trăm ức chế được biểu diễn dưới dạng trị số trung bình. Giá trị IC50 của mẫu thử được tính tốn bằng phương pháp hồi quy sử dụng phần mềm Microsoft Excel Table curve dựa vào mối quan hệ giữa phần trăm ức chế và nồng độ thử nghiệm.