CPi: Đoạn CPi (0,294 kb) khuếch đại từ
Hình 3.8. Sơ đồ vị trí gắn đoạn CPi - SMV trong vactor pENTRTM/D-TOPO và vị trí gắn cặp mồi M13-F / M13-R
Vector tái tổ hợp pEN-CPi - SMV được biến nạp và nhân dịng trong
E.coli. kiểm tra sự có mặt của CPi -SMV trong vector pENTRTM/D-TOPO bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi M13-F/M13-R. Theo tính tốn thì sản phẩm colony-PCR với cặp mồi M13-F/M13-R sẽ thu được đoạn DNA có 354bp (attL1&attL2) + 294 (CPi – SMV) = 648 bp. Kết quả điện di cho thấy, có một băng DNA ~ 0,65kb, đúng bằng kích thước của đoạn (attL1&attL2) và đoạn (CPi – SMV) như đã dự tính (Hình 3.9).
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với căêp mồi M13-F / M13-R
Kết quả tách plasmid (Hình 3.10A) và kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ plasmid bằng cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri (Hình 3.10B) cho thấy đoạn CPi-SMV có kích thước ~ 0,29kb đã được gắn vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi-SMV.
Như vậy, vector tái tổ hợp pEN-CPi- SMV đã được tạo ra và nhân dịng thành cơng trong tế bào vi khuẩn E.coli One Shot®.
A B 1 2 3 4 M 1 2 3 4 ∼ 29 bp M: thang DNA 1kb; 1: Dịng khuẩn lạc khơng được biến nạp; 2, 3, 4, 5: Các dịng khuẩn lạc được biến nạp
Hình 3.10. A: Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ hợp pEN- CPi-SMV; B: Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi – SMV từ pEN-CPi-SMV bằng cặp mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri
(M; Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3, 4: Dòng plasmid tái tổ hợp)
3.2.1.3. Kết quả tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi-SMV
Vector chuyển gen mang cấu trúc CPi –SMV (pK7GW-CPi-SMV) được tạo thành do tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi- SMV với vector nhận pK7GWIWG2(II), bằng phản ứng LR. Vector pK7GW-CPi-SMV được biến nạp vào tế bào E.coli One Shot và chọn dòng, sử dụng kỹ thuật PCR nhân bản đoạn gen CPi-SMV trực tiếp từ 3 dòng khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV- CP-Fi/SMV-CP-Ri để xác định sự có mặt của đoạn gen CPi-SMV trong vector pK7GWIWG2(II) và kết quả thu được băng điện di DNA có kích thước ~ 0,29kb, đúng bằng kích thước của đoạn CPi-SMV (Hình 3.11A). Cùng với kết quả tách plasmid pK7GW-CPi-SMV từ những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR (Hình 3.11B) đã khẳng định kết quả dịng hóa thành cơng vector pK7GW-CPi-SMV trong vi khuẩn E.coli One Shot.
A B
Hình 3.11. A: Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi – SMV từ pK7GW-CPi-SMV bằng cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri ()
Sau khi tách chiết được plasmid tái tổ hợp, tiếp tục kiểm tra plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi-SMV bằng cách sử dụng enzyme giới hạn Xba I và Hind III để cắt plasmid tái tổ hợp, kết quả điện di thu được sản phẩm cắt gồm 3 đoạn DNA tương ứng với kích thước khoảng 8,1kb, 3,1kb và 0,85kb (Hình 3.12). Như vậy vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi-SMV (pK7GW-CPi- SMV) đã được thiết kế thành công.
Người thực hiện: NCS. Nguyễn Văn Tiếp GVHD: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
1 2 3
∼ 0,29kb 0,2 kb0,3kb
M 1 2 3
(A)M; thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2, 3: Các dòng khuẩn lạc
phân tích
(B): Kết quả điện di kiểm tra
kết quả tách plasmid pK7GW-CPi-SMV
1, 2, 3: Các dòng plasmid
Giếng 1-2-3-4: pK7GW-CPi (SMV-BYMV) cắt
bằng XbaI và Hind III thu được 3 đoạn DNA, trong đó có đoạn với kích thước 0,85kb;