Đoạn CPi khuếch đại từ đoạn CPi (SMV-BYMV)
Sản phẩm PCR nhân bản đoạn CPi (SMV-BYMV) được làm sạch và gắn vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn CPi [pEN-CPi (SMV-BYMV)].
Vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) được đưa vào vi khuẩn
E.coli. Sự có mặt của CPi (SMV-BYMV) được kiểm tra bằng phản ứng
colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV- CPi-R và M13-F/M13-R.
Hình 3.16. Sơ đồ ghép nối và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) trong vector pEN-CPi (SMV-BYMV)
A: Sơ đồ ghép nối đoạn CPi (SMV-BYMV) vào vector pENTRTM/D-TOPO; B: Hình ảnhđiện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) (1, 2: Đoạn CPi khuếch điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) (1, 2: Đoạn CPi khuếch
đại với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R; 3: đoạn CPi + attL1, attL2 với cặp mồi M13- F/M13-R; M: thang DNA 1kb)
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR (hình 3.16) cho thấy, với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R có một băng DNA có kích thước ~ 0,5kb, tương ứng với CPi (SMV-BYMV); với cặp mồi M13-F/M13-R thì thu được đoạn DNA có kích thước ~ 0,9kb, phù hợp với tính tốn lý thuyết gồm có (attL1&attL2) + CPi (SMV-BYMV).
Để khẳng định chắc chắn đoạn CPi (SMV-BYMV) đã được gắn vào vector nhân dịng pENTRTM/D-TOPO, chúng tơi tiến hành tách plasmid và xác định lại trình tự đoạn gen CPi trong plasmid tái tổ hợp pEN-CPi (SMV- BYMV). Kết quả tách plasmid cho thấy plasmid đảm bảo chất lượng và số lượng cần thiết cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả PCR kiểm tra đoạn gen
CPi trong vector pENTR tái tổ hợp cũng thu được kết quả như tính tốn, xuất hiện băng DNA với kích thước khoảng 0,5kb.
3.2.2.3. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi (SMV-BYMV)
Plasmid pEN-CPi (SMV-BYMV) tham gia phản ứng LR với vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) do hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM II làm xúc tác tạo vector chuyển gen nhị thể mang cấu trúc RNAi chứa đoạn CPi (SMV- BYMV). Kết quả tạo được vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) (Hình 3.17)
Hình 3.17. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV)
P35S: Promoter CaMV35S; attB1 và attB2: các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR; LB: left T-DNA border; RB: right T-DNA border; T35S: terminator 35S; Kan: gen kháng
kanamycin; CmR: gen kháng chloramphenicol; CPi: vị trí đoạn CPi chèn vào; vị trí cắt giới hạn của các enzyme tương ứng; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám mồi tương ứng
Vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) được dịng hóa và chọn dịng bằng phản ứng colony-PCR. Kết quả đã thu được các dịng khuẩn lạc dương tính với PCR. Cấu trúc này sẽ tạo ra dạng kẹp tóc RNA sau khi được chuyển vào cây trồng và sẽ khởi sự cơ chế RNAi để kháng lại các RNA của virus có trình tự tương đồng.
Những dòng được chọn được sử dụng để tách chiết plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi (SMV-BYMV), sau đó kiểm tra bằng enzyme giới hạn Xba I và
Hind III và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt được trình bày ở hình 3.18.
∼ 1,4kb ∼1,1kb 2,0kb 1,0kb M 1 2 3 3,0kb