KNV Thử mSIL (g) mplacebo (g) αĐL ± SD(*) (%) RSD(*) (%) mthu hồi (g) % thu hồi (%) Trung bình KNV1 1 0,1281 0,3743 25,24 ± 0,19 0,74 0,1268 100,5 TB = 100,6 % RSD = 0,7 % 2 0,1284 0,3733 25,45 ± 0,28 1,12 0,1277 101,0 3 0,1280 0,3740 25,49 ± 0,25 0,99 0,1280 101,5 4 0,1270 0,3751 24,82 ± 0,08 0,30 0,1246 99,7 5 0,1289 0,3736 25,20 ± 0,43 1,73 0,1266 99,8 6 0,1273 0,3740 25,22 ± 0,11 0,45 0,1264 100,9 KNV2 1 0,1295 0,3721 25,82 ± 0,20 0,76 0,1295 101,6 TB = 100,3 % RSD = 0,7 % 2 0,1276 0,3751 24,97 ± 0,47 1,89 0,1255 99,9 3 0,1283 0,3771 25,00 ± 0,18 0,73 0,1264 100,0 4 0,1286 0,3760 25,04 ± 0,07 0,26 0,1264 99,8 5 0,1280 0,3734 25,18 ± 0,13 0,52 0,1263 100,2 6 0,1280 0,3705 25,39 ± 0,48 1,89 0,1266 100,4 TB (n=12) = 100,4 % RSD (n=12) = 0,7 % (
3.5.5.2. Độ chính xác trung gian MIR 939,7 cm-1
Bảng 3.12. Kết quả độ chính xác trung gian bằng phương pháp đo hồng ngoại giữa normalize tại điểm 939,7 cm-1
KNV Thử mSIL (g) mplacebo (g) αĐL ± SD( *) (%) RSD(*) (%) mthu hồi (g) % thu hồi (%) Trung bình KNV1 1 0,1281 0,3743 25,17 ± 0,69 2,7 0,1265 100,3 TB = 98,7 % RSD = 2,5 % 2 0,1284 0,3733 25,12 ± 0,69 2,7 0,1260 99,7 3 0,1280 0,3740 24,59 ± 0,61 1,3 0,1234 97,9 4 0,1270 0,3751 25,49 ± 0,76 3,0 0,1280 102,4 5 0,1289 0,3736 24,23 ± 1,71 1,2 0,1218 95,9 6 0,1273 0,3740 24,08 ± 0,55 2,3 0,1207 96,3 KNV2 1 0,1295 0,3721 24,26 ± 0,84 3,46 0,1217 95,4 TB = 96,3 % RSD = 3,8 % 2 0,1276 0,3751 25,77 ± 0,63 2,45 0,1295 103,1 3 0,1283 0,3771 23,52 ± 0,87 3,71 0,1189 94,1 4 0,1286 0,3760 23,57 ± 1,13 4,82 0,1189 93,9 5 0,1280 0,3734 23,48 ± 0,98 4,17 0,1177 93,4 6 0,1280 0,3705 24,73 ± 1,47 5,96 0,1233 97,8 TB (n=12) = 97,5 % RSD (n=12) = 3,4 % (
*) Kết quả định lượng của 5 lần lấy mẫu khác nhau trong 1 viên
Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian bằng phương pháp đo hồng ngoại giữa normalize tại điểm 1357,7 cm-1 KNV Thử mSIL (g) mplacebo (g) αĐL ± SD(*) (%) RSD(*) (%) mthu hồi (g) % thu hồi (%) Trung bình KNV1 1 0,1281 0,3743 24,79 ± 1,35 5,4 0,1245 98,7 TB = 98,7 % RSD = 2,4 % 2 0,1284 0,3733 25,14 ± 0,77 3,1 0,1261 99,8 3 0,1280 0,3740 24,75 ± 1,47 5,9 0,1242 98,6 4 0,1270 0,3751 25,52 ± 0,68 2,7 0,1281 102,5 5 0,1289 0,3736 24,27 ± 1,12 4,7 0,1220 96,1 6 0,1273 0,3740 24,12 ± 0,50 2,1 0,1209 96,5 KNV2 1 0,1295 0,3721 24,23 ± 1,54 6,4 0,1215 95,3 TB = 97,0 % RSD = 4,2 % 2 0,1276 0,3751 25,67 ± 0,79 3,1 0,1290 102,7 3 0,1283 0,3771 23,43 ± 1,19 5,1 0,1184 93,7 4 0,1286 0,3760 23,93 ± 1,09 4,6 0,1208 95,4 5 0,1280 0,3734 23,51 ± 1,05 4,5 0,1179 93,5 6 0,1280 0,3705 25,69 ± 1,34 5,2 0,1281 101,6 TB (n=12) = 97,9 % RSD (n=12) = 3,3 %
(*) Kết quả định lượng của 5 lần lấy mẫu khác nhau trong 1 viên
3.5.5.4. Độ chính xác trung gian MIR 1697,6 cm-1
KNV Thử mSIL (g) mplacebo (g) αĐL ± SD(*) (%) RSD(*) (%) mthu hồi (g) % thu hồi (%) Trung bình KNV1 1 0,1281 0,3743 24,26 ± 1,42 5,86 0,1219 96,6 TB = 97,8 % RSD = 2,2 % 2 0,1284 0,3733 24,92 ± 0,50 1,99 0,1250 98,9 3 0,1280 0,3740 24,68 ± 1,68 6,81 0,1239 98,3 4 0,1270 0,3751 25,19 ± 0,48 1,92 0,1265 101,1 5 0,1289 0,3736 24,28 ± 1,07 4,41 0,1220 96,1 6 0,1273 0,3740 23,87 ± 1,05 4,39 0,1197 95,5 KNV2 1 0,1267 0,3721 23,86 ± 1,18 4,96 0,1197 93,9 TB = 94,3 % RSD = 5,2 % 2 0,1250 0,3751 25,52 ± 0,98 3,84 0,1283 102,1 3 0,1258 0,3771 22,77 ± 1,67 7,32 0,1151 91,1 4 0,1260 0,3760 22,55 ± 0,97 4,29 0,1138 89,9 5 0,1254 0,3734 22,74 ± 1,16 5,09 0,1140 90,5 6 0,1255 0,3705 24,82 ± 2,55 10,26 0,1237 98,2 TB (n=12) = 96,0 % RSD (n=12) = 4,2 %
3.6. Bàn luận
Hiện nay các phương pháp định lượng nhanh như quang phổ cận hồng ngoại, Raman hay NIR, MIR đã chứng minh được ưu thế định lượng nhanh, định lượng trực tiếp trên các nền mẫu thuốc đã biết. Các hãng sản xuất thiết bị đã thông tin rất nhiều về các ứng dụng này của các phương pháp quang phổ hiện đại nói trên. Tại Việt Nam, nhiều kết quả về định lượng nhanh bằng phương pháp quang phổ cận hồng ngoại đã được nhóm tác giả Đồn Cao Sơn, B i Văn Trung cơng bố từ trong năm 2015. Đặc biệt, trong đề tài Nghị định thư giữa Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Hội đồng Dược điển Hoa K (USP , đã có hơn 20 qui trình định lượng trực tiếp bằng quang phổ cận hồng ngoại đã được xây dựng và công bố cả trên thiết bị để bàn và cầm tay.
Trong đề tài này, từ những đặc trưng phổ của các chất và thuật toán Chemometrics đơn giản sử dụng xử lý dữ liệu, đề tài đã xây dựng được qui trình định lượng nhanh Sildenafil citrat trong mẫu tự tạo bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại.
* Đánh giá về kết quả xây dựng các phương pháp phân tích
+ Phương pháp quang phổ NIR đảm bảo được các yêu cầu của phương pháp định lượng thường qui.
+ Phương pháp quang phổ MIR-ATR cho độ lặp lại tại các vị trí lấy mẫu đo khác nhau của c ng một mẫu là chưa tốt, điều này dẫn đến kết quả thẩm định nội mơ hình, kết quả đánh giá độ tuyến tính là chưa đạt yêu cầu.
Các phương pháp định lượng được xây dựng trong đề tài khóa luận vừa cho thấy rằng là phương pháp có khả năng định lượng nhanh, có nhiều tiềm năng để ứng dụng trong thực tế. Tuy nhiên, vẫn c n một số nhược điểm của các phương pháp này cần phải khắc phục hoặc được sử dụng trong từng trường hợp cụ thể để phát huy thế mạnh của chúng.
* Ưu điểm của các phương pháp đã xây dựng
+ Phương pháp định lượng được xây dựng một lần, sau khi đã thẩm định đầy đủ thì có thể áp dụng để định lượng nhanh được thuốc trong sản xuất, lưu hành.
+ Để định lượng thì chỉ cần đo phổ trực tiếp mẫu thuốc rồi áp vào mơ hình để cho kết quả ln. Nhờ vậy, các phương pháp này có thể giúp định lượng trực tiếp và rất ít hoặc khơng phải chuẩn bị mẫu. Đối với các mẫu thuốc bột và viên nén, chỉ cần bóc viên ra là có thể định lượng được. Rõ ràng đây là các phương pháp phân tích nhanh, khơng sử dụng hóa chất, dung mơi, năng lượng v ng IR an toàn cho người sử
+ Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại có độ chính xác, độ tin cậy cao, đáp ứng đầy đủ được các tiêu chí của phương pháp định lượng thường qui theo yêu cầu của ICH, AOAC. Do đó ngồi việc ứng dụng để sàng lọc nhanh, hồn tồn có thể ứng dụng như một phương pháp phân tích chính xác thơng thường.
+ Phương pháp quang phổ MIR với kỹ thuật đo ATR cũng là phương pháp định lượng cho kết quả nhanh, tuy nhiên độ lặp lại, độ chính xác vẫn chưa đáp ứng được các yêu cầu cần thiết. Nên áp dụng để bán định lượng và sàng lọc sơ bộ chất lượng thuốc.
+ Với những đặc trưng phổ của cả dược chất và nền mẫu và độ đặc hiệu cao, phương pháp quang phổ MIR với kỹ thuật đo ATR có thể áp dụng để định tính, nhận dạng nhanh thuốc cần khảo sát, giúp phân biệt thuốc giả, thuốc nhái.
* Nhược điểm và của các phương pháp đã xây dựng một số giải pháp vận dụng
Khi định lượng bằng các mơ hình xây dựng trên nền mẫu đã biết sẽ gặp phải một số hạn chế như sau:
+ Thứ nhất, nền mẫu thường được cấu tạo bởi nhiều thành phần khác nhau, tín hiệu phổ nền mẫu chính là tín hiệu phổ của hỗn hợp nhiều thành phần. Trong quá trình sản xuất, lưu hành và bảo quản, nền mẫu có thể bị thay đổi không c n như lúc xây dựng công thức nữa. Nền mẫu gồm nhiều tá dược, nhưng một số tá dược khi đưa vào sản xuất chỉ có thể định tính được mà khơng định lượng được như tinh bột ngô, tinh bột sắn.... Các lô khác nhau của tá dược có thể dẫn đến hàm lượng tá dược khác nhau, nhất là các tá dược độn chiếm thành phần lớn trong công thức bào chế thì càng cần phải ổn định hàm lượng. Việc kiểm soát hàm lượng nguyên liệu đầu vào của nhiều thành phần như vậy là rất khó khăn, do đó việc ổn định nền mẫu, tín hiệu nền mẫu là khơng hề đơn giản. Điều này có thể làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng và làm giảm đi độ tin cậy của phương pháp.
+ Thứ hai, nền mẫu thuốc của các hãng sản xuất dược phẩm là khác nhau và là đặc trưng, bí quyết của mỗi hãng. Việc tiếp cận được chính xác các nền mẫu thuốc khơng phải là dễ dàng. Do đó, các cơ quan chức năng khó có thể áp dụng được phép định lượng này để đi kiểm soát nhanh chất lượng thuốc trên thị trường để sàng lọc thuốc giả, thuốc kém chất lượng.
Các vấn đề đã nêu là vấn đề chính của các phương pháp đang nghiên cứu. Việc có ổn định được nền mẫu, sự ảnh hưởng của nền mẫu lên kết quả phân tích đến đâu cần phải theo dõi trong q trình sản xuất ở nhiều lơ, m khác nhau.
Nếu áp dụng để định lượng, phương pháp quang phổ cận hồng ngoại sẽ được ưu tiên hơn phương pháp quang phổ hồng ngoại giữa với kỹ thuật đo ATR. Phương pháp MIR-ATR nên sử dụng để định tính, phát hiện thuốc giả, nếu sử dụng để định lượng, cần phải có những tiêu chí khắt khe hơn để kiểm sốt, ví dụ u cầu khi đo mẫu phải đo nhiều lần và lấy mẫu ở nhiều vị trí khác nhau, giá trị RSD của các lần đo mẫu phải giới hạn lại ph hợp nếu kết quả được chấp nhận.
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN
Đề tài đã xây dựng được các qui trình định lượng nhanh Sildenafil citrat trong viên nén tự tạo bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại ở hai v ng hồng ngoại giữa và cận hồng ngoại với hai kỹ thuật đo tương ứng là phản xạ toàn phần suy giảm và phản xạ toàn phần khuếch. Các phương pháp đã xây dựng được thẩm định theo các tiêu chí được tham khảo từ ICH và AOAC.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2018 , Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. 2. Đoàn Cao Sơn (2016 , Nghiên cứu một số phương pháp phân tích phát hiện nhanh
thuốc giả sử dụng các thiết bị phổ hiện đại (Phổ Raman, Phổ hồng ngoại gần chuyển dạng Fourier và phổ nhiễu xạ tia X-XRD). Viện Kiểm nghiệm thuốc TW,
Hà Nội.
3. Đoàn Cao Sơn, Thái Nguyễn H ng Thu, Trần Việt H ng, B i Văn Trung, Đặng
Thị Ngọc Lan, (2016 , “Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman và quang phổ
cận hồng ngoại trong kiểm nghiệm thuốc”. Nhà Xuất bản giáo dục, ISBN:978- 604-0-09595-4.
4. Đoàn Cao Sơn, Trần Việt H ng, B i Văn Trung, Nguyễn Ngọc Trung, Vũ Thị Bích (2014 , “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong phân tích, sàng lọc nhanh thuốc giả”. Hội nghị Quang học quang phổ toàn quốc lần thứ
VIII, ISSN 1859-4271, 191-198.
5. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2017 , Dược điển Việt Nam V. Nhà xuất bản Y
học, Hà Nội.
TIẾNG ANH
6. Alexandrino, G. L., Breitkreitz, M. C., & Poppi, R. J. (2016 , “Classical Least Squares Combined with Spectral Interval Selection Using Genetic Algorithm for Prediction of Constituents in Pharmaceutical Solid Dosage Forms from near Infrared Chemical Imaging Data”, Journal of Near Infrared Spectroscopy, 24(2), 157–169.
7. AOAC International, "Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements", AOAC Official method of analysis, 2016.
8. Awa, K., Shinzawa, H., & Ozaki, Y. (2014 , “Monitoring of Recrystallisation of Microcrystalline Cellulose inside Pharmaceutical Tablets during Storage Using near Infrared Diffuse Reflectance Spectroscopy”, Journal of Near Infrared Spectroscopy, 22(3), 205–210.
9. British Pharmacopoeia (2020), volume II, p.873 – 874.
10. Burmistrova, N.A., Soboleva, P.M., & Monakhova, Y.B. (2021 , “Is infrared spectroscopy combined with multivariate analysis a promising tool for heparin authentication”, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 194, 113811.
11. European Medicines Agency. “ASSESSMENT REPORT FOR Sildenafil
https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessmentreport/sildenafil-ratiopharm- epar-public-assessment-report_en.pdf?fbclid=IwAR2Ng9ZU2nD-
12. European medicines agency (1995), ICH guideline Q2(R1) Validation of analyticalprocedures: text and methodology.
13. European Medicines Agency, "Use of near infrared spectroscopy (NIRS) by the pharmaceutical industry and the data requirements for new submissions and variations", March 2014. [Online]. Available: https://www.ema.europa.eu/en/use- near-infrared-spectroscopy-nirs-pharmaceutical-industry-data-requirements-new- submissions#current-effective-version-section. [Accessed 16 August 2021]. 14. European Pharmacopoeia 9 (2020), page 3548, Sildenafil citrate
15. Guerrero, E.D., Mejías, R.C., Marín, R.N., Lovillo, M.P., & Barroso, C.G. (2010 , “A new FT-IR method combined with multivariate analysis for the classification of vinegars from different raw materials and production processes”, Journal of the
science of food and agriculture, 90(4), 712–718.
16. Igne, B., Hossain, M.N., Drennen, J.K., & Anderson, C.A. (2014 , “Robustness Considerations and Effects of Moisture Variations on near Infrared Method Performance for Solid Dosage Form Assay”, Journal of Near Infrared
Spectroscopy, 22(3), 179–188.
17. Le Dinh Chi, Tran Viet Hung, Bui Van Trung and Doan Cao Son (2018), Evaluation of the Ability to Apply Near-Infrared Spectroscopy on Direct Assay of Acyclovir in Tablets, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5, 841-849)
18. Lu Z, Cassidy BM, DeJong SA, Belliveau RG, Myrick ML, Morgan SL. (2017). “Attenuated Total Reflection (ATR Sampling in Infrared Spectroscopy of Heterogeneous Materials Requires Reproducible Pressure Control”, Appl Spectrosc, 71(1), 97-104.
19. Markopoulou, C.K., Koundourellis, J.E., Orkoula, M.G., & Kontoyannis, C.G. (2008 , “Quantitative nondestructive methods for the determination of ticlopidine in tablets using reflectance near-infrared and Fourier transform Raman spectroscopy”, Applied spectroscopy, 62(2), 251–257.
20. Prendergast, E., Abe, H., Aburada, M., & Otsuka, M. (2012 , “A Non-Destructive Method of Predicting the Particle Size of the Bulk Drug Powder in an Acetaminophen Suppository by Near-Infrared Spectroscopy”, Journal of Near
Infrared Spectroscopy, 20(2), 255–265.
21. The United States Pharmacopoeia 43 (2020), page 4039, NF Sildenafil citrat
22. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, "Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2(R1)," 2005.
23. Van Trung Bui, Cao Son Doan, Thi Thanh Vuong Tong, Dinh Chi Le (2021),
Development and Validation of a Simple, Green Infrared
Spectroscopic Method for Quantitation of Sildenafil Citrate in
Siloflam Tablets of Unknown Manufacturing Formula, Journal of Analytical Methods in Chemistry, Article ID 6616728
24. Yang, H., & Irudayaraj, J. (2002 , “Rapid determination of vitamin C by NIR,
MIR and FT-Raman techniques”, The Journal of pharmacy and
PHỤ LỤC PL - 1 Phổ hồng ngoại giữa của các mẫu thử, mẫu chuẩn, placebo.
Hình PL - 1. 3. Phổ hồng ngoại giữa viên nén mơ hình Sildenafil và placebo với hàm lượng Sildenafil 25 %
PL - 2 Phổ cận hồng ngoại của các mẫu chuẩn, placebo và mẫu thử.