Quy trình phân lập các hợp chất từ cao n-hexan- 123docz.net

3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất

Hợp chất TQH1

Dạng tinh thể hình kim khơng màu, tan trong chloroform, không tan trong methanol, không hấp thụ UV. Trên sắc ký bản mỏng, sau khi nhúng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% và hơ nóng trên bếp điện thấy hợp chất này có màu hồng tươi rồi xanh tím dần. Dựa vào các đặc trưng hóa lý kết hợp chấm sắc ký đối chứng (Hình 3.4), hợp chất TQH1 được xác định là β-sitosterol (Hình 3.6).

A B

Hình 3.4. Sắc ký đồ của hợp chất TQH1 và β-sitosterol (β-s)

Chú thích: TLC pha thường, quan sát ở ánh sáng thường sau khi nhúng dung dịch H2SO4

10% trong EtOH 96%.

A: Hệ dung môi n-hexan: aceton 9:1 (v/v) B: Hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat 6:1 (v/v)

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của β-sitosterol

Hợp chất TQH2

Dạng vơ định hình màu trắng, hiện màu từ tím hồng sang xanh tím với thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH 96% khi hơ nóng trên bếp điện. Dựa vào các đặc trưng vật lý và kết hợp với chấm sắc ký đối chứng (Hình 3.6) xác định hợp chất TQH2 là daucosterol

(Hình 3.7).

A B

Hình 3.6. Sắc ký đồ của hợp chất TQH2 và Daucosterol (Dc)

Chú thích: TLC pha thường, quan sát ở ánh sáng thường sau khi nhúng dung dịch H2SO4

10% trong EtOH 96%.

A: Hệ dung môi DCM: MeOH 9:1 (v/v) B: Hệ dung môi TEAF 3:2:2:2 (v/v/v/v)

Hợp chất TQH3

TQH3 thu được dưới dạng dầu màu nâu nhạt. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 1 nhóm aldehyd tại δH 9,40 (1H, s); 1 proton olefinic tại δH 6,65 (1H, dd, J = 4,8; 3,0 Hz); 1 proton oxymethin tại δH 4,05 (1H, m) và các proton methin và methylen nằm trong vùng trường cao (1,40 - 2,55 ppm). Phổ 13C-NMR và HSQC cũng cho thấy sự xuất hiện của 1 carbon nhóm aldehyd (δC 194,0); 2 carbon olefinic (δC 144,8 và 146,9); 1 carbon oxymethin (δC 68,3); 2 carbon methin (δC 37,2 và 42,8) và 4 carbon methylen (δC 24,7; 24,9; 31,1 và 32,2). Dữ liệu trên gợi ý rằng TQH3 có hai vịng và khung carbon của hợp chất này bao gồm một vòng sáu cạnh và một vòng năm cạnh tương tự như các hợp chất (±)-trans- 2,3,3a,7a-tetrahydro-1H-inden-4-carbaldehyd [18], 6,7-dihydroxy-indan-4-carbaldehyd [15] và 6-hydroxy-indan-4-carbaldehyd [15] đã được báo cáo từ Thảo quả. Phổ NOESY cho thấy tương tác giữa H-1 và H-6 gợi ý rằng hai proton ở cùng một phía và hai vịng hợp nhất cis với nhau. Sự tương tác giữa H-5 và H-6 cũng được quan sát thấy trên phổ NOESY. Ngoài ram tương tác giữa proton aldehyd và H-3 chỉ ra H-3 và nhóm chức andehyd ở cùng phía của liên kết đơi. Dựa trên các dữ liệu phổ thu được cho kết luận về cấu trúc của TQH3 được xác định là tsaokoin (Hình 3.8).

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của TQH3 và chất tham khảo

Vị trí TQH3 Tsaokoin δHa,b (ppm) δCa,c (ppm) δHa,d (ppm) δCa,e (ppm) 1 2,97 (1H, m) 37,2 2,98 (1H, m) 37,1 2 - 144,8 - 144,7 3 6,65 (1H, dd, 4,8; 3,0) 146,9 6,66 (1H, ddd, 5,6; 2,8; 1,2) 148,1 4 2,41 (1H, overlap) 2,52 (1H, m) 31,1 2,38 (1H, ddt, 18,8; 9,2; 2,8) 2,48 (1H, dddt, 18,8; 5,6; 5,0; 1,4) 30,3 5 4,05 (1H, m) 68,3 4,07 (1H, dt, 9,2, 5,0) 67,4 6 2,41 (1H, overlap) 42,8 2,42 (1H, m) 42,8 7 1,54 (1H, overlap) 1,78 (1H, m) 24,9 1,73 (1H, m) 1,54 (1H, m) 24,5 8 1,54 (2H, overlap) 24,7 1,50 (2H, m) 24,2 9 1,42 (1H, m) 2,11 (1H, m) 32,2 1,40 (1H, m) 2,02 (1H, m) 31,9 10 9,40 (1H, s) 194,0 9,41 (1H, s) 194,5 a) CDCl3, b) 600 MHz, c) 250 MHZ, d) 400 MHz, e) 125 MHz, overlap: tín hiệu bị chồng chập

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của Tsaokoin 3.2: Bàn luận 3.2: Bàn luận

3.2.1: Về định tính

Phương pháp định tính 13 nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu nhằm đánh giá sơ bộ các nhóm chất có thể có trong mẫu nghiên cứu. Từ đó có thể lựa chọn các phương pháp chiết xuất và phân lập phù hợp. Phương pháp này đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với nhiều mẫu nghiên cứu. Kết quả định tính cho thấy quả thảo quả có chứa 6 nhóm chất gồm chất béo, flavonoid, acid amin, đường khử tự do, polysarcharid và phytosterol

3.2.2. Về chiết xuất và phân lập

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dung mơi EtOH 70%. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm. EtOH là dung mơi chiết được nhiều nhóm hoạt chất, an tồn với mơi trường và giá thành rẻ. Dịch chiết thu được sạch, dễ tinh chế, chất lượng sản phẩm tốt. Cao chiết tổng sau đó được phân tán trong nước nóng và chiết thành các cao phân đoạn với các dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-Hexan, EtOAc để phân tách các hợp chất một cách thuận lợi.

3.2.3: Về xác định cấu trúc hợp chất phân lập

Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột thường quy, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm. Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để lựa chọn phân đoạn, thăm dị hệ dung mơi rửa giải, định tính các chất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá trình phân lập.

Với phương pháp sắc ký và hệ dung môi rửa giải phù hợp, kết quả là đã phân lập được 3 hợp chất là TQH1, TQH2, TQH3. Dựa vào dữ liệu phổ NMR và sử dụng sắc kí lớp mỏng đối chiếu với các chất chuẩn đã được công bố trước đây, đã xác định được cấu trúc của các chất trên lần lượt là β-sitosterol, Daucosterol và Tsaokoin. Một số loài thực vật khác cũng cho thấy sự xuất hiện của các hợp chất này với các tác dụng dược lý khác nhau đã được nghiên cứu.

Hợp chất β-sitosterol

β‐ Sitosterol là một hợp chất phổ biến trong tự nhiên. Hợp chất này được phân lập

từ nhiều loài thực vật như họ hoa mơi, họ đậu, họ gừng, họ cúc, họ cà...Có mặt trong nấm, tảo, động vật nguyên sinh.

Mặc dù cho đến nay β-sitosterol vẫn chưa được tổng hợp hồn tồn nhưng nó đã được sản xuất từ stigmasterol tinh khiết qua hai cách. Trong chu trình đầu tiên, chuỗi bên Δ22–23 anken được chọn lọc hydro hóa để tạo ra β-sitosterol cùng với các mức

stigmasterol đa dạng và stigmastanol bão hịa, trong khi q trình hydro hóa chọn lọc này kèm theo sự bảo vệ của Δ5–6 anken thành xyclopropylcarbinyl ete được sử dụng trong cách tiếp cận thứ hai. Quá trình này nên tiếp theo bằng cách hydro hóa liên kết đơi Δ22– 23 và đồng thời phân giải xiclopropan để tạo ra rượu C3 và Δ5–6 anken một lần nữa. Phương pháp thứ hai đường như rất hữu ích do đạt được β-sitosterol ở độ tinh khiết cao. Trên thực tế, bán tổng hợp của β-sitosterol vẫn cịn là một thách thức vì sản xuất bằng metyl ete khó loại bỏ.

Trên thực tế có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của β‐ sitosterol. Đầu tiên là nghiên cứu nhằm đánh giá tác động của β‐ sitosterol đối với các triệu chứng tiết niệu và các biện pháp lưu lượng ở nam giới bị tăng sản lành tính tuyến tiền liệt (BPH). Bằng chứng cho thấy β –sitosterol cải thiện các triệu chứng tiết niệu và các biện pháp lưu lượng. Hiệu quả lâu dài, độ an toàn và khả năng ngăn ngừa các biến chứng của β‐ sitosterol vẫn chưa được biết đến. [33]

Một nghiên cứu thử nghiệm đã được thực hiện để điều tra tác động của việc uống viên nang có chứa sterol thực vật và sterolins (hỗn hợp BSS:BSSG) đối với các thông số về miễn dịch của những người tình nguyện tham gia cuộc thi marathon ở Cape Town, Nam Phi. Những người chạy bộ đã được uống viên nang hoạt tính (n = 9) cho thấy ít bạch cầu trung tính, giảm bạch cầu so với những người chạy bộ đã dùng viên nang giả dược (n = 8), những người được điều trị bằng giả dược cho thấy sự gia tăng đáng kể trong tổng số lượng bạch cầu. Bên cạnh đó viên nang BSSG làm giảm nồng độ IL6 trong huyết tương ở những người chạy bộ (p = 0,08) và giảm đáng kể tỷ lệ cortisol, DHEAs (p = 0,03), cho thấy rằng những người tình nguyện này có ít phản ứng viêm hơn trong thời gian giai đoạn phục hồi sau marathon. Những phát hiện này chứng minh cho các nghiên cứu sâu hơn về việc sử dụng phytosterol để ngăn chặn các phản ứng viêm liên quan đến căng thẳng thể chất quá mức [8].

Một số thành phần của chế độ ăn dựa trên thực vật là β-sitosterol và taraxasterol,

hoạt động chống khối u và ngăn ngừa bằng hóa chất của chúng. Thực nghiệm chúng đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của ung thư ruột kết và ung thư vú. Chúng ức chế hiệu quả sự xâm lấn của các tế bào khối u và di căn. Liên quan đến độc tính, khơng có tác dụng phụ rõ ràng nào của phytosterol được quan sát thấy trong các nghiên cứu cho đến nay, ngoại trừ những người bị bệnh phytosterolemia. Điều tra sâu hơn để khám phá tiềm năng của chúng trong điều trị khối u có thể được chứng minh là đáng giá [28].

Hợp chất Daucosterol

Hợp chất Daucosterol là một hợp chất phổ biến được phân lập nhiều từ thực vật. Hàm lượng cao Daucosterol được chiết xuất từ thực vật, cụ thể là Archidendron clypearia thu hoạch ở Việt Nam, từ lá Parasenecio pseudotaimingasa ở Pakistan.

Sterol thực vật (phytosterol) đã được chấp nhận rộng rãi như một chất chống ung thư tự nhiên trong nhiều khối u ác tính. Nghiên cứu này được thiết kế để điều tra các chức năng của Daucosterol trong sự tiến triển của ung thư tuyến tiền liệt và các cơ chế phân tử có thể có của nó. Kết quả của chúng tơi cho thấy daucosterol ức chế sự tăng sinh tế bào và gây ra bắt giữ chu kỳ tế bào. Hơn nữa, điều trị bằng Daucosterol rõ ràng đã thúc đẩy quá trình apoptosis và autophagy. Kết hợp lại với nhau, phát hiện của chúng tôi đã chứng minh rằng Daucosterol ngăn chặn sự phát triển của ung thư tuyến tiền liệt ít nhất một phần thơng qua việc gây ra q trình chết tự động phụ thuộc vào hệ thần kinh thơng qua việc kích hoạt tín hiệu JNK, cung cấp một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho việc phát triển thuốc kháng u trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt [35].

Ngoài ra, Daucosterol ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư bằng cách gây ra hiện tượng autophagy thông qua cách thức phụ thuộc vào ROS và có thể được phát triển như một chất chống ung thư [26].

Một nghiên cứu khác chỉ ra tác động của Daucosterol đối với sự sống còn của tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy sau khi tế bào thần kinh bị thiếu oxy và glucose và tái tưới máu mô phỏng (OGD / R) 2, và xác định cơ chế phân tử tương ứng. Kết quả cho thấy sau điều trị Daucosterol làm giảm đáng kể sự mất tế bào thần kinh, cũng như tỷ lệ apoptotic và hoạt động của caspase-3, thể hiện hoạt động bảo vệ thần kinh. Chúng tôi cũng phát hiện ra rằng Daucosterol làm tăng mức độ biểu hiện của protein IGF1, làm giảm sự điều hịa của p-AKT 3 và p-GSK-3β 4, do đó kích hoạt đường dẫn tín hiệu AKT 5 . Ngồi ra, nó làm giảm sự điều hịa của các protein chống apoptotic Mcl-1 6 và Bcl-2 7 , đồng thời làm giảm mức độ biểu hiện của protein pro-apoptotic Bax 8 , do đó nâng cao tỷ lệ Bcl-2 / Bax. Tác dụng bảo vệ thần kinh của Daucosterol bị ức chế khi có mặt picropodophyllin (PPP) 9 ,chất ức

chế thụ thể yếu tố tăng trưởng I giống insulin (IGF1R) 10 . Nghiên cứu của chúng tôi đã cung cấp thông tin về Daucosterol như một chất bảo vệ thần kinh hiệu quả và rẻ tiền, góp phần vào hoạt động giống IGF1 của Daucosterol. Daucosterol có thể được phát triển như một loại thuốc điều trị đột quỵ do thiếu máu cục bộ [14].

Hợp chất Tsaokoin

Hợp chất Tsaokoin trước đây chủ yếu được phân lập từ quả của loài Amomum tsaoko Tsaokoin là hợp chất thuộc nhóm hợp chất Terpenoid.

Hiện nay có rất ít nghiên cứu về Tsaokoin kể cả về hóa học và tác dụng dược lý. Một nghiên cứu ít ỏi chỉ ra rằng chiết xuất methanolic của quả A.aromaticum (họ Zingiberaceae) làm giảm đáng kể sản xuất oxit nitric trong vi sinh vật BV2 mơ phỏng lipopolysaccharide. Hai nonan hai vịng mới có đặc điểm là 6,7-dihydroxy-indan-4- carbaldehyde (1) và 6-hydroxy-indan-4-carbaldehyde (2) đã được phân lập với mười một hợp chất đã biết 6,7-dihydroxy-3,7- axit dimethyloct-2-enoic (3), tsaokoin (4), isotsaokoin (5), 8-oxogeraniol (6), P-menth-5,6-diol (7), 3alpha-hydroxycarvotagenone (8) ,

tsaokoarylone (9), 1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -4,6-heptadien-3-on (10), (+) - hannokinol (11), MESO-hannokinol (12) và hannokinin (13), từ các quả của

A.aromaticum sử dụng phương pháp phân đoạn có hoạt tính sinh học chống viêm nhiễm

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận

Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả như sau: - Đã định tính được các nhóm chất bằng phản ứng hóa học đặc trưng, kết quả cho thấy trong quả của Thảo quả có chứa 5 nhóm chất gồm chất béo, flavonoid, acid amin, đường khử tự do và polysarcharid.

- Đã chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 3 hợp chất từ cao n-hexan của quả Thảo quả đó là: β-sitosterol (TQH1), daucosterol (TQH2) và tsaokoin (TQH3).

Đề xuất

Tiếp tục phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và nước của quả Thảo quả.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập Dược liệu, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

2. Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Đỗ Tất Lợi (2013), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Hồng Đức, Hà Nội.

4. Lê Đình Bích (2007), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.207-213.

5. Trần Hùng (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh.

6. Bộ mơn Dược liệu (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh.

7. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Tập 1 và 2.

Tiếng Anh

8. Bouic, P., et al. (1999), "The effects of B-sitosterol (BSS) and B-sitosterol glucoside (BSSG) mixture on selected immune parameters of marathon runners: inhibition of post marathon immune suppression and inflammation", International journal of sports

medicine, 20(04), pp. 258-262.

9. Cai, R., et al. (2021), "Chemistry and bioactivity of plants from the genus Amomum", J

Ethnopharmacol, 281, p. 114563.

10. Cui Qi et al (2017), "Rapid extraction of Amomum tsao-ko essential oil and determination of its chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities",

Journal of Chromatography B. 1061, pp. 364-371

11. Dong, H., Gou, Y. L., Cao, S. G., Chen, S. X., Sim, K. Y., Goh, S. H., & Kini, R. M. (1999). Eicosenones and methylated flavonols from

Amomumkoenigii. Phytochemistry, 50(5), 899-902.

12. He, X.-F., et al. (2020), "Amomutsaokols A–K, diarylheptanoids from Amomum tsao- ko and their α-glucosidase inhibitory activity", Phytochemistry, 177, p. 112418.

13. Hong, S.S., et al. (2021), "Monoterpenoids from the fruits of Amomum tsao-ko have inhibitory effects on nitric oxide production", 10(2), p. 257.

14. Jiang, L.-h., et al. (2015), "Daucosterol protects neurons against oxygen–glucose deprivation/reperfusion-mediated injury by activating IGF1 signaling pathway", The

15. Kamchonwongpaisan, S., Nilanonta, C., Tarnchompoo, B., Thebtaranonth, C.,

Thebtaranonth, Y., Yuthavong, Y., ... & Clardy, J. (1995). An antimalarial peroxide from Amomum krervanh Pierre. Tetrahedron letters, 36(11), 1821-1824.

16. Kim, J.G., et al. (2019), "Pyranoflavanones and pyranochalcones from the fruits of Amomum tsao-ko", Journal of natural products, 82(7), pp. 1886-1892.

17. Kim, J. G., Le, T. P. L., Hong, H. R., Han, J. S., Ko, J. H., Lee, S. H., ... & Hwang, B. Y. (2019). Nitric oxide inhibitory constituents from the fruits of Amomum tsao-

ko. Natural Product Sciences, 25(1), 76-80.

18. Kim, Ki Hyun, et al. "Terpene glycosides and cytotoxic constituents from the seeds of Amomum xanthioides." Planta medica 76.05 (2010): 461-464.

19. Kim, Y. Y., Je, I. G., Kim, M. J., Kang, B. C., Choi, Y., Baek, M. C., ... & Kim, S. H. (2017). 2-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid attenuates mast cell-mediated allergic reaction in mice via modulation of the FcεRI signaling pathway. Acta Pharmacologica

Sinica, 38(1), 90-99.

20. Kikuzaki, Hiroe. "Antioxidants from some tropical spices." 2003. 176-189. 21. Kumar, Gopal, Baby Chauhan và Mohammed Ali. "Phân lập và xác định các

phytoconstitu mới từ dịch chiết quả Sa nhân (Amomum subulatum Roxb)." Nghiên cứu

Sản phẩm Tự nhiên 28.2 (2014): 127-133.

22. Lee, K.Y., et al. (2008), "Inhibitory constituents of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 microglia isolated from Amomum tsao-ko", Planta medica, 74(08), pp. 867-869.

23. Li Wei et al (2011), Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil