Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các mẫu dịch chiết và các chất sạch được thực hiện trên một số dòng tế bào ung thư: HepG2 (ung thư gan), SK-Mel-2 (ung

thư da melanoma), MCF7 (ung thư vú) tại phịng Sinh học Thực nghiệm, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trên các dòng tế

bào HCT-15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi),

ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), MDA-MB-231 (ung thư vú) được thực hiện tại Phịng thí nghiệm hóa học các sản phẩm tự nhiên biển, Viện Khoa học và Công nghệĐại dương Hàn Quốc, Busan, Hàn Quốc.

Hóa chất sử dụng:

27 - Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pipette, eppendorf, máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-Rad), đầu đọc vi tấm VersaMax (LLC, Sunnyvale, CA, USA)

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA), adriamycin (Sigma, USA). - Các hóa chất thơng thường khác

- Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii

và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia và American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) cung cấp.

 Nguyên lý của phép thử [56]:

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thửđộđộc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks.

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ

quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tếbào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với

lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thửđược thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Các mẫu thử nghiệm được hòa tan trong DMSO và được chuẩn bị ở các nồng

độ khác nhau (0,5; 2; 10; 20 và 40 μM) bằng cách pha lỗng tương ứng với mơi

trường tăng trưởng

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Chất thử (10 µL) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm 190 µL tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 µg/mL, 20 µg/mL; 4 µg/mL; 0,8 µg/mL.

- Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng khơng có chất thử nhưng có TBUT (190 µL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cốđịnh bằng trichloracetic acid 50% (50 µg/mL) – TCA.

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB 0.4% trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid 1% rồi để khô ở nhiệt độ phòng. - Thuốc nhuộm liên kết với protein được chiết với base Tris 10 mM ởpH 10,5 để xác định mật độ quang học.

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy đọc ELISA (Bio-Rad) và

đầu đọc vi tấm VersaMax.

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽđược xác định thơng qua công thức sau:

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -

OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0) - Phép thửđược lặp lại 3 lần đểđảm bảo tính chính xác.

- Ellipticine ở các nồng độ 10 µg/mL; 2 µg/mL; 0,4 µg/mL; 0,08 µg/mL được sử

dụng như là chất đối chứng dương trong thử nghiệm gây độc tế bào; adriamycin được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm ức chếsinh trưởng tếbào ung thư.

28 - DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độức chế

50% sự phát triển) sẽđược xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. - Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50 ≤ 20 μg/mL, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt (hit compound) khi IC50 ≤ 5 μM [59].

IC50 = HighConc - (HighInh% -

50) x (HighConc - LowConc) HighInh% - LowInh% Trong đó: HighConc/LowConc: chất thửở nồng độ cao/chất thửở nồng độ thấp HighInh%/LowInh%: % ức chếở nồng độ cao/% ức chếở nồng độ thấp

2.2.3.2. Hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)

Hoạt tính ức chế sản sinh NO của các dịch chiết và các chất sạch được thực hiện theo phương pháp của Griess trên đại thực bào của chuột (RAW264.7 đối với các chất từ cây Na rừng (thực hiện tại khoa Dược - Đại học Tôn Đức Thắng - Thành phố Hồ Chí Minh và BV-2 với các chất từ cây Thông đất, thực hiện tại Đại học

Dược Wonkwang, Hàn Quốc) kích thích bởi LPS [57].

a. Nguyên lý chung:

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Khi xuất hiện các đáp ứng viêm, dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tếbào gan thường được sản sinh với lượng lớn.

*Phương pháp Griess để xác định •NO là xác định màu sắc của sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Trong phản ứng này, nitrate (NO3-) chuyển thành nitrite (NO2-),

do tác động của nitrate reductase.

NO3-NO2- Nitrate reductase NO2-

Khi xử lý với thuốc thử Griess, nitrite chuyển thành màu hồng theo phản ứng sau: S NH2 O O H2N + NO2- S N2+ O O H2N N H NH2 NNED S N O O H2N N N H NH2 sulfanilamide

*Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng

sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hồ

29 N N + N N S N CH3 CH3 Br- N N N H N S N CH3 CH3 MTT Formazan

Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT.

Lượng formazan tạo thành được hồ tan bởi dung mơi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử

nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khảnăng sống sót của tế bào [61].

b. Phương pháp thực hiện

Tế bào (RAW264.7 hoặc BV-2) được nuôi cấy với nồng độ 5 x 105 tế bào/mL

trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin G (100 U/mL), streptomycin (100 mg/L) và L-glutamine (2 mM). Sau đó, mơi trường được thay thế

bằng mơi trường mới chứa 100 g/mL LPS và các hợp chất thửở nhiều nồng độ khác nhau, giữ ổn định trong 24 h. Sự sản sinh NO được đánh giá dựa vào sự tích tụ

nitrite trong dịch nổi của tế bào sử dụng thuốc thử Griess. Dung dịch DMSO 1%

được sử dụng làm mẫu trắng, butein, dexamethasone, sulfuretin được sử dụng làm mẫu đối chứng [57].

NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ

hấp thụđược đo ở 570 nm.

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính in vitro được bổ

sung dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ 4 h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol.

Độ hấp thụđược đo ở 570 nm. c. Tính tốn - % ức chế NO % ức chế = x 100 Trong đó: A-C: nồng độ NO2- (µM) A: LPS (+) mẫu (-) B: LPS (+) mẫu (+) C: LPS (-) mẫu (-)

Khả năng ức chế nitrite cho nồng độ ức chế trung bình IC50 – giá trị được tính tốn bằng chương trình GraphPad Prism, version 8.4.0 (GraphPad Software Inc.,

USA)

- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)

Giá trị CS: là khảnăng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS (%) được tính theo cơng thức:

CS% = ± σ

30 OD: mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn được tính theo cơng thức:

Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i, : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại

- Tính giá trị IC50

Nồng độức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50

được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.4.0.

% ức chế tế bào = x 100

IC50 =

HighConc - (HighInh% -

2.2.3.3. Phương pháp xác định cấu hình đường bằng thủy phân acid

Quy trình thủy phân đường bằng acid đểxác định cấu hình của đường được thực hiện theo phương pháp đã công bốtrước đây [58, 59, 60].

Hợp chất cần thử (1,0 mg) được thủy phân bằng cách đun nóng trong 100 μL

dung dịch H2SO4 10% ở 80 °C trong 3 giờ, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phịng và pha lỗng với 4 mL nước. Hỗn hợp sau phản ứng được trung hòa bằng BaCO3, và lọc, sau đó dịch lọc được chiết bằng ethyl acetate (3 × 4 mL). Lớp nước được cơ đặc

để thu được cặn đường, hòa tan cặn đường trong 1 mL pyridine và đun nóng với 6

mg L-cysteine methyl ester ở 60 oC trong 60 phút, sau đó thêm

phenylisothiocyanate (0,1 mL) vào hỗn hợp phản ứng và tiếp tục phản ứng ở 60 oC trong 60 phút để tạo ra dẫn xuất arylthiocarbamate theo phản ứng sau:

O HO HO HO OH OH HS H2N COOCH3 H 1) 2) S C N N HO OH HO HO OH N S COOCH3 H NH S H

0,7 mg sản phẩm được hòa tan trong acetonitrile và được phân tích bằng HPLC

pha đảo tiêu chuẩn (Kinetex C18: 4,6 mm x 250 mm, 5 μm) với pha động là hỗn hợp 20% acetonitrile trong nước ở tốc độ dòng 0,8 mL/phút, phát hiện bằng detector UV (ở 250 nm) ở điều kiện phân tích là 0 phút (80% nước/20% ACN) - 50 phút

(20% nước/80% ACN). Các đường với cấu hình khác nhau sẽ cho sản phẩm có thời

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Phân lập các hợp chất từ lồi Thơng đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic.

Serm.)

3.1.1. Quy trình phân lập các chất

Tồn cây Thơng đất sau khi thu hái vềđược rửa sạch, phơi khô và nghiền nhỏ thu

được 5,2 kg bột dược liệu khô. Lượng bột này được ngâm chiết với methanol ở

nhiệt độ phòng (3 lần x 10 L) trong 24 h. Dịch chiết methanol được đem đi cô quay thu được cặn chiết tổng (360 g). Cặn chiết này đem hòa vào 2 L nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và cô quay dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexane (H), cặn chiết ethyl acetate (E) và dịch chiết nước (W). Sơ đồ

ngâm chiết được thể hiện trên hình 3.1.

Hình 3.1. Sơ đồ ngâm chiết thân cây Thông đất

Dịch nước được phân tách trên cột với Diaion HP-20 và rửa giải với hệ dung

môi MeOH/nước với tỷ lệ lần lượt là 100% H2O; 50/50, v/v và 100% MeOH thu

được 3 phân đoạn W1-W3.

Phân đoạn W2 (3,2 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP18 sử dụng hệ dung môi rửa giải là MeOH/nước (1/2 đến 2/1, v/v) thu được 4 phân đoạn nhỏ (W2A- W2D).

Hợp chất LC1 (1,0 mg) thu được từ phân đoạn W2A tinh chế trên cột pha đảo RP18 hệ MeOH/acetone/H2O (8/1/1, v/v/v) và chạy qua cột Sephadex™ LH-20.

Phân đoạn W2C được chạy sắc ký cột pha thường với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6/5/0,04/0,1, v/v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ W2C1- W2C3.

Hợp chất LC18 (3,0 mg) thu được bằng cách tinh chế phân đoạn W2C1 trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1, v/v/v) và qua cột SephadexTM LH-20 sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (1/1, v/v).

Tinh chếphân đoạn W2C3 (150 mg) trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi EtOAc/MeOH/H2O (7/1/0,1, v/v/v) và sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (1/3 và 1/2, v/v) thu được hợp chất LC19 (4,0 mg) và LC20 (13,0 mg) và LC2 (4,0 mg).

Phân đoạn W2D (640,0 mg) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/acetone/H2O (6,5/1/0,04/0,1, v/v/v/v) và cột Sephadex™ LH-20 rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/acetone/H2O (8/1/1, v/v/v) thu được hợp chất LC3

(3,0 mg) và LC4 (24,0 mg).

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập dịch nước của cây Thông đất

Cặn chiết Ethyl acetate (60 g) được tách thành 4 phân đoạn nhỏ E1-E4 bằng cách sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/EtOAc (10/1 đến 0/1, v/v).

Phân đoạn E3 (30 g) được tiến hành sắc ký cột pha thường hệ dung môi n-

hexane/EtOAc (20/1 đến 1/1, v/v) thu được 4 phân đoạn nhỏ E3A-E3D.

Tinh chế phân đoạn E3B (7,0 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (4/3, v/v) thu được hợp chất LC6 (2,5 mg) và LC12 (9,0 mg).

Phân đoạn E3C (14,0 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi MeOH/H2O (1/1, v/v) và tinh chế thêm trên cột sắc ký pha thường hệ dung môi CH2Cl2/acetone (6/1, v/v) thu được các hợp chất LC5 (10,0 mg); LC7 (2,0 mg);

LC8 (4,0 mg) và LC9 (5,0 mg);

Tinh chế phân đoạn E3D (2,8 g) trên cột sắc ký pha đảo RP18 hệ dung môi acetone/H2O (1/3, v/v) và tinh chế thêm trên cột silica gel pha thường hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (20/1, v/v) thu được hợp chất LC16 (10,0 mg) và LC17 (5,0 mg)

33 Tiến hành sắc ký cột pha thường phân đoạn E4 (15g) hệ dung môi n-

hexane/EtOAc (6/1 đến 1/1, v/v) thu được 4 phân đoạn nhỏ E4A-E4D.

Tinh chế phân đoạn E4A (1,4 g) trên sắc ký cột pha đảo RP18 hệ dung môi MeOH/H2O (8/1, v/v) và cột Sephadex™ LH-20 sử dụng hệ MeOH/H2O (1/1, v/v) thu được hợp chất LC10 (10,0 mg); LC11 (50,0 mg); LC13 (15,5 mg) và LC14

(5,0 mg).

Phân đoạn E4D (1,0 g) được tinh chế trên sắc ký cột pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/H2O và tiếp tục sắc ký cột pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (15/1, v/v) thu được hợp chất LC15 (6,0 mg).

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập cặn EtOAc của cây Thông đất

3.1.2. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ lồi Thơng đất đất

3.1.2.1. Hợp chất LC1: Lycocernuaside E (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

HR-ESI-MS: m/z 559,1587 [M+Cl]−

KLPT chính xác (tính tốn) [C25H32O12Cl]-: 559,1588 Công thức phân tử: C25H32O12, Mw = 524 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.1

3.1.2.2. Hợp chất LC2: Lycocernuaside A

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.2

3.1.2.3. Hợp chất LC3: Bombasin 4-O-β-D-glucopyranoside

Chất bột màu trắng

3.1.2.4. Hợp chất LC4: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-

glucopyranoside

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.4

3.1.2.5. Hợp chất LC5: Cedrusin

Chất rắn không màu

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.5

3.1.2.6. Hợp chất LC6: Lycernuic B (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

Góc quay cực riêng: − 54.3 (c 0,04, MeOH) HR-ESI-MS: m/z 595,4002 [M-H]-

KLPT chính xác (tính tốn) [C37H55O6]-: 595,4004 CTPT: C37H56O6 Mw = 596 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.6

3.1.2.7. Hợp chất LC7: Lycocernuic ketone F (hợp chất mới)

Chất bột màu trắng

Góc quay cực riêng: − 31,6 (c 0,1; MeOH). HR-ESI-MS: m/z 473,3628 [M+H]+

KLPT chính xác (tính tốn) [C30H49O4]+: 473,3625 CTPT: C30H48O4 Mw = 472 g/mol

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.7

3.1.2.8. Hợp chất LC8: Lycernuic ketone C

Chất rắn không màu

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.8

3.1.2.9. Hợp chất LC9: Lycernuic ketone B

Dạng dầu không màu

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.9

3.1.2.10. Hợp chất LC10: Lycoclavanol

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.10

3.1.2.11. Hợp chất LC11: 3-epi-lycoclavanol

Chất bột màu trắng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.11

3.1.2.12. Hợp chất LC12: Methyl lycernuate B

Chất rắn không màu

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.12

3.1.2.13. Hợp chất LC13: Lycernuic acid B

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.13

3.1.2.14. Hợp chất LC14: 3β,21β,24-trihydroxyserrat-14-en-16-one

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.14

3.1.2.15. Hợp chất LC15: Apigenin-4′-O-(2′′-O-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside

Chất bột màu vàng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.15

3.1.2.16. Hợp chất LC16: Apigenin-4′-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside

Chất bột màu vàng

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): xem Bảng 4.1.16

3.1.2.17. Hợp chất LC17: Apigenin-4′-O-(2′′,6′′-di-O-trans-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside

Chất bột màu vàng nhạt

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) xem Bảng 4.1.17

3.1.2.18. Hợp chất LC18: Cernuine

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.18

3.1.2.19. Hợp chất LC19: Lycocernuine

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD):xem Bảng 4.1.19

3.1.2.20. Hợp chất LC11: Cermizine C N-Oxide

Chất bột màu trắng

1H-NMR(500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR(125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.20

3.2. Phân lập các chất từ loài Na rừng (Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm.)

3.2.1. Quy trình phân lập chất

3.2.1.1. Từ thân cây

Thân cây Na rừng sau khi thu hái vềđược rửa sạch, phơi khô, chặt và nghiền nhỏ thu được 5,5 kg bột khô. Bột này được chiết với methanol 80% (6 L x 3 lần) ở nhiệt

độ phòng trong 48 h. Dịch chiết methanol được cô quay dưới áp suất giảm thu được