Formaldehyde là chất dùng để bất hoạt, sử dụng trong điều chế vắc xin.Hàm lượng Formaldehyde trong mẫu được xác định bằng cách so màu của hợp chất được tạo thành do phản ứng của Formaldehyde tự do với thuốc thử Acetylacetone. Hợp chất này có màu vàng chanh và có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 415 nm.Thử nghiệm được thực hiện theo Dược điển Việt nam V, 2017, phụ lục 15.25.
2.5.12. Hàm lượng DNA tồn dư
Vắc xin Viêm não Nhật bản JECEVAX là vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero. Do vậy, kiểm định tồn dư DNA của tế bào Vero trên vắc xin là cần thiết nhằm đảo bảo tính tinh sạch an tồn của vắc xin.
Quy trình xét nghiệm tồn dư DNA của tế bào Vero trong vắc xin được thực hiện bằng phương pháp lai DNA-DIG với DNA mẫu sử dụng màng nylon.
Các bước tiến hành như sau:
Xây dựng thang chuẩn DNA: Mẫu DNA chuẩn được pha trong dung dịch TE pH 8 để có 8 điểm chuẩn với lượng DNA thích hợp để đưa lên màng là: 1000, 500, 250, 100, 50, 10, 5 và 1 pg/điểm.
Tách chiết DNA từ mẫu vắc xin: DNA được tách chiết từ mẫu vắc xin cần kiểm tra Qiagen QIAamp DNA Mini Kit. Xử lý mẫu.
Nhỏ mẫu DNA lên màng:
Biến tính DNA chuẩn và DNA mẫu ở nhiệt độ 950C trong vòng 5 phút, sau đó ủ ngay vào đá 10 phút.
Nhỏ mẫu DNA kiểm tra và các mẫu DNA chuẩn lên màng nylon vào các điểm đã được đánh dấu trên màng.
Các điểm đối chứng âm tính chỉ nhỏ dung dịch TE pH 8.
reagent, 50% (v/v) formamide, 0.5% (w/v) SDS, 100 μg/ml salmon sperm DNA, 6x SSC). Ủ ở 42oC trong vòng 5 phút. Loại bỏ, dung dịch tiền lai rồi tiếp tục bổ sung 10 ml dung dịch tiền lai mới.
Ủ ở 42oC trong vòng 30 phút.
Thay dung dịch tiền lai bằng 3,5 - 4 ml dung dịch lai (dung dịch tiền lai chứa probe gắn DIG).
Ủ ở 42oC qua đêm. Rửa màng sau lai Phát hiện DNA:
Blocking màng trong 100 ml dung dịch blocking (10% Genius Blocking Reagent in 0.1 M maleic acid and 0.15 M NaCl), lắc nhẹ trong 30 phút.
Pha loãng anti-digoxigenin-AP trong dung dịch blocking tỉ lệ 1:10000 (75mU/ml): cho 100 µl anti-digoxigenin-AP trong 100 ml dung dịch blocking, lắc nhẹ trong 30 phút.
Rửa màng 2 lần với 100 ml dung dịch rửa, mỗi lần lắc nhẹ trong 15 phút. Rửa màng với 100 ml dung dịch rửa, lắc nhẹ trong 5 phút. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch sau khi rửa.
Nhỏ 10 ml dung dịch CSDP ready-to-use lên màng, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ủ 37oC, 10 phút.
Loại bỏ hoàn toàn dung dịch. Bọc nilon rồi ép phim, thời gian khoảng 15-25 phút.
Rửa phim
Đánh giá kết quả dựa vào độ phát quang của mẫu thử so với mẫu DNA chuẩn để tính hàm lượng DNA tồn dư trong các mẫu.