CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.3. Thiết kế nghiên cứu
Sơ đồ hình 2.2. Mơ tả tóm tắt các thử nghiệm kiểm tra chất lượng chủng MSV, WSV và vắc xin JECEVAX. Nội dung được thực hiện trên 2 nhóm đối tượng nghiên cứu: Chủng vi rút VNNB được sản xuất gồm lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản xuất BV-MSV-0310; 10 lơ vắc xin Viêm não Nhật Bản JECEVAX.
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu2.4. Biến số và nội dung nghiên cứu 2.4. Biến số và nội dung nghiên cứu
Sản xuất từ 2010 đến 2018
Ổn định di truyền Mycoplasma
Hiệu giá và ổn định về hiệu giá BV-WSV-0310
Bảng 2. 6. Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản
xuất BV-WSV-0310
TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn viện dẫn
1 Nhận dạng chủng MSVvà WSV với kháng thể
đặc hiệu ELISA
TCCS; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 2 Nhận dạng và xác định tính ổn định di truyền của chủng MSV và WSV
Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963
3 Tương đồng nucleotide Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963
4 Tương đồng protein Giải trình tự gen TCCS, DĐ TQ, WHO TRS 963
5 Hiệu giá vi rút trên tếbào Tạo đám hoại tử PFU TCCS, DĐVN V, 2017; Dược điểnChâu Âu, 2018; WHO TRS 963
6 Hiệu giá vi rút trênđộng vật thí nghiệm Thử trên não chuột nhắt TCCS, DĐVN V, 2017; Dược điểnChâu Âu, 2018; WHO TRS 963
7 Nhiệt độ bảo quản phùhợp
Hiệu giá chủng được kiểm tra sau khi bảo quản ở các dải nhiệt độ khác nhau, trong các khoảng thời gian khác nhau
TCCS, WHO TRS 963
8 Vô trùng Cấy trực tiếp trên môi trườngThioglycholate và soybean casein DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;WHO TRS 963, PL1
9 Kiểm tra nhiễmMycoplasma Cấy trên môi trường PPLO lỏng I,II, thạch PPLO DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;WHO TRS 963, PL1
10 Vi rút ngoại lai trênchuột nhắt Thử trên chuột nhắt (tiêm não vàphúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;WHO TRS 963, PL1
11 Vi rút ngoại lai trênchuột nhắt ổ Thử trên chuột nhắt ổ (tiêm não vàphúc mạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;WHO TRS 963, PL1
12 Vi rút ngoại lai trênchuột lang Thử trên chuột lang (tiêm phúcmạc) DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018;WHO TRS 963, PL1
Bảng 2.7. Chỉ tiêu nghiên cứu trên vắc xin JECEVAX
TT Chỉ tiêu Phương pháp Tiêu chuẩn chấp nhận Tiêu chuẩn viện dẫn
1 Cảm quan Quan sát bằng mắtthường
Dung dịch trong suốt, đồng nhất và khơng có vật thể lạ DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 2 Thể tích Cân và đo tỷ trọng ≥ 1,0 ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 3 pH Máy đo pH 6,8-7,4 DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 4 Hàm lượngThimerosal Thuốc thử acetylacetone, đo OD, = 415nm (DĐVN IV, 2009, PL15.29) ≤ 120 µg/ml DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1 5 Hàm lượngFormaldehyde Thuốc thử Ditizon, đo OD, = 480 nm (DĐVN IV, 2009, PL15.25)
≤ 10 µg/ml DĐVN V, 2017; DĐ ChâuÂu, 2018; WHO TRS 963, PL1
6 Hàm lượngDNA tồn dư PCR/ phương pháplai điểm ≤ 10 ng/ml DĐVN V, 2017; DĐ ChâuÂu, 2018; WHO TRS 963, PL1
7 Hàm lượngprotein tổng số Lowry ≤ 80 µg/ml DĐVN V, 2017; DĐ ChâuÂu, 2018; WHO TRS 963, PL1
8 Kiểm tra vôtrùng
Cấy trực tiếp trên môi trường Thioglycholate và soybean casein (DĐVN IV, 2009, PL15.7) Khơng có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
9 An toàn chung DĐVN IV, 2009,PL15.11
Trong vòng 7 ngày theo dõi tồn bộ động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân và khơng có biểu hiện bệnh lý hoặc nhiễm độc
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
10 Chất gây sốt Tiêm tĩnh mạch taithỏ, DĐVN V, 2009, PL 15.12
Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh lệch của mỗi thỏ ≤ 0,60C và tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1,30C DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
11 Công hiệu Phương pháp trunghòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50)
≥ 1,3 log PRNT50/ml; hoặc công hiệu tương quan của vắc xin thử so với vắc xin mẫu chuẩn ≥ 1,0
DĐVN V, 2017; DĐ Châu Âu, 2018; WHO TRS 963, PL1
2.5. Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5)
2.5.1. Kiểm định vi rút ngoại lai
Kiểm định vi rút ngoại lai là một trong các tiêu chuẩn nhằm đảm bảo chất lượng của chủng vi rút sử dụng trong sản xuất vắc xin Viêm não Nhật Bản. Phương pháp kiểm định vi rút ngoại lai bao gồm kiểm định trên động vật thí nghiệm và trên tế bào.
Tế bào được dùng để kiểm định vi rút ngoại lai gồm nhiều dòng tế bào khác nhau: tế bào Vero, tế bào MRC5, BHK-21. Chủng vi rút Viêm não Nhật bản được trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu và cấy 3 ml vào 5 chai tế bào thử nghiệm. Tế bào được nuôi cấy ở 36,5 0,5oC trong vịng 14 ngày. Trong q trình ni cấy, chai tế bào được theo dõi đám hoại tử (CPE) dưới kính hiển vi soi ngược vào ngày thứ 1, 4, 7, 11 và 14.Sau 14 ngày theo dõi tình trạng phát triển của tế bào, nước nổi trong các chai tế bào được loại bỏ để kiểm tra vi rút hấp phụ hồng cầu. Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu kiểm định vi rút ngoại lai khi thử nghiệm không phát hiện tế bào bị hủy hoại (CPE) và khơng có vi rút hấp phụ hồng cầu.
Kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật thí nghiệm được thực hiện với 20 chuột nhắt trắng tiêm não, 10 chuột nhắt trắng tiêm phúc mạc, 20 chuột ổ 1-3 ngày tuổi tiêm não, 10 chuột ổ 1-3 ngày tuổi tiêm phúc mạc và 5 chuột lang tiêm phúc mạc. Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu trước khi tiêm cho động vật thử nghiệm và theo dõi tăng trưởng cân nặng, các dấu hiệu bệnh lý bất thường sau tiêm. Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu kiểm định vi rút ngoại lai thử nghiệm trên động vật khi:
Chuột nhắt: khơng có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bệnh lý sau 21 ngày theo dõi.
Chuột ổ: khơng có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi.
Chuột lang: khơng có chuột chết, 100% chuột sống khỏe mạnh, khơng có dấu hiệu bệnh lý, giải phẫu bệnh không thấy tổn thương phủ tạngsau 42 ngày theo dõi.
2.5.2. Kiểm định vô khuẩn
Kiểm định vô khuẩn được thực hiện nhằm đảm bảo chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được sử dụng sản xuất vắc xin không nhiễm các tác nhân vi khuẩn hoặc nấm. Huyền dịch chủng vi rút Viêm não Nhật Bản được cấy trên môi trường Thioglycolate theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam 5, 2017. Môi trường Thioglycolate sau nuôi cấy được ủ ở nhiệt độ32,5±2,50C, và 22,5±2,50C trong thời gian 14 ngày. Môi trường sau nuôi cấy được theo dõi hàng ngày và ghi kết quả theo dõi vào phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn các ngày 1, 3, 5, 7, 10 và 14.
Chủng vi rút Viêm não Nhật Bản đạt yêu cầu vô khuẩn khi cả 2 loại môi trường đều trong, không bị vẩn đục, môi trường Thioglycolate không bị mất lớp chỉ thị màu ở phía trên.Chứng tỏ khơng có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi.
2.5.3. Nhận dạng
Chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản sử dụng sản xuất vắc xin được kiểm định nhận dạng bằng kỹ thuật ELISA trực tiếp. Kỹ thuật dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong đó kháng thể IgG chuột kháng vi rút VNNB chủng Beijing-1 đã gắn vào phiến kết hợp với kháng nguyên vi rút VNNB trong mẫu thử. Sau đó cho cộng hợp IgG chuột kháng Beijing-1 gắn enzyme (peroxidase) sẽ tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên - cộng hợp. Thêm cơ chất OPD, enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên trong mẫu thử. Đo mật độ quang học (OD) trên máy đọc ELISA ở bước sóng = 490/620nm.
Các giá trị OD của mỗi mẫu thử và mẫu chuẩn được thể hiện bằng đồ thị logarit (xử lý số liệu trên Excel) với trục tung là độ pha lỗng, trục hồnh là các giá trị OD. Kết quả nhận dạng được xác định đảm bảo các yếu tố chứng âm và Blank không lên màu; mẫu thử và mẫu chuẩn phải có màu vàng và OD mẫu ≥ 10 lần OD Blank thì được coi là dương tính.
2.5.4. Đánh giá ổn định di truyền
xin được đánh giá tính tương đồng về mặt di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Bộ gen được sử dụng trong kiểm định này là đoạn gen E bao gồm trình tự nucleotide của đoạn gen E và trình tự acid amin được tổng hợp từ gen này. Kết quả giải trình tự gen của các đợt đánh giá trên chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được so sánh với kết quả giải trình tự gen ngay sau khi sản xuất của chính các chủng này, so sánh với chủng Beijing – Kanonji, so sánh với các chủng vi rút Viên não Nhật Bản phân lập được trên người, lợn và muỗi tại Việt Nam giai đoạn 1964 đến 2014.Quy trình giải trình tự gen E của chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản trong nghiên cứu này được thực hiện như sơ đồ hình 2.2.
RNA tổng số được tách chiết và tinh chế từ mỗi mẫu nhờ QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Vùng gen E được khuếch đại bằng RT-PCR sử dụng bộ kit OneStep PCR Kit (Qiagen) với cặp mồi được thiết kế bằng chương trình Primer- Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) dựa trên trình tự gen E của vi rút Viêm não Nhật Bản. Cặp mồi có trình tự như sau::
JEV-E-p1: 5’-TTCAACTGTCTGGGAATGG-3’ (19 nu) JEV-E-p2: 5’-AGCATGCACATTGGTAGCTA-3’ (20 nu)
Với chương trình: bước 1 ở 50°C 30 phút, bước 2 ở 95°C 15 phút; lặp lại 30 chu kỳ (94°C trong 1 phút, 50°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút), bước 3 ở 72°C trong 10 phút và bước 4 giữ sản phẩm ở 4oC cho tới khi sử dụng. Vùng gen E được khuếch đại có độ dài tính theo lý thuyết là 1500 bp. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gen agarose 1%. Băng chứa sản phẩm PCR được thôi gel và tinh chế nhờ QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) để phục vụ cho việc giải trình tự. Giải trình tự gen được thực hiện với bộ Kit Applied Biosystems™ Sanger Sequencing Kit (Thermo Fisher) và máy giải trình tự gen ABI 3500 của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
Hình 2. 3. Quy trình giải trình tự gen E vi rút Viêm não Nhật Bản
Trình được gen E được phân tích nhờ các phần mềm như Blast, CLC Generation Worbench, Aliview, BioEdit, MEGA6.0...để đánh giá mức độ tương đồng và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự vùng gen E của 2 chủng Beijing-1 với chủng chuẩn và các chủng virus VNNB phân lập từ người, lợn và muỗi ở Việt Nam từ những năm 1964 đến năm 2014 (Bảng 2.7.). Phân tích epitope kháng nguyên vùng gen E được tiến hành theo phương pháp của Luca et al., (2012).
Bảng 2. 8.Thơng tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt
Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong nghiên cứu
STT Số đăng ký trong GenBank Năm phân lập Vật chủ
1 LC000631 1964 Người 2 AY376461 1986 Người 3 AY376463 1989 Người 4 HQ009263 2004 Người 5 LC000634 2007 Người 6 KP876007 2014 Người 7 JEU70420 1979 Muỗi 8 AB933311 1994 Muỗi 9 AY376468 2002 Muỗi 10 JN574431 2005 Muỗi 11 LC000635 2010 Muỗi 12 LC000637 2011 Muỗi 13 AY376464 2001 Lợn 14 AY376465 2002 Lợn 15 HQ009265 2005 Lợn 2.5.5. Hiệu giá vi rút
Chủng gốc và chủng sản xuất của vi rút Viêm não Nhật Bản được lấy ra kiểm tra sự ổn định về hiệu giá sau các khoảng thời gian (từ lúc sản xuất 2010 đến 2020) khi các lô chủng này bảo quản tại các nhiệt độ ≤ -60oC, -20oC, 2-8oC. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng chủng theo khuyến cáo của TCYTTG cho chủng sử dụng để sản xuất vắc xin dùng cho người và WHO TRS 963, phụ lục 1 khuyến cáo về kiểm soát chất lượng chủng cho sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt dùng cho người. Hiệu giá vi rút được thử nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào (PFU) và trên động vật thử nghiệm (LD50).
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào được thực hiện trên tế bào BHK-21 hoặc tế bào Vero bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử PFU trên tế bào (phiến 6 giếng). Chủng vi rút sau khi tan đơng được pha lỗng bậc 10 từ 10-1đến 10-8. Chọn 3 độ pha loãng cuối cùng để gây nhiễm lên tế bào. Chủng vi rút được gây nhiễm lên tế bào bằng cách cấy 200l hỗn dịch virus đã pha loãng ở trên vào mỗi giếng, mỗi độ pha 2 giếng. Cho tất cả các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) để ủ 90 phút.Cứ 30 phút láng 1 lần.Sau đó phủ thạch và nuôi cấy tiếp 4 ngày trong tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2).Khi các plaque hiện rõ, nhuộm, cố định các đám hoại tử.
Số đám hoại tử tế bào (plaque) được đếm trong mỗi giếng. Các plaque là những đốm trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường ở mặt đáy, đếm các plaque. Hiệu giá vi rút được tính theo cơng thức sau:
Chuẩn độ hiệu giá vi rút trên động vật (chuột bằng phương pháp LD50)
Hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất vi rút Viêm não Nhật Bản được thực hiện trên chuột nhắt trắng (giống swiss hoặc ICR) 3 tuần tuổi. Chuột được chuẩn bị trước gây nhiễm 2 ngày và được chọn ngẫu nhiên với số lượng 10 con cho mỗi độ pha loãng. Chủng vi rút sau khi tan đơng được pha lỗng bậc 10 từ 10-1đến 10-9. Chọn 5 độ pha loãng cuối cùng để gây nhiễm cho chuột thí nghiệm.
Quy trình thử thách như sau:
- Sử dụng các độ pha từ 10-5 đến 10-9 để tiêm chuột - Liều tiêm: 0,03ml/1chuột
- Đường tiêm: Não
Theo dõi các dấu hiệu chuột bị nhiễm vi rút VNNB: liệt 1-2 chân trước; liệt 1-2 chân sau, liệt 1 chân trước 1 chân sau hoặc chết...
Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày.
Theo dõi tình trạng nhiễm vi rút VNNB của chuột bắt đầu từ sau tiêm 3 ngày và ghi nhật ký tình trạng chuột hàng ngày trong thời gian theo dõi 14 ngày (chuột chết trong 2 ngày đầu loại bỏ).
Hiệu giá vi rút được tính theo cơng thức sau
Hoặc
Trong đó : A là độ pha loãng của CVS(challenge virus strain) gây chết chuột ngay sát dưới 50%
a: % chuột chết ngay sát dưới 50% b: % chuột chết ngay sát trên 50% k: Lg bậc pha loãng
Hiệu giá virus trong chủng gốc, chủng sản xuất VNNB được sử dụng để sản xuất vắc xin cần đạt ≥ 106.
2.5.6. Thử nghiệm công hiệu của vắc xin
Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bản bất hoạt được xác định dựa trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau tiêm miễn dịch trên chuột và thử thách trên tế bào Vero hoặc BHK-21 hoặc dòng tế bào phù hợp khác.
Các bước chính của quy trình thử nghiệm như sau:
Pha vắc xin chuẩn và vắc xin thử trong dung dịch PBS 0,02% gelatin để có độ pha 1/32.Mỗi mẫu vắc xin được tiêm phúc mạc cho một nhóm chuột nhắt trắng gồm 16 con, mỗi con 0,5 ml bằng bơm tiêm 1ml vô khuẩn với 2 mũi, mỗi mũi cách nhau 7 ngày.
Sau khi tiêm mũi thứ 2 được 7 ngày, toàn bộ chuột thử nghiệm được lấy máu tim và tách lấy huyết thanh riêng từng chuột.Huyết thanh nhóm chuột tiêm vắc xin mẫu chuẩn được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 ống, sau đó chúng được hộn chung vào 1 ống và ký hiệu RA và RB.
Huyết thanh nhóm chuộttiêm vắc xin thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 ống sau đó hộn chung vào ống ký hiệu VA và VB.
Huyết thanh của 8 chuột chứng hộn chung thành 1 ống ký hiệu là CA (-). Tất cả các huyết thanh được bất hoạt 56oC /30 phút.
Huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử được pha lỗng trong mơi trường