Sau khi tiến hành thẩm định phương pháp phân tích Natamycin trong thực phẩm, qui trình phân tích Natamycin được đề xuất như sau:
Đối với phép phân tích HPLC-HRMS
Hệ thống sắc ký lỏng sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống Q Exactive Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (Thermo, USA). Hệ thống sắc ký lỏng Dionex bao gồm bộ tiêm mẫu tự động, bơm 4 kênh dung môi và bộ gia nhiệt cột sắc ký. Khối phổ sử dụng trong nghiên cứu này là Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer được cung cấp bởi Thermo (USA).
˗ Cột sắc ký được sử dụng để phân tích Natamycin là cột Acquity BEH C18 (100 2,1 mm, 1,7 µm)
˗ Nhiệt độ cột: 300C.
˗ Thể tích tiêm mẫu tối ưu là 5 µL với dung mơi rửa kim là acetonitrile/nước khử ion (1/1, v/v).
˗ Dung môi pha động được sử dụng bao gồm (A) nước khử ion có chứa 0,1% formic acid và 10 mM amonium formate, và (B) acetonitrile có chứa 0,1% acid formic.
˗ Chương trình dung mơi pha động bắt đầu từ 5% B (giữ trong 1 phút) sau đó tăng tuyến tính đến 100% B trong 2 phút (giữ 1 phút) và giảm xuống 5% B trong 2,5 phút (giữ trong 3 phút).
˗ Tốc độ dòng được sử dụng là 0,2 mL/phút. Thơng số khối phổ được trình bày như sau:
˗ Sử dụng chế độ ion hóa điện tử ở chế độ ion dương, tín hiệu khối phổ được ghi nhận ở chế độ AIF (all fragmentation ions).
˗ Tốc độ khí bổ trợ: 0,5
˗ Tốc độ phun sương (sheath gas): 20 ˗ Tốc độ khí bay hơi dung mơi: 5 ˗ Nhiệt độ hóa hơi dung mơi: 3200C ˗ Nhiệt độ ống mao quản: 1500C ˗ Điện thế ống mao quản: 3,0 kV.
Đối với quy trình xử lí mẫu
Cân khoảng 2,0 gam mẫu đã được đồng nhất kĩ cho vào ống li tâm 50 ml. Sau đó, tiếp tục thêm vào mẫu phân tích 10 mL dung mơi acetonitrile có chứa 0,05% acid acetic, trộn đều mẩu bằng máy vortex với tốc độ 2000 vòng/phút, trong 1 phút. Sau đó chiết mẫu đã được trộn đều bằng máy lắc mẫu trong 20 phút, tiếp tục li tâm mẫu đã được lắc chiết với tốc độ 9000 vịng/phút, trong 5 phút. Hút chính xác 5 mL mẫu dịch chiết vào bình định mức 100 mL, sau đó định mức bằng nước khử ion có chứa 0,05% axetic axit. Cột chiết pha rắn bao gồm C18 (150 mg) và PSA (50 mg) được trộn đều và nhồi vào cột, cột được hoạt hóa bằng 3 mL methanol và 3 mL nước khử ion chứa 0,05% axetic axit. Mẫu sau khi định mức được tải qua cột chiết pha rắn với tốc độ 2 mL/phút. Rửa tạp bằng 5 mL nước khử ion và làm khô cột bằng bơm áp suất kém. Dùng 2 mL dung môi methanol chứa 0,1% acid formic làm dung mơi rửa giải chất phân tích. Mẫu sau khi rửa giải được lọc qua màng lọc PTFE 0,22 µm và đem phân tích sắc ký.
Qui trình xử lí mẫu được trình bày theo sơ đồ sau:
3.3. Áp dụng quy trình để xác định hàm lƣợng natacymin trên mẫu thực phẩm
Chúng tôi chọn khảo sát 4 mẫu: Thạch rau câu, sữa chua, măng chua và dưa muối. Các mẫu này đều được thu mua ở các chợ địa phương trên địa bàn Hà Nội. Thực hiện quy trình xử lý mẫu như mục 2.3.2, với dung mơi chiết là acetonitril có chứa 0,05% axit axetic. Dưới đây là kết quả hàm lượng Natamycin trong mẫu thạch rau câu :
2,0g mẫu + 10mL dung môi acetonitrile
5 mL dung dịch chiết mẫu
Tải mẫu
Rửa tạp
Rửa giải
Định mức lên 100mL bằng AcOH 0,05%
Sử dụng cột chiết pha rắn C18 (150mg) và PSA (50mg) 3mL MeOH: 3mL AcOH 0,05%, tốc độ 2mL/phút
Thêm 5mL nước khử ion và làm khô cột bằng bơm áp suất kép
Trộn đều bằng máy vortec với tốc độ 2000 vòng/phút trong 1 phút.
2mL MeOH chứa 0,1% FA (axit fomic)
Chạy trên HPLC- HRMS Ly tâm 9000 vòng/phút trong 5 phút
Hình 3.3. Hàm lƣợng Natamycin trong mẫu thạch rau câu
Dựa vào hình 3.3 có thể thấy Natamycin được sử dụng hầu hết trong các mẫu thạch rau câu. Thạch rau câu chủ yếu được chế biến bằng phương pháp thủ công của các hộ kinh doanh nhỏ lẻ, từ đó khơng quản lý được chất lượng của mặt hàng. Với mong muốn có thể kéo dài thời gian hạn chế phát triển của nấm mốc trên rau câu, Natamycin được lựa chọn cho loại sản phẩm này. Hàm lượng Natamycin trong loại thực phẩm này dao động từ 0,1 đến 1,2 mg/kg. Việc phát hiện Natamycin trong thạch rau câu đã đặt ra câu hỏi cấp bách đến sức khỏe của con người, đặc biệt lả trẻ em vì đây là thực phẩm được trẻ em tiêu thụ nhiều nhất. Song song đó, thành phần thạch rau câu chủ yếu là đường, nước va gelatin là những thành phần thích hợp cho nấm mốc phát triển, dùng Natamycin có thể ức chế được sự phát triển của nấm mốc dẫn đến tình trạng bảo quản sản phẩm được lâu hơn nhưng lại gây biến chất của sản phẩm trong thời gian dài, quá hạn sử dụng.
Đối với sữa chua, khơng phát hiện được tín hiệu của Natamycin trong mẫu phân tích. Điều này có thể lí giải do các mẫu sữa chua đều được sản xuất theo qui trình khép kín, và khơng sử dụng Natamycin trong bảo quản thực phẩm, cũng như chất lượgn sản phẩm được kiểm tra nghiêm ngặt để bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng.
Đối với măng chua, hàm lượng của Natamycin được thể hiện trong hình dưới đây
Hình 3.4. Hàm lƣợng Natamycin trong mẫu măng chua
Dựa vào hình 3.4. có thể thấy hàm lượng Natamycin dao động từ 0,9 đến 4,2 mg/kg. Đây là loại thực phẩm thường được sử dụng rộng rãi trong các bữa ăn hàng ngày. Có thể thấy, việc tạo được vị chua cho măng chủ yếu được tiến hành thơng qua q trình lên men. Tuy nhiên, nếu để lâu thì sẽ dễ thủy phân thành rượu và làm cho sản phẩm khơng cịn khả năng sử dụng. Do đó, việc sử dụng Natamycin trong loại thực phẩm này là cứu cánh ức chế sự phát triển của nấm men, làm kéo dài tuổi thọ của măng chua.
Hình 3.5. Hàm lƣợng Natamycin trong mẫu dƣa muối
Tương tự như măng chua, dưa muối được tiến hành lên men để tạo độ chua cho sản phẩm và Natamycin được sử dụng để kéo dài thời gian sử dụng của dưa muối. Tuy nhiên, có thể thấy được, việc sử dụng Natamycin ở mặt hàng này tương đối cao, hàm lượng dao động từ 1,2 đến 4,6 mg/kg, giá trị trung bình đạt được là 2,9 mg/kg. Từ đó đặt ra cần thiết của việc sơ chế dưa muối (rửa với nước, …) để hạn chế lượng Natamycin hấp thu trực tiếp vào cơ thể so với cách tiêu thụ trực tiếp dưa muối.
Sau đây là bảng kết quả tổng hợp hàm lượng Natamycin trong các mẫu
Bảng 3.6. Hàm lượng Natamycin trong mẫu phân tích
Mẫu phân tích Số lƣợng mẫu Natamycin (mg/Kg) Khoảng hàm lƣợng Trung bình Trung vị Thạch rau câu 15 0,1 - 1,2 0,7 0,9
Mẫu phân tích Số lƣợng mẫu Natamycin (mg/Kg) Khoảng hàm lƣợng Trung bình Trung vị Măng chua 31 0,9 - 4,2 2,64 3,2 Dƣa muối 23 1,2 - 4,6 2,9 3,1
Dựa vào bảng 3.6, có thể thấy được Natamycin gần như được sử dụng rộng rãi trong các mẫu thực phẩm được phân tích. Thạch rau câu (0,1 – 1,2 mg/kg), măng chua (0,9 – 4,2 mg/kg) và dưa muối (1,2 – 4,6 mg/kg) và hàm lượng Natamycin cao nhất được ghi nhận ở mẫu dưa muối (4,6 mg/kg). Các mẫu này đều được thu mua ở các chợ địa phương trên địa bàn Hà Nội, hồn tồn được chế biến thủ cơng, khơng có cơng thức cụ thể, cũng như liều lượng sử dụng Natamycin trong thực phẩm.
Có thể thấy được, việc sử dụng phụ gia thực phẩm ngày càng phổ biến để có thể tăng chất lượng của thực phẩm. Tuy nhiên, việc khơng có kiến thức chuyên ngành của người dân cũng như việc quản lí lỏng lẻo về ATTP rất dễ gây hại đến sức khỏe của người tiêu dùng. Như nghiên cứu Natamycin trong thực phẩm. có thể thấy được hầu hết các mẫu khảo sát đều chứa Natamycin như hiện nay, chưa có ngưỡng giới hạn an tồn của Natamycin trong thực phẩm, do đó nghiên cứu này chưa đánh giá được mức độ phơi nhiễm của hợp chất Natamycin lên cơ thể người.
KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ nghiên cứu luận văn đã đạt được những kết quả như sau: 1. Đã đề xuất xây dựng và tối ưu hóa được quy trình phân tích Natamycin trong
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-HRMS) với giới hạn phát hiện là 0,05µg/L và giới hạn định lượng của phương pháp là 0,15 µg/L. Xây dựng được quy trình phân tích với hai cơng đoạn chính là: Xử lý tách Natamycin trong các mẫu thực phẩm và phân tích trên hệ thống thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Áp dụng quy trình phân tích xác định được hàm lượng Natamycin trong một số mẫu thực phẩm thu mua trên địa bàn Hà Nội: Thạch rau câu từ 0,1 – 1,2 mg/Kg, măng chua từ 0,9 – 4,2 mg/Kg và dưa muối từ 1,2 – 4,6 mg/Kg.
Kiến nghị
- Trong khuôn khổ của Luận văn, những kết quả đạt được ở trên đã góp phần nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích lượng chất phụ gia bảo quản Natamycin một chất phụ gia đang được xã hội quan tâm hiện nay. Nghiên cứu đã mở ra một hướng phân tích mới nhanh, chính xác, có thể phân tích lượng chất phụ gia bảo quản trong thực phẩm tồn dư ra môi trường do sử dụng tràn lan trong quá trình sản xuất.
- Các cơ quan quản lý nhà nước cần có chính sách bảo vệ người tiêu dùng và chế tài xử phạt đối với các hộ kinh doanh và tiểu thương sử dụng quá tiêu chuẩn cho phép chất Natamycin trong thực phẩm.
- Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về Natamycin trong thực phẩm để có thể đưa ra những tác động lên con người, động vật.
Do hạn chế về mặt thời gian, nên còn một số vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để có thể áp dụng vào thực tiễn xử lý. Tác giả hy vọng có cơ hội để tiếp tục theo đuổi hướng nghiên cứu này trong tương lai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp
trong phân tích hố học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, pp.10-59.
Tài liệu tiếng Anh
[2] Cuenca-Estrella, M., Bernal-Martinez, L., Buitrago, M. J., Castelli, M. V., Gomez-Lopez, A., Zaragoza, O., and Rodriguez-Tudela, J. L. (2008) Int J Antimicrob Agents 32 Suppl 2,S143-147
[3] De Kruijff, B., and Demel, R. A. (1974) Biochim Biophys Acta 339(1), 57-70 [4] De Kruijff, B., Gerritsen, W. J., Oerlemans, A., Demel, R. A., and van Deenen, L. L. (1974) Biochim Biophys Acta 339(1), 30-43.
[5] De Oliveira, T.M.; de Fátima Ferreira Soares, N.; Pereira, R.M.; de Freitas Fraga, K. (2007) Development and evaluation of antimicrobial Natamycin-incorporated film in gorgonzola cheese conservation. Packaging Technology and Science 20, 147-153. [6] EFSA. (2009) Opinion of EFSA prepared by the panel on food additives and nutrient sources added to food (ANS) on the use of Natamycin (E 235) as a food additive. The EFSA Journal 7, 1412-1437.
[7] EU Parliament and Council Directive No 95/2/EC of 20 February 1995 on food additives other than colours and sweeteners. Official Journal of the European Union L 061, 1-40.
[8] Fucinxos, C.; Míguez, M.; Cerqueira, M.A.; Costa, M.J.; Vicente, A.A.; Rúa, M.L.; Pastrana, L.M. Functional Characterisation and Antimicrobial Efficiency Assessment of Smart Nanohydrogels Containing Natamycin Incorporated into Polysaccharide-Based Films. (2015) Food and Bioprocess Technology 8, 1430-1441. [9] Fajardo, P.; Martins, J.T.; Fuciños, C.; Pastrana, L.; Teixeira, J.A.; Vicente, A.A. Evaluation of a chitosan-based edible film as carrier of Natamycin to improve the storability of Saloio cheese. (2010) Journal of Food Engineering 01, 349-356.
[10] Hanušová, K.; Šťastná, M.; Votavová, L.; Klaudisová, K.; Dobiáš, J.; Voldřich, M.; Marek, M. (2010) Polymer films releasing nisin and/or Natamycin from polyvinyldichloride lacquer coating: Nisin and Natamycin migration, efficiency in cheese packaging. Journal of Food Engineering 99, 491-496.
[11] Kotler-Brajtburg, J., Medoff, G., Kobayashi, G. S., Boggs, S., Schlessinger, D. Pandey, R. C., and Rinehart, K. L., Jr. (1979) Antimicrob Agents Chemother 15(5), 716-722.
[12] Koontz, J.L.; Marcy, J.E.; Barbeau, W.E.; Duncan, S.E. Stability of Natamycin and its cyclodextrin inclusion complexes in aqueous solution. J Agric Food Chem, 51, 7111-7114.
[13] Lass-Florl, C. (2009) Mycoses 52(3), 197-205.
[14] Martin, G. S., Mannino, D. M., Eaton, S., and Moss, M. (2003) N Engl J Med 348(16), 1546-1554.
[15] Struyk, A. P., Hoette, I., Drost, G., Waisvisz, J. M., Van Eek, T., and Hoogerheide, J. C. (1957) Antibiot Annu 5, 878-885.
[16] Sun, X.; Li, X.; Wang, P.; Ma, T.; Huang, W.; Han, S.; Zhan, J. (2016) Detection method optimization, content analysis and stability exploration of Natamycin in wine. Food Chem 194, 928-937.
[17] Türe, H.; Eroğlu, E.; Soyer, F.; Özen, B. Antifungal activity of biopolymers containing Natamycin and rosemary extract against Aspergillus niger and Penicillium roquefortii.(2008) International Journal of Food Science & Technology 43, 2026- 2032.
[18] Te Welscher, Y.M.; ten Napel, H.H.; Balague, M.M.; Souza, C.M.; Riezman, H.; de Kruijff, B.; Breukink, E. (2008) Natamycin blocks fungal growth by binding specifically to ergosterol without permeabilizing the membrane. The Journal of biological chemistry 283, 6393-6401.
[19] Picó, Y..Fernández, M., Ruiz, M. J.,Font, G., (2007),Current trends in solid-
phase-based extraction techniques for the determination of pesticides in food and environment. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, ,70 (2), 117-131.
[20] Pintado, C.M.B.S.; Ferreira, M.A.S.S.; Sousa, I. (2010) Control of pathogenic and spoilage microorganisms from cheese surface by whey protein films containing malic acid, nisin and Natamycin. Food Control 21, 240-246.
[21] Patel, D., (2011), Matrix effect in a view of lc-ms/ms: an overview. International Journal of Pharma and Bio Sciences.
[22] Roberts, D.P.T.; Scotter, M.J.; Godula, M.; Dickinson, M.; Charlton, A.J. (2011) Development and validation of a rapid method for the determination of Natamycin in wine by high-performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry. Analytical Methods, 3, 937-943.
[23] Weinstein, J. D., Branchaud, R., Beale, S. I., Bement, W. J., and Sinclair, P. R. (1986) Arch Biochem Biophys 245(1), 44-50.
[24] Zhang, L.,Liu, S.,Cui, X.,Pan, C.,Zhang, A.,Chen, F.,(2012)A review of sample
preparation methods for the pesticide residue analysis in foods. Central European
PHỤ LỤC
Nồng độ Natamycin trong các mẫu phân tích
Mẫu Thạch rau câu Sữa chua Măng chua Dƣa muối
1 0,1 KHP 0,9 1,2 2 0,1 KHP 1,4 4,2 3 0,3 KHP 1,9 1,8 4 0,8 KHP 3,2 2,9 5 1 KHP 2,5 2,6 6 1,1 KHP 2,5 1,6 7 1,2 KHP 2,8 1,9 8 0,9 KHP 4 2,2 9 0,8 KHP 4,2 3,2 10 0,6 3,9 3,8 11 0,7 2,9 1,3 12 0,5 4,1 1,5 13 0,9 1,5 1,8 14 0,9 1,7 1,1 15 0,7 2,8 4,6 16 3,9 3,8 17 3 2,9 18 3,1 4,5 19 3,2 4 20 1,2 3,8 21 1,4 3,9 22 1,9 4 23 0,9 4,2 24 4,2 25 3,8 26 2,8 27 1,1 28 1,9 29 2,9 30 4,1 31 2,2
Ảnh hệ thống thiết bị Q Exactive Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap
Hình ảnh các sắc ký đồ RT:0.00 - 5.00SM:15G 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 2.14 2.13 2.14 2.26 1.90 1.88 2.54 1.79 2.66 2.70 1.59 1.51 0.91 3.18 3.17 0.83 1.121.38 3.07 3.543.623.753.88 4.164.424.484.564.61 4.86 0.76 0.10 0.440.46 NL: 1.48E9 TIC MS TV_63 RT:0.00 - 5.00SM:15G 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 2.18 2.21 2.27 2.31 3.92 3.94 1.93 2.61 1.91 2.63 1.73 0.57 0.57 0.55 1.70 2.74 2.91 4.71 3.31 3.32 4.70 4.74 3.26 1.61 4.57 1.51 3.623.83 4.42 0.92 0.78 0.11 0.14 0.49 0.97 1.27 3.07 3.41 4.06 NL: 1.88E9 TIC MS TV_39
RT:0.00 - 5.00SM:15G 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 2.11 2.11 2.10 2.20 0.58 0.59 0.57 1.83 1.81 4.71 1.73 2.60 2.64 4.73 1.53 0.090.11 0.48 0.84 0.85 1.381.52 2.873.073.18 3.503.61 3.653.81 4.29 4.33 4.63 0.40 NL: 2.68E9 TIC MS C_92 RT:0.00 - 5.00SM:15G 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75