PHẦN 3 : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng theo phương pháp DNS
Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp DNS (Trần Vũ Tưởng, 2016)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử dinitrosalicylic acid. Phản ứng xảy ra trong mơi trường kiềm và có gia nhiệt. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalicylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Pha NaOH 4M từ NaOH khan 96%: cân chính xác 16,67g NaOH cho vào bình định mức 100ml, sau đó thêm nước cất đến vạch.
Pha NaOH 10%: Cân chính xác 10g NaOH khan 96% và cho vào bình định mức 100ml, rồi thêm nước cất đến vạch.
Pha dung dịch thuốc thử DNS: cân chính xác 10,6g chất 3,5 acid Dinitro saclicyli, 19,8g NAOH cho vào 1416ml nước cất. Hịa tan hồn tồn các chất trên sau đó thêm 306g Muối K-Na tartrate kép và 7,6ml Phenol (nóng chảy ở 50oC). Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 0,1N với chỉ thị phenolphthalein hết 5 - 6ml là được.
Pha dung dịch HCL 6N: Hút 128ml HCL đặc 35 - 36% cho vào bình định mức 250ml, sau đó thêm nước cất đến vạch.
- Tiến hành
Bước 1:Xây dựng đường chuẩn
Pha glucose chuẩn 1% theo thể tích (10mg/10ml). Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng:
Hóa chất Ống Đ/c Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Glucose
1mg/ml 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
24
Cho vào mỗi ống 3ml dung dịch DNS và 1ml glucose. Sau đó đo mật quang ở bước sóng 540nm với mẫu trắng từ ống đối chứng. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540), trục hoành là nồng độ glucose. Tìm được phương trình đường thẳng y=ax+b
Bước 2: Các định hàm lượng đường tổng số và tinh bột
* Đường tổng
Cân 3g mẫu cho vào các bình tam giác và thêm 50ml nước cất 60-70oC đun cách thủy trong thời gian 30 phút. Dung dịch gồm nước cất và mẫu sau khi đun xong, mang ra ngồi để nguội ở nhiệt độ phịng. Sau đó, đổ tồn bộ lượng dung dịch vừa đun cho vào bình định mức 100ml, và thêm nước cất đến vạch. Ta thu được dịch A Sau đó, hút 10ml dịch A, thêm 2ml HCL 1N và 3,75ml NaOH 10% vào bình tam giác. Sau đó đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong vịng 20 phút. Lên thể tích 50ml bằng bình định mức. Bước 3: Lên màu DNS
Hút 1ml dịch mẫu trong vào các ống nghiệm sạch và thêm 3ml dung dịch DNS đo ở bước sóng OD=540nm
Bước 4: Tính tốn kết quả
Hình 3.2: Đồ thị đường Glucose chuẩn
Từ phương trình đồ thị glucose chuẩn tính được mg/ml đường khử trong dung dịch đường pha lỗng. Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nống độ đường khử (mg/ml) với mật độ quang OD540 ở trên ta tính được hàm lượng đường khử P ở trong mẫu phân tích X. y = 0.4537x + 0.3209 R² = 0.9901 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Mật đ ộ qu ang OD 54 0n m Glucose (mg/100ml)
25
Phương trình đường chuẩn: y = 0.4537x + 0.3209
R² = 0.9901 Trong đó:
y là độ hấp thụ quang dịch glucose tại 540nm x: nồng độ glucose